Introduction
Desde su desarrollo a mediados de la década de 1990 el modelo de ratón transgénico SOD1-G93A ha sido el modelo animal más utilizado de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) 1. Este modelo de ratón transgénico fue modificado genéticamente para sobreexpresar una forma mutante del gen de la superóxido dismutasa Cu / Zn humana 1 (SOD1) que alberga la glicina asociado-ALS a la mutación de alanina en el aminoácido 93 (G93A). La mutación G93A es una de muchas mutaciones en el gen SOD1 que colectivamente maquillaje aproximadamente un quinto de los casos de ELA familiar 2.
El modelo de SOD1-G93A se ha convertido en un caballo de batalla de la investigación para el desarrollo de drogas ALS porque además de su vínculo genético obvio para la ELA, que recapitula muchas de las características patológicas de la ELA en los seres humanos, como la pérdida de las neuronas motoras, debilidad muscular progresiva y atrofia, con eventual parálisis y muerte 3. Aunque, como es a menudo el caso con modelos de animales transgénicos, hay una bi inherenteological la variabilidad asociada con los ratones SOD1 G93A-. Scott et al. han determinado que son necesarios cohortes de al menos 24 ratones basura emparejados con equilibrio de género en el diseño de los estudios fármaco-eficacia para superar el ruido creado por la variabilidad biológica 4. El gran número de animales necesarios en estos estudios en combinación con el avance de la enfermedad agresiva y la necesidad de un seguimiento diario prohíbe el uso de técnicas elaboradas, que consumen mucho tiempo y potencialmente estresantes para medir la fuerza y la función neuromuscular (por ejemplo, la electromiografía, la fuerza de prensión, rotorod , etc.). En su lugar, se destaca la necesidad de un instrumento de cribado en vivo que evalúa de forma fiable la función neuromuscular de los ratones SOD1-G93A de una manera rápida.
En ALS TDI se desarrolló un protocolo que permite la evaluación fiable de la función neuromuscular de los ratones SOD1 G93A-en menos de 30 seg por ratón en promedio. Este encompa protocoloSSES evaluación diaria de la función de las extremidades posteriores utilizando un sistema simple neurológica puntuación (NeuroScore) que se describe en este informe en la prensa y en vídeo. NeuroScore se centra en la función de las extremidades posteriores debido a déficits miembros posteriores son los primeros informó signo neurológico de la enfermedad en ratones SOD1-G93A 5,6. Además, el protocolo desarrollado por ALS TDI proporciona una evaluación imparcial de inicio de la paresia (parálisis ligera o parcial), la progresión y la gravedad de la parálisis y es lo suficientemente sensible para identificar los cambios inducidos por fármacos en progresión de la enfermedad.
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Protocol
Todos los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos descritos por los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales y fueron aprobadas por el cuidado de animales institucional y el empleo de ALS TDI (IACUC).
1. Los animales, Vivienda y Diseño del estudio
Nota: La colonia de ratones SOD1-G93A se deriva de la alta copia B6SJLTgN (SOD1G93A) cepa 1Gur producido originalmente por Gurney et al 7.. La colonia se mantiene actualmente por cruzar transgénicos machos C57BL / 6-SJL con el tipo salvaje C57BL / 6 hembras F1-SJL. Los animales F1 se generan mediante el cruce de machos con hembras SJL B6. Los ratones son enviadas a ALS TDI semanal en 35-45 días de edad.
- Permita que los ratones por lo menos una semana para aclimatarse a la instalación para animales (12 horas de luz / oscuridad ciclo a una temperatura de 18-23 ° C y 40-60% de humedad) antes de asignar a un estudio.
- Casa SOD1-G93A masculina mice un ratón por jaula, ya que el grupo ocupa los hombres tienden a luchar. Casa ratones hembra SOD1-G93A hasta dos por jaula. Proporcionar enriquecimiento ambiental, en la forma de chozas de plástico. Proporcionar alimentos y agua a voluntad, a menos que los ratones son parte de un estudio que requiere la administración de fármacos en el agua potable / alimentos. En estos casos, la ración y registro de alimentos y agua.
- Comienza un estudio fármaco-eficacia alrededor del día 50 años de edad e incluyen 64 ratones equilibrio de género basura emparejados (32 por cohorte). Por último, asegúrese de que los investigadores que realizan los estudios están cegados a las condiciones experimentales.
Nota: Se recomienda que un estudio típico de drogas-eficacia comienza en día 50 años de edad, sin embargo en base al tipo de intervención terapéutica podría ser preferible para iniciar el estudio anterior o posterior.
Nota: Un estudio con 32 ratones por cohorte está diseñado para detectar drogas efectos específicos de género. Si no se requieren comparaciones específicas de género, 24 ratones por cohorte debería ser suficiente para detectar drogas-efectos globales.
2. Peso Corporal
- Pesos corporales de registro para todos los ratones en los estudios diarios con una precisión de una décima parte de un gramo. Nota: El peso corporal es un indicador sensible de la progresión de la enfermedad y de cualquier malestar que pudiera derivarse de un tratamiento crónico de drogas.
- Pesos corporales mouse varían considerablemente durante el transcurso de un día, siendo mayor en las mañanas, por lo que registran alrededor de la misma hora todos los días.
3. Sistema de Puntuación Neurológica (NeuroScore)
- Evaluar resultados neurológicos (NS) para cada ratón diaria al observar el ratón bajo las tres condiciones siguientes realizan secuencialmente: a) el ratón se suspende por la cola, b) se permite que el ratón para caminar, y después de la aparición de la parálisis c) el ratón se coloca en su lado.
- Para el ensayo de suspensión por la cola, mantenga el ratón aproximadamente 1,5 "de la base de la cola sobre la parte superior de alambre de su jaula hogar durante 1-2 seg, lejos de la cuenca alimentos, mientras que observing las extremidades posteriores. Repita la prueba de suspensión de 3 veces y registrar el resultado más consistente.
- Para la prueba de marcha, coloque el ratón sobre una superficie limpia que proporciona algo de tracción y una distancia de 25 cm (por ejemplo., Una toalla de papel pegado abajo para evitar el deslizamiento). Deje que el ratón para caminar un total de 75 cm (3 veces la longitud de la toalla de papel), mientras que la observación de su marcha.
- Para la prueba de "reflejo de enderezamiento", coloque el puntero del ratón sobre su lado izquierdo o derecho y el uso de un cronómetro medir el tiempo que tarda en derecho en sí mismo sin ayuda de ambos lados. Sólo se requiere un ensayo de esta prueba: Nota.
- Determinar el NS de cada miembro posterior (izquierda o derecha) de forma independiente en una escala de 0 a 4. Nota: Por ejemplo, una puntuación de 0, 1 indica que el miembro posterior izquierdo NS es 0, mientras que el miembro posterior derecho NS es 1.
- Asignar puntuaciones neurológicas (0-4) corresponden a la siguiente serie de observaciones (resumen proporcionados en la Tabla 1):
- Asignar NS 0 (pre-sintomática) si se observa lo siguiente: Cuando el ratón se suspende por la cola, el miembro posterior presenta un ensanchamiento normal, es decir, que quede totalmente extendido fuera de la línea media lateral y se mantiene en esta posición durante 2 segundos o más tiempo. Cuando se permite que el ratón para caminar, se observa la marcha normal.
- Asignar NS 1 (Primeros síntomas) si se observa lo siguiente: Cuando el ratón se suspende por la cola, el miembro posterior presenta un ensanchamiento anormal, es decir, se derrumbó o parcialmente se derrumbó hacia la línea media lateral o tiembla durante la suspensión de la cola o se retrae / abrochado. Cuando se permite que el ratón para caminar, se observa la marcha normal o ligeramente lento.
- Asignar NS 2 (El inicio de la parálisis) si se observa lo siguiente: Cuando el ratón se suspende por la cola, el miembro posterior es parcial o completamente colapsado, que no se extiende mucho. (Hay que aún puede haber movimiento de la articulación). Cuando se permite que el ratón para caminar, el miembro posterior se utiliza para mot hacia adelanteion Sin embargo los dedos se doblen hacia abajo al menos dos veces durante una 90 cm caminar o cualquier parte del pie está arrastrando a lo largo de fondo de la jaula / mesa. Cuando el ratón se coloca en su lado izquierdo y derecho, es capaz de enderezarse en 10 s de ambos lados.
- Asignar NS 3 (parálisis) si se observa lo siguiente: Cuando el ratón se suspende por la cola, hay una parálisis rígida en el miembro posterior o movimiento de la articulación mínima. Cuando se permite que el ratón para caminar hay movimiento hacia adelante sin embargo, el miembro posterior NO está siendo utilizado para el movimiento hacia adelante. Cuando el ratón se coloca en su lado izquierdo y derecho, es capaz de enderezarse en 10 s de ambos lados. Nota: En raras ocasiones, después del inicio de la parálisis, la humedad de la orina puede aparecer en las extremidades posteriores. Izquierda humedad orina no tratada puede dar lugar a la orina "quemadura" y lesiones en la piel. Tratar a la humedad de la orina por el recorte del pelo, aplicar agua caliente empapa para eliminar la orina, y secar suavemente seco. Si las lesiones cutáneas están presentes aplicar antibioungüento tic.
- Asignar NS 4 (Protectora de Animales de punto final) si se observa lo siguiente: Cuando el ratón se suspende por la cola, hay una parálisis rígida en las extremidades posteriores. Cuando se permite que el ratón para caminar, no hay movimiento hacia adelante. Cuando el ratón se coloca en su lado izquierdo y derecho que no es capaz de enderezarse en 10 s de un lado SEA. Es decir, la ausencia del reflejo de enderezamiento.
4. Entrada de datos y análisis
- Durante el curso de un estudio de la eficacia del fármaco, introduzca los datos recogidos para cada ratón en un Sistema de Gestión de Información de Laboratorio (LIMS) o en una hoja de cálculo de software disponible comercialmente.
Nota: El software LIMS desarrollada TDI ELA es un repositorio central para todos los datos recogidos en estudios internos, por lo que estos datos de fácil acceso a través del tiempo para los investigadores ALS TDI. LIMS rastrea cualquier ratón individual, con su identificador único, de vuelta a su linaje, el peso corporal o la puntuación neurológica en todas las jornadas de estudio,e incluye cualquier otra observación observadas durante su vida útil. LIMS en última instancia genera una hoja de cálculo que se utiliza para los análisis posteriores. - Tras la realización de un estudio de medicamentos de eficacia, es decir, cuando todos los ratones alcanzan el punto final humano, software de uso de hojas de cálculo (véase la Tabla de Materiales) para calcular el NS combinado para cada ratón, para cada día promediando la extremidad posterior izquierda y derecha NS . A continuación, calcular la edad mediana en cada NS para cada ratón y el número de días cada ratón pasa a un NS particular.
- Analizar los cambios globales en NS a través del tiempo mediante la importación de los datos desde el software de hoja de cálculo para el software estadístico (véase la Tabla de Materiales). Coloque estos datos mediante un modelo de regresión logística ordinal que estima el NS esperado, con mediana de edad al NS y tratamiento de drogas como los efectos en la regresión. Utilizando la prueba de chi cuadrado de log-rank estimar la probabilidad de efecto probabilidad y determinar si el efecto del tratamiento de drogas en NS progresión es estadísticamente significativa (véase el Archivo Código Suplementario para obtener instrucciones paso a paso).
Nota: Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Nota: Este método de análisis estadístico respeta la naturaleza ordinal de los datos NS y la naturaleza variable de las trayectorias NS para ratones individuales. Se prefiere debido a trayectorias individuales NS pueden ser marcadamente diferente que resulta en NS promedios de grupos de tiempo asociada a que no son suficientemente reflectante de respuestas NS. Además, en algunos casos NS pueden fluctuar, especialmente cuando en el rango de cero a uno. - Por último, el software de uso de gráficos (ver la Tabla de Materiales) para generar "ordinal esperado NS vs Mediana Edad en NS" gráficos para los animales tratados con el fármaco y de control (Figura 2; véase Código Suplementario de archivos para obtener instrucciones paso a paso). Utilice estos gráficos para estimar convenientemente cambios entre los grupos tratados con el fármaco y de control mediante la interpolación del eje y la edad media de inicio de la enfermedad (i.e., NS 2) en el eje x.
Nota: La diferencia en la edad mediana entre los dos grupos representa un cambio inducido por fármacos y se trata como una medida práctica de la magnitud del efecto.
Nota: se desplaza hacia la derecha en el NS frente a la curva mediana de edad esperada indican frenado la progresión de la enfermedad sintomática. Por el contrario, los cambios hacia la izquierda en el NS frente a la curva mediana de edad esperada indican aceleran la progresión de la enfermedad sintomática.
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Representative Results
Los datos de la puntuación neurológica de 90 hombres y 94 no tratados ratones SOD1-G93A femenina estudiaron en ALS TDI fueron evaluados durante 2014. Los resultados muestran que los ratones machos tienen típicamente una progresión de la enfermedad más agresiva que los ratones hembra, como se evidencia por una mayor proporción de su vida útil en NS 1 en comparación con las mujeres. NS NS 2 y 3 se producen con prácticamente la misma frecuencia a través de géneros. NS 0 fue excluido del análisis porque se considera un fenotipo "normal". NS 4 también fue excluido porque, por definición, sólo puede ocurrir una vez en la vida de un ratón SOD1-G93A (Cuadro 2 y Gráfico 1).
NS datos se presenta a partir de un estudio de farmacología progresión de la enfermedad ALS eficacia de la prueba TDI173 compuesto en ratones SOD1 G93A-(n = 16 por género / tratamiento; 64 ratones total). En la Figura 2, se presenta la tasa de progresión de la enfermedad neurológica como se recoge en el análisis de regresión ordinal de datos captured utilizando el protocolo detallado en el presente documento NeuroScore. TDI173 ratones tratados se compararon con el control tratado con vehículo. No se observaron diferencias estadísticamente significativas cuando se analizaron por separado los géneros, pero se alcanzó significación estadística cuando se fusionaron los géneros. El análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia, a pesar de que muestran tendencias similares como el análisis estadístico logística ordinal, no era lo suficientemente sensible como para revelar diferencias significativas incluso cuando sexos se fusionaron (Figura 3).
| NS 1 | El miembro posterior presenta un ensanchamiento anormal, es decir, se derrumbó o parcialmente se derrumbó hacia la línea media lateral o tiembla durante la suspensión de la cola o se retrae / entrelazadas. | Normal o ligeramente más lenta la marcha. | N / A |
| NS 2 | La extremidad posterior está parcial o completamente colapsado, que no se extiende mucho. No podría stenfermo ser movimiento de la articulación. | El miembro posterior se utiliza para el movimiento hacia adelante, sin embargo los dedos de los pies se curvan hacia abajo al menos dos veces durante un paseo de 75 cm o cualquier parte del pie se arrastra a lo largo de fondo de la jaula / mesa. | El ratón es capaz de enderezarse en 10 s de ambos lados. |
| NS 3 | Parálisis rígida en el miembro posterior o movimiento de la articulación mínima. | El movimiento hacia adelante sin embargo, el miembro posterior NO está siendo utilizado para el movimiento hacia adelante. | El ratón es capaz de enderezarse en 10 s de ambos lados. |
| NS 4 | Parálisis rígida en los miembros posteriores. | Sin movimiento hacia adelante. | El ratón no es capaz de enderezarse en 10 s de un lado SEA. |
Tabla 1: Resumen de las observaciones fenotípicas que se utilizan para asignar puntuaciones neurológicas.
| Frecuencia de NS1 | Frecuencia de NS2 | Frecuencia de NS3 | ||||
| Masculino | Mujer | Masculino | Mujer | Masculino | Mujer | |
| Número de ratones | 90 | 94 | 90 | 94 | 90 | 94 |
| Mínimo | 12 | 5 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 25% | 29 | 16 | 4 | 4 | 0 | 0 |
| La mediana | 37 | 27.5 | 5 | 5 | 1 | 1 |
| 75% | 44 | 37.5 | 7.5 | sesenta y cinco | 2.5 | 3 |
| Máxima | 61 | 60 | 28 | 11 | 8 | 9 |
Tabla 2: Un análisis de frecuencia de los datos de NS de los ratones no tratados SOD1 G93A-anotados todos los días de edad 50 días hasta la muerte. Se calcularon las distribuciones para NS 1, 2, y 3.
Figura 1. Representación gráfica del número de días pasados en cada NeuroScore anormal para cada ratón de la población de sin tratar ratones SOD1-G93A en nuestra colonia en 2014 (masculino n = 90, hembra n = 94). Las frecuencias de punto para el mismo los ratones se representan para cada posible NS. NS 4 fue omitido debido a que el evento sólo puede ocurrir una vez en la vida de cada ratón por definición. Por favor haga clic aquí para ver una versio más grande n de esta figura.
Figura 2 Un típico ordinal logística gráfico análisis estadístico comparando progresión de la enfermedad neurológica de los ratones TDI173 tratadas (línea roja) a emparejaron ratones de control tratados con vehículo de basura.. (Línea azul; Reportado p-valores representan log-rank test de chi cuadrado) Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 3 Un análisis típico gráfico de Kaplan-Meier comparando vida de los ratones tratados con TDI173 (línea roja) a emparejaron ratones de control tratados con vehículo de basura (línea azul; p-valores reportados representan log-rank test).jove.com/files/ftp_upload/53257/53257fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este informe, se describe un protocolo de vídeo rápida y simple que, si se aplica correctamente, es capaz de evaluar de forma fiable la progresión de la enfermedad en ratones SOD1-G93A y la identificación de los cambios inducidos por las drogas. Mientras que diferentes grupos han desarrollado sistemas de puntuación fenotípicas de ratones SOD1-G93A 8-10, que a menudo no proporcionan suficientes detalles sobre el procedimiento y no son adecuados para la replicación. Como resultado, los sistemas de puntuación se usan muy poco fuera del grupo específico que los desarrolla. En este informe, la combinación de un manuscrito detallada con vídeo minimiza ambigüedades de puntuación y la variabilidad inter-experimentador, permitiendo así que para el protocolo a ser adoptado por otros laboratorios y que permiten comparaciones entre los estudios que se realizan en diferentes entornos.
El sistema de puntuación neurológica se describe en este informe, denominado NeuroScore, genera datos ordinales donde los valores numéricos exactos atribuidos a los conjuntos de signos y symptoms no tienen significado más allá de establecer la gravedad de la enfermedad clasificado. En este caso, NS 0 es el estado de la enfermedad menos severa y significa un ratón con la función normal de las extremidades posteriores, mientras que NS 4 es el estado de enfermedad más grave con los ratones en o acercarse a la morbilidad secundaria a enfermedad neuromuscular. A pesar de que el sistema de puntuación hace uso de umbrales sintomáticos, cada valor ordinal NS abarca un amplio espectro de posibles presentaciones clínicas muchos de los cuales fueron capturados en video e incluidos en este informe.
NS 1 abarca el espectro de los primeros síntomas de la enfermedad en ratones SOD1-G93A, que pueden variar ampliamente de ratón a ratón. Algunos ratones presentan un ensanchamiento anormal de las extremidades posteriores colapso hacia la línea media, mientras que otros muestran temblores miembros posteriores y algunos incluso muestran retracción miembro posterior o juntando. Por otra parte, en las primeras etapas de la enfermedad de las NS de algunos ratones pueden fluctuar durante varios días entre NS 1 y 0. Invariablemente, sin embargo, en SOD1 G93A-ratones la frecuenciade NS 1 aumenta con el tiempo y que incluye más y más de los diferentes fenotipos descritos. En promedio, los ratones macho y hembra SOD1-G93A suelen pasar 37 y 28 días, respectivamente, en esta etapa.
NS 2 representa el inicio de la paresia (parálisis ligera o parcial) y proporciona evidencia innegable para la presencia de la patología. Si bien no es raro que un ratón de tipo salvaje a veces presentes como NS 1, NS 2 sólo se produce en ratones SOD1 G93A-. De manera similar a NS 1, 2 NS captura un espectro de signos y síntomas. En una presentación etapa temprana de NS 2 el ratón es ambulatorio y enérgico. Una presentación más avanzada del NS 2 revela un ratón con una capacidad muy limitada para moverse. Paresia avanzada en los miembros posteriores puede impedir que a los ratones de llegar a la comida y el agua en la parte superior de la jaula, por lo bolitas de comida deben ser colocados en la parte inferior de la jaula o el alimento hidratado deben ser proporcionados. Además, los tubos sipper más largas deben colocarse en las botellas de agua. SOD1 G93A-ratones typically pasar 5 días en esta etapa.
NS 3 significa la parálisis de las extremidades posteriores completa, y por todas las cuentas es el fenotipo más fácil de identificar y puntuación. Los síntomas de parálisis abarcados por NS 3 puede ser flácida o espástica, pero suelen ser espástica. En este punto, los ratones son muy enfermo y deben ser vigilados con frecuencia. En promedio, los ratones SOD1-G93A pasan de 1 a 2 días en este escenario.
NS 4 denota la ausencia de "reflejo de enderezamiento" que no dependen exclusivamente en función de las extremidades posteriores como NS 0-3 sino que refleja todo el bienestar del cuerpo del ratón. La capacidad de un ratón para demostrar un "reflejo de enderezamiento" normal requiere motivación, energía, sino también la función de múltiples grupos musculares, incluyendo extremidades posteriores, miembros anteriores, y el abdomen. Es importante señalar que progresión de la enfermedad en estos ratones no es a menudo simétrica y un ratón que se puede completar con éxito el reflejo de enderezamiento cuando se coloca en un lado may ser incapaz de hacerlo cuando se coloca en el otro lado. Por ello es importante, para el tratamiento humanitario de los animales y de la integridad del estudio, para realizar pruebas en ambos lados y la eutanasia el ratón si no logra enderezarse a cada lado.
NS 4 define la fecha de la eutanasia y por defecto se alinea directamente con los datos de supervivencia. Sin embargo, la progresión global de la enfermedad, tal como se define mediante análisis de regresión ordinal de NS, puede que no se solapan completamente con las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y datos de peso corporal. Ciertas intervenciones terapéuticas pueden influir en la aparición de enfermedades o síntomas, pero no para afectar la vida útil total.
Si bien no se discuten en profundidad en este informe, el peso corporal puede ser otra medida que puede utilizarse en combinación para NS para evaluar inicio de la enfermedad y la progresión en SOD1-G93A sin embargo, puede ser sesgada por las diferencias en las dietas y por la terapéutica que causan edema o influencia metabolismo de la grasa 11,12.
13 y no extremidad posterior déficits motores, un fenotipo que no es capturado por NeuroScore. Otra limitación de este protocolo es el hecho de que fue diseñado y se aplica sólo a la alta copia ratones SOD1-G93A. En nuestra experiencia, la presentación clínica de la enfermedad en otros modelos de ratón de la ELA, como el bajo número de copias SOD1-G93A ratón 14 o el ratón TDP-43 15,16, es diferente que en los ratones SOD1-G93A elevado de copias y este sistema NS podría ser poco adecuados para esos modelos. Por lo tanto, es importante para determinar el número de copias del transgén de los ratones antes de asignarlos a los estudios y verificar que es igual a la de los ratones de control positivo alto número de copias. En cualquier caso, los beneficios de nosotrosing este sistema de puntuación neurológica superan sus limitaciones y este protocolo de vídeo puede servir como una excelente herramienta de entrenamiento para los investigadores de ALS.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 002726 | Strain of mice used in this study |
| Breeders | Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA | Colony maintainance | |
| Scale | Navigator OHAUS, Parsippany, NJ | Model N14120 | Used to weigh mice |
| Nutra-GelH | Bio-Serv, Flemington, NJ | #S4798 | Wet food provided to sick mice |
| Irradiated Lab Animal Diet | Harlan, Indianapolis, IN | 2918-111914M | Chow diet |
| Lab-grade Sani-chips | Harlan Teklad, Indianapolis, IN | 7090 | Bedding |
| JMPH | SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC | v10.0.2 | Statistical software |
| Microsoft Excel | Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA | Excel 2013 (v 15.0) | Spreadsheet software |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad software Inc., La Jolla, CA | v5.4 | Graphing software |
| Mouse Huts | Bio-Serv, Flemington, NJ | K3272 | For environmental enrichment |
References
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