We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.
Mange mikroorganismer er i stand til å produsere og utskille exopolysaccharides (EPS), som har viktige implikasjoner i medisinske felt, mat programmer eller i utskifting av petro-baserte kjemikalier. Vi beskriver en analytisk plattform som skal automatiseres på et væskebehandlingssystem som gjør det mulig hurtig og pålitelig analyse av typen og mengden av EPS produsert av mikroorganismer. Det gjør det mulig for brukeren å identifisere nye naturlige mikrobielle exopolysaccharide produsentene og å analysere karbohydrat fingeravtrykk av de tilsvarende polymerer i løpet av én dag i high-throughput (HT). Ved hjelp av denne plattformen, kan strekk samlinger samt biblioteker med strekk varianter som kan oppnås i ingeniør tilnærminger bli vist. Plattformen har en moduloppsett, noe som tillater en separasjon av protokollen i to hoveddeler. For det første er det et automatisert system screening, som kombinerer ulike polysakkarid-deteksjonsmoduler: en semi-kvantitativ analyse av viskositetsreduserendey formasjon via et sentrifugeringstrinn, en analyse av polymerdannelse via alkohol utfelling og bestemmelse av det totale karbohydratinnhold via et fenol-svovelsyre-transformasjon. Her er det mulig å skjerme opptil 384 stammer per løp. Den andre delen gir en detaljert monosakkarid analyse for alle de valgte EPS produsentene som er identifisert i den første del ved å kombinere to vesentlige moduler: analyse av den fullstendige monomerblanding via ultra-høy ytelse væskekromatografi kombinert med ultrafiolett og elektrospray ionisering ionefelle deteksjon ( UHPLC-UV-ESI-MS) og bestemmelse av pyruvat som en polymer substituent (tilstedeværelse av pyruvat ketal) via enzymatisk oksydasjon som er koplet til en fargedannelse. Alle de analytiske moduler av denne screening plattformen kan kombineres på forskjellige måter og tilpasses individuelle behov. I tillegg kan de alle håndteres manuelt eller utført med et væskehåndteringssystem. Dermed screening plaTForm muliggjør en stor fleksibilitet for å identifisere ulike EPS.
Mikrobielle exopolysaccharides (EPS) er et strukturelt svært mangfoldig gruppe av polymerer som oppfyller ulike biologiske funksjoner. De vanligvis er bygget av sammensatte repeterende enheter, som utmerker seg ved forskjellige typer av monomerer (sukker, sukkerderivater, sukkersyrer), båndene mellom disse monomerene og deres erstatninger. Det strukturelle mangfoldet av mikrobielle polysakkarider overfører ganske forskjellige egenskaper til medlemmene av dette molekylet klassen, noe som gjør at deres søknad på ulike felt som mat en, kosmetikk 2,3, konstruksjon kjemi fire eller vannbehandling fem. For ytterligere å utvide anvendelsesområdet for disse biobaserte og slike bærekraftige polymerer identifisering av nye naturlige mikrobielle polysakkarider samt prosjektering av strukturelle varianter representerer lovende tilnærminger. Uansett, er en rask screening metode som kreves for å raskt skanne et stort antall mikrobielle stammer for their polysakkarid formasjon, og å analysere sine produkter. Vi har derfor nylig utviklet en 96-brønns HT-screening plattform for analyse av mikrobielle polysakkarid produksjon fra naturlige isolater eller modifiserte strekk-varianter som inkluderer identifikasjon av den monomere sammensetningen 6.
Bruk av denne plattformen for en første screeningrunde på ~ 500 naturlige isolater mulig for oss å identifisere bare 10 til 20% av de isolerte stammene som å være i stand til å produsere EPS (data ikke vist). Dette betyr at 80-90% av de analyserte stammene ikke produsere EPS under betingelser som er brukt, og derfor en ytterligere analyse av den detaljerte karbohydrat fingeravtrykket var ikke nødvendig. Ettersom dette meget avansert identifikasjon av den monomere sammensetningen er en tidkrevende prosess, særlig for dataanalyse, til en hurtig pre-screening-metoden identifisere stammer som positive i EPS produksjon, vil drastisk øke effektiviteten. Videre reagenser,forbruksvarer og tidsmåling på UHPLC-UV-ESI-MS ville bli redusert. I tillegg er de forskjellige analytiske modulene, mens på den ene side gjør fremgangsmåten meget pålitelig og er på den annen side kompliserer manuell håndtering av mer enn to 96-brønners plater i parallell, og som sådan begrenser det fulle potensialet av fremgangsmåten. Av disse grunner, bestemte vi oss for å utvikle en automatisert screening plattform. Derfor, i kombinasjon vi den modulære formatet på eksisterende karbohydrat fingeravtrykket teknikk med en helautomatisk hurtig påvisning fremgangsmåte av den totale sukkerinnhold, basert på absorbans måling.
Den fenol-svovelsyre metode representerer fortsatt metoden for valg for rask bestemmelse av total karbohydrat innhold av bakterier og plante polysakkarider 7,8. Denne metoden ble først beskrevet av Dubois et al. 9 og tilrettelagt for ulike programmer og utvalgsstørrelser, selv for liten skala i 96-brønners plater 10,11. den phenol-svovelsyre-metoden måler det totale karbohydratinnhold av en verdi, summating alle monomere, oligomere og polymere karbohydrater av prøvene.
Å ta disse forhold i betraktning, er valget av et egnet dyrkingsmedium viktig å anvende denne metoden. Komplekse medier som inneholder oligomere eller polymere karbohydrat forbindelser som gjærekstrakt kan føre til en endret polymerinnhold og derfor bør strengt unngås. Videre er store mengder sukker anvendes som C-kilde for dyrking av stammene. Høye nivåer av gjenværende karbohydrater fra dyrking prosessen kan negativt påvirke målingen av EPS-innhold.
Derfor er bruk av definerte og rene sukker anbefales. I våre forsøk har vi brukt glukose for dyrking av cellene. De resterende glukose etter kultivering ble redusert ved hjelp av en gel-filtrering og bestemt ved hjelp av en glukose-assay. Til slutt, glukose tilsvars av polysakkaridene ble beregnet ved å subtrahere den gjenværende glukose etter gelfiltrering fra det totale karbohydratinnhold som var blitt detektert med fenol-svovelsyre-metoden. Gelfiltrering og glukose-assay i kombinasjon med fenol-svovelsyre-metoden sikrer pålitelige resultater og er i stand til å være vårt første, fullstendig automatisert deteksjon system.
To nye analysemoduler ble inkludert i den automatiserte screening plattformen for å øke mengden av informasjon fra EPS-deteksjonssystem: utfellingen og observasjon av en økning i viskositeten.
Mange forskjellige EPS – f.eks suksinoglykan, xanthan og colonic syre 12 – er rapportert å være modifisert med en ikke-karbohydrat pyruvat ketal på sukker stillinger C4 og C6. Disse pyruvat ketaler (på samme måte som succinyl halvestere og uronsyrer) bidrar til den polyanioniske natur, og derfor, til den fysiske properties av polymeren ved å kommunisere via toverdige kationer, broer 13. For å identifisere de bestemte polymerer bestemmelse av pyruvat ble etablert som en annen ytterligere analysemodul. Dette øker informasjon om polysakkarid substituenter og deres potensielle makroskopiske egenskaper.
Ved å kombinere samtlige moduler gjør det mulig å identifisere forskjellige EPS, samt en rask og effektiv fastsetting av EPS-produsenter. Ved at tilnærmingen screening plattformen kan deles inn i to hoveddeler (figur 1). Innenfor automatisert screening (del I) arbeidsflyten skjer helautomatisk (tabell 1) for raskt å forhåndsvelge EPS produserende stammer. Karbohydrat fingeravtrykk-analyse (del II) bestemmer kvantitativt monomersammensetningen av EPS produsert av forut valgte stammer. Derved ble det dataanalyse minimalisert for å optimalisere den screening av store strekk-samlinger. Dettetilbyr muligheten for å analysere 384 spenninger i en enkelt automatisert screening løp og med to løp som er mulig pr dag av 768 stammer per dag. I tillegg gir den karbohydrat fingeravtrykk analyse en enda mer detaljert oversikt over alle de identifiserte EPS. Dette gjør det mulig rettet analyse og identifikasjon av bare litt forskjellige EPS-varianter eller helt nye sammenlignet med de allerede beskrevne kjemiske strukturer av EPS.
Polysakkarid deteksjon med fenol-svovelsyre-metoden: forskjellige monosakkarider vis forskjellig absorpsjonsmaksima og molare ekstinksjonskoeffisienter ved bruk av denne metoden 9. Dette resulterer i forskjellig absorpsjonsmaksima av polymerer, som inneholder flere sukker i forskjellige mengder. De forskjellige bølgelengder av absorpsjonsmaksima for 16 forskjellige kommersielt tilgjengelige polymerer er gitt i tabell 5. Polymerene ble oppløst (1 g / l) i DDH 2 O, omrørt (150 opm) over natten og målt med fenol-svovelsyre-syre-metoden . Diutan tyggegummi viste den laveste absorpsjonsmaksima ved 470 nm og skleroglukan og hyaluronsyre det høyeste på 484 nm. Basert på disse resultatene 480 nm ble valgt for screening plattformen. Den relative absorbans av polymerene ble beregnet ut fra absorbansen oppnådd med 1 g / l glukose (angitt som 100%). De laveste resultater ble oppnådd med skleroglukan og suksinoglykan, begge med 92%. Dette var expected fordi skleroglukan bare inneholder glukose og suksinoglykan inneholder glukose og galaktose i et forhold på 7: 1. Både kommersielle polymerer som har forskjellige tapene av tørking og forskjellige askeinnhold, er dette grunnen til at den teoretiske verdien av ~ 110% ikke ble nådd. Xylan viste den høyeste relative absorbans med 311%. Grunnen til dette er den høye molare ekstinksjonskoeffisient oppnådd fra xylose på grunn av den mer dominerende furanose form. Ved et nivå på 0,1 g / l glukose kvantifisering grensen ble nådd, samt påvisningsgrensen i en konsentrasjon på <0,05 g / l. Imidlertid er deteksjonsgrensen for positive spenninger i screening høyere enn 0,7 g / l, og derfor analysen viste en god ytelse. For å få pålitelige resultater, ble den gjenværende glukose etter gelfiltrering bestemt med et glukose-assay, og denne verdi ble subtrahert fra verdien fra fenol-svovelsyre-metoden.
Automatisert glukose-analysen fortynning: Forestillingenav glukosebestemmelsen etter dyrking (fortynning 1: 100) ble undersøkt. For dette ble 10 ul av supernatanten overført til 990 mL av DDH 2 O i en dyp brønn plate og blandes via ti ganger suger og dispensering 180 ul av denne fortynningen. Den andre kritiske trinnet var den korrekte pipettering av bare 5 ul alikvot for 1:10 fortynning fra glukose-assay etter gelfiltrering. For å generere den fortynning 25 ul av DDH 2 O ble overført til en 50 mL-tuppen først ble etterpå 20 pl av DDH 2 O og 5 pl gel-filtrat suges sammen. Dette sikrer en bedre fjerning av 5 ul delmengde ut av spissen. Begge fortynningstrinn ble verifisert med forskjellige glukose standarder via en glukose-assay. Resultatene for to eksempelvise konsentrasjoner er gitt i tabell 6. 1: 100 fortynning for bestemmelse av glukoseinnholdet etter kultivering viste høy presisjon for begge standarder med en CV & #60; 1,2%. På samme tid, er nøyaktigheten for den høyere standard var opp til 11,6 (% feil). Dette er imidlertid ubetydelig som glukosebestemmelsen bare representerer den gjenværende glukoseinnholdet etter dyrking og derfor er ikke viktig for polymeren deteksjon. Den 1:10 fortynning av den gjenværende glukose etter gelfiltrering viste svært pålitelige resultater med en CV <1,4% og en nøyaktighet <2,1% feil.
Vurdering av fordampning: The screening krever 3,5 time fra første trinn til den første glukose-analysen. For å finne ut, om denne tidsrammen har en innflytelse på uncapped MTP lagring, ble 50 ul av glukose-analysen kalibreringsstandarder lagret med og uten deksel i 3,5 timer i robot karusellen. I kalibreringsområdet (45 til 4,5 mg / L) neppe øket prøvekonsentrasjon. En økning – forårsaket av fordampning – var under 2,1% og bare for de to laveste konsentrasjoner (1,8 og 0,9 mg / L) den nådde opp til 12,4% ( <strong> Tabell 7).
Gelfiltrering: Høye mengder av ikke-metabolisert glukose forstyrre den kvantitative påvisning av glukose fra den hydrolyserte polymer. Derfor ble en gel-filtreringstrinn som kreves for å fjerne gjenværende glukose etter dyrking. Dessuten renser gelfiltrering polymeren inneholdende supernatant fra salter og monomere karbohydratforbindelser, andre enn glukose, for å minimalisere den analytiske bakgrunn i monomeren analysen. Ved gel-filtreringstrinnet 35 ul av filtratet ble plassert i sentrum av brønnen. For validering av robustheten gel-filtrering i automatisert system, ble åtte kalibreringsstandarder fra 0.045 og opp til 9 g / l glukose filtrert (n = 8). Glukose av hver konsentrasjon ble alltid redusert med mer enn 95% av den opprinnelige verdien (tabell 8). Ved å gjøre dette, viste gelfiltrering meget gode resultater for forskjellige konsentrasjoner av glukose. I tillegg er de gjenværende glukose etter gel-filtration ble også bestemt med en glukose-analyse og trekkes fra fenol-svovelsyre-bestemmelse for å motta den korrekte mengden av glukose tilsvarende for den hydrolyserte polymer.
Pyruvat-analyse: For det første ble det undersøkt hvorvidt det nøytralisert og fortynnet (1:10) TFA-matrise fra hydrolysetrinnet forstyrrer den enzymatiske reaksjon. Derfor ble fullstendig assay utført to ganger, en gang med og en gang uten matrise og viste pålitelige resultater. Til slutt, pyruvat innhold av 16 kommersielt tilgjengelige polymerer som ble vellykket målt og er vist i figur 3. Det er generelt kjent at av disse 16 polymerer bare suksinoglykan og xanthan naturlig inneholder pyruvat. Med vår pyruvat-assay begge disse polymerer ble korrekt identifisert. I skleroglukan ble welangummi og xylan pyruvat også påvist i betydelige mengder. Overall, evnen til tilnærmingen ble validert og pyruvat-analysen showed en høy ytelse. Det viste seg å være i stand til å detektere pyruvat i forskjellige polymerer som etter hydrolyse.
Karbohydrat fingeravtrykk: Etter å ha utført alle analytiske moduler i automatisert screening, ble potensielle EPS produsenter valgt for karbohydrat fingeravtrykk analyse. For dette ble flere kriterier anvendt: 1) Positiv observasjon av viskositeten etter sentrifugering og / eller etter filtrering. 2) Utfelling før og etter filtreringen. Observerte fibre og flak ble vurdert som positive. 3) glukose tilsvarende verdi fra fenol-svovelsyre-metoden. Verdier> 700 mg / L ble vurdert som positive og verdier mellom 300 og 700 mg / L ble vurdert som mulige EPS produsenter. Når to eller tre kriterier ble vurdert som positive, ble stammene valgt for ytterligere karbohydrat fingeravtrykk analyse. Kriteriene kan tilpasses til den enkelte formål EPS screening (f.eks lav viskositet EPS). Vår tilnærming som tar sikte på å finne efficient EPS produsenter. Ved søk for stammer som bare danner små mengder av EPS evalueringen grense av glukosen tilsvarende bør reduseres.
Teknisk nytte og fremtidige applikasjoner: Et interessant trekk ved denne protokollen er den modulære karakter av trinnene og de ulike analytiske moduler. De kan kombineres på forskjellige måter, justert til individuelle behov og nye moduler kan lett implementeres. Videre kan analysemoduler brukes separat, for eksempel hydrolyse modul i kombinasjon med HT-PMP-derivatisering modul er i stand til å utføre en monomer komposisjon analyse fra forskjellige polymeroppløsninger (1 g / l) i 96-brønners format. For laboratorier uten å ha tilgang til et flytende håndteringssystem fullstendig screening kan håndteres manuelt uten noen endringer i pipettering ordningen. Men ved hjelp av en flytende håndteringssystem øker gjennomstrømningen til opp til 768 stammer (i stedet for 192 stammer hvis screened manuelt) per dag. Protokollen som er beskrevet her er i stand til en screening for ulike slekter og derfor for screening av store belastningsskader samlinger for å identifisere nye EPS produsenter og analysere deres karbohydrat fingeravtrykk i en tilnærming (figur 4). Videre kan en målrettet screening for polysakkarider inneholdende sjeldne sukkere som fukose, uronsyrer eller enda ukjente sukkere utføres via den detaljerte monosakkarid analyse. Dessuten kan forskjellige sukkerkombinasjoner i definerte forhold mellom bli detektert. Dette muliggjør enkel identifisering av strukturelt beslektede varianter av allerede kjente EPS eller nye EPS.
The authors have nothing to disclose.
We sincerely thank Thomas Howe and Jörg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.
96 well deep well plate 2.0 mL (DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990µl of ddH2O |
Breathable Sealing Film | Axygen | BF-400-S | Incubation film for pre- and main-culture DWP |
Aluminum Sealing Film | Axygen | PCR-AS-200 | -80 °C storage film for glycerol-stock plates |
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl | TECAN | 30038619 | Worktable position (WTP 2-1 to 2-4) |
A/B glass-filter-plate 1µm | Pall Corporation | PN 8031 | Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Greiner Bio-One | 651201 | Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well SpinColumn G-25 | Harvard Apparatus | 74-5612 | Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Nunc | 249944 | Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4) |
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips | TECAN | 30038609 | Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6) |
Trough 250 ml | Axygen | Res-SW96-HP | Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7) |
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) | Greiner Bio-One | 655101 | precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2) |
96-well silicon cap mat | Whatmann | 7704-0105 | Cover mat for MTP |
200 µl pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | For manually handling |
1000 µl pipette tips | Sarstedt | 70.762 | For manually handling |
96-well-PCR micro titer plate | Brand | 781350 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat | Brand | 781405 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
Filter plate 0.2 µm Supor, | Pall Corporation | PN 8019 | Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate |
Pipette Tips LHS 5-300 µl | Brand | 732150 | Brand LHS system |
ABTS (2.2-azino‑bis-(3‑ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid) | Sigma-Aldrich | A1888 | Glucose-assay |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | Glucose-assay |
Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Glucose-assay, pyruvat-assay |
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | Pyruvat-assay |
Pyruvate oxidase | Sigma-Aldrich | P4591 | Pyruvat-assay |
Potassium phosphate dibasic | Carl-Roth | P749.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Potassium phosphate monobasic | Carl-Roth | 3904.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Pyruvat-assay |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 31413 | Pyruvat-assay |
2-Propanol | VWR | 20922.466 | Precipitation |
Phenol | VWR | 20599.231 | Phenol-sulfuric-acid method |
Sulfuric acid | Carl-Roth | 4623.4 | Phenol-sulfuric-acid method |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | Hydrolysis |
Ammonium solution | Carl-Roth | P093.1 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Phenol red | Alfa Aesar | B21710 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP-derivatization |
Methanol LC-MS | VWR | 83638.320 | PMP-derivatization |
Acetonitril LC-MS | VWR | 83040.320 | PMP-derivatization |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP-derivatization, |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | PMP-derivatization |
Methyl red | Alfa Aesar | 36667 | pH-value |
Robotic liquid handling system | Tecan | Freedom EVO | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid handling station LHS | Brand | 709400 | Worktable setup in Figure 2 |
Tip-Adapter | Brand | 709434 | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid Ends MC 20-300µL | Brand | 709416 | Worktable setup in Figure 2 |
Adapter 60mm | Brand | 709430 | Worktable setup in Figure 2 |