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Bioengineering

प्रोटीन को टारगेट कर छोटे अणु दवा स्क्रीनिंग के लिए एक तेजी से और मात्रात्मक fluorimetric विधि

doi: 10.3791/53261 Published: October 16, 2015

Abstract

हम Au एनसीएस द्वारा उत्सर्जित अंतर प्रतिदीप्ति संकेत के आधार पर दवा भरी हुई प्रोटीन के भीतर फ्लोरोसेंट सोने nanoclusters (एयू NCS), के गठन से एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए छोटे दवा अणुओं के बंधन आत्मीयता का निर्धारण करने के लिए एक नई दवा स्क्रीनिंग विधि का प्रदर्शन। इस तरह के मानव सीरम albumin (एचएसए) और गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के रूप में एल्बुमिन प्रोटीन मॉडल प्रोटीन के रूप में चुने गए हैं। चार छोटे आणविक दवाओं एल्बुमिन प्रोटीन के लिए अलग बंधन समानताएं के (जैसे, इबुप्रोफेन, warfarin, फ़िनाइटोइन, और sulfanilamide) का परीक्षण कर रहे हैं। यह denaturing शर्तों (यानी, 60 डिग्री सेल्सियस या यूरिया की उपस्थिति में) के तहत दवा भरी हुई एल्बुमिन प्रोटीन अंदर फ्लोरोसेंट Au एनसीएस के गठन की दर (दवाओं के बिना) प्राचीन प्रोटीन में है कि गठन की तुलना में धीमी है कि पाया गया था। इसके अलावा, के रूप में गठित एनसीएस के फ्लोरोसेंट तीव्रता व्युत्क्रमानुपाती एल्बुमिन प्रोटीन के लिए इन दवाओं के बंधन समानताएं के लिए सहसंबद्ध हो पाया है। विशेष रूप से,Au एनसीएस गठन की दर धीमी, दवा प्रोटीन बाध्यकारी आत्मीयता अधिक है, और इस प्रकार परिणामी Au एनसीएस की एक निचली प्रतिदीप्ति तीव्रता मनाया जाता है। परिणामी Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता इसलिए परीक्षण किया विभिन्न दवाओं के रिश्तेदार बाध्यकारी शक्ति का एक सरल उपाय प्रदान करता है। इस विधि को भी बस एक निश्चित प्रोटीन एकाग्रता में प्रोटीन में पहले से लोड दवा सामग्री को अलग से विशिष्ट दवा प्रोटीन बाध्यकारी लगातार (कश्मीर डी) को मापने के लिए बढ़ाई है। मापा परिणामों अन्य प्रतिष्ठा लेकिन और अधिक जटिल तरीकों का उपयोग कर प्राप्त मूल्यों के साथ अच्छी तरह से मेल खाते हैं।

Introduction

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इस तरह के मानव सीरम albumin (एचएसए) और गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के रूप में सीरम albumins प्लाज्मा में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन होते हैं और रक्त डिब्बे के आसमाटिक दबाव बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे भी ऐसे स्टेरॉयड के रूप में कम पानी घुलनशीलता के छोटे अणुओं, फैटी एसिड, थायराइड हार्मोन, और दवाओं की एक विस्तृत विविधता के लिए वाहक प्रोटीन के रूप में पहचाने जाते हैं। बाइंडिंग गुण albumins सीरम इन अणुओं के (जैसे, संबंध या ताकत बंधन, बाध्यकारी साइटों) फार्माकोकाइनेटिक्स में एक महत्वपूर्ण विषय रूपों। 1-4 कई विश्लेषणात्मक तरीकों जैसे, albumins सीरम विभिन्न दवाओं के बंधन गुणों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, 5,6 परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), 7-11 और सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर), 12,13 आदि हालांकि, इन तरीकों एक कठिन और समय लेने वाली प्रक्रिया का विश्लेषण (या तो द्वारा विवश कर रहे हैं जैसे, एक्स-रे crystallo के लिए एकल क्रिस्टल का विकासग्राफिक अध्ययन), विशिष्ट और महंगे उपकरण की आवश्यकता (एसपीआर), या पता लगाने के लिए महंगा आइसोटोप लेबलिंग (एनएमआर) की जरूरत होती है। यह एक तेज, सीधे आगे है, और लागत प्रभावी ढंग से छोटे आणविक दवा स्क्रीनिंग के लिए वैकल्पिक तरीकों को विकसित करने के लिए इसलिए अति आवश्यक है।

सोने nanoclusters (एयू NCS), के कारण उनके असतत और आकार पर निर्भर इलेक्ट्रॉनिक संरचना, 18 के लिए वे व्यापक अनुसंधान के हितों को आकर्षित किया है 2 एनएम। 14-17 की तुलना में छोटे आकार के साथ धातु परमाणुओं के दसियों के लिए कई होते हैं जो nanomaterial की एक विशेष प्रकार हैं 20-23 ऐसी अनूठी सामग्री गुण, विशेष रूप से मजबूत प्रतिदीप्ति, इस तरह के जैविक प्रणालियों में संवेदन और इमेजिंग। 24-32 ultrasmall फ्लोरोसेंट Au NCS कार्यात्मक प्रोटीन का उपयोग संश्लेषित किया जा सकता के रूप में विविध आवेदन मिल गया है। 19 और आणविक-तरह अवशोषण और उत्सर्जन, ऐसे टेम्पलेट के रूप में सीरम albumins, के रूप में। 33 के एक विशिष्ट प्रोटीन templated संश्लेषण में Au एनसीएस, Au लवण की एक निश्चित राशि पहले प्रोटीन अंदर समझाया और बाद में प्रोटीन से ही कम हो रहे हैं। प्रोटीन को कम करने की क्षमता क्षारीय समाधान पीएच में वृद्धि से सक्रिय किया जा सकता है कि कार्यात्मक अमीनो एसिड के अवशेष (जैसे, टाइरोसीन) संविधान को जिम्मेदार ठहराया है। प्रोटीन संरचना का खुलासा Au एनसीएस के गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में माना जाता है। एक सामने आया प्रोटीन में है, और अधिक कम करने के कार्य समूहों समझाया Au लवण से अवगत कराया जा सकता है क्योंकि यह है। प्रोटीन denaturing एजेंटों को गर्मी उपचार या जोखिम से प्राप्त किया जा सकता खुलासा। छोटे आणविक दवाओं का परिचय भी मध्यबिंदु विकृतीकरण तापमान और खुलासा के तापीय धारिता संशोधित यानी खुलासा प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। 34,35 इन सभी कारकों के प्रभाव, बारी में फ्लोरोसेंट Au एनसीएस के गठन कैनेटीक्स से परिलक्षित किया जा सकता है और में प्रकट परिणामी Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता। 36

e_content "> यह वीडियो एक उच्च तापमान (60 डिग्री सेल्सियस) पर दवा भरी हुई एल्बुमिन प्रोटीन में एयू एनसीएस synthesizing द्वारा या denaturing एजेंट (जैसे, यूरिया) परिणामी Au एनसीएस की। प्रतिदीप्ति तीव्रता की उपस्थिति में दवा स्क्रीनिंग की विधि दर्शाता संकेत readout है। सबसे पहले, Au एनसीएस Au एनसीएस। दूसरा के गठन कैनेटीक्स को प्रभावित करता है प्रोटीन (गर्मी उपचार या denaturants से प्रेरित) खुलासा कैसे दिखाने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर या यूरिया की उपस्थिति में इलाज एचएसए और बीएसए टेम्पलेट्स में संश्लेषित कर रहे हैं, Au एनसीएस विभिन्न दवाओं के साथ पहले से लोड प्रोटीन टेम्पलेट्स में संश्लेषित कर रहे हैं, और उसके एवज में एयू एनसीएस के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता पर दवा लोडिंग प्रभाव रिश्तेदार बाध्यकारी शक्ति के उपाय प्रदान करते हैं, जो अध्ययन किया है। अंत में, Au नेकां दवा स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के लिए संशोधित किया गया है एक निश्चित एकाग्रता के प्रोटीन में पहले से लोड दवा सामग्री को अलग से दवा प्रोटीन बाध्यकारी लगातार (कश्मीर डी) के मात्रात्मक माप।

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Protocol

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सावधानी: उपयोग करने से पहले इसमें शामिल सभी रसायनों की सुरक्षा डाटा शीट (एसडीएस) से परामर्श करें। दवा स्क्रीनिंग प्रयोग उनके थोक समकक्ष की तुलना में अतिरिक्त खतरा हो सकता है जो nanomaterials के संश्लेषण और हैंडलिंग, शामिल है। कृपया सुनिश्चित करें कि सभी आवश्यक नियंत्रण उपायों इंजीनियरिंग नियंत्रण (धूआं हुड) और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई, जैसे, सुरक्षा लंबाई पैंट, बंद पैर के जूते, रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने, और सुरक्षा चश्मे) के उपयोग सहित, प्रयोग भर में अभ्यास किया जाना है।

दवा स्क्रीनिंग के लिए रसायन का 1. तैयारी

  1. Au एनसीएस संश्लेषण के लिए व्यापारियों
    1. सोना (तृतीय) क्लोराइड समाधान के 15 मिमी तैयार करने के लिए ultrapure पानी की 6.9 मिलीलीटर में सोने (तृतीय) क्लोराइड समाधान (99.99% धातुओं का पता लगाने आधार, पतला एचसीएल में 30 गुम्मट।%) के 30 मिलीग्राम भंग। सावधानी: सोने क्लोराइड समाधान संक्षारक और अड़चन है। आंख और त्वचा के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए उचित पीपीई पहनें।
    2. डिultrapure पानी के 1 मिलीलीटर में एचएसए या बीएसए की ssolve 74 मिलीग्राम 74 मिलीग्राम / प्रोटीन स्टॉक समाधान के मिलीलीटर तैयार करने के लिए।
  2. दवा समाधान
    1. वांछित दवा की मात्रा, जैसे, (क) इबुप्रोफेन के लिए 1.9 मिलीग्राम, (ख) warfarin के लिए 2.8 मिलीग्राम, (ग) फ़िनाइटोइन के लिए 2.3 मिलीग्राम, और 450 मिमी तैयार करने के लिए DMSO के 20 μl में (घ) sulfanilamide के लिए 1.5 मिलीग्राम भंग दवा स्टॉक समाधान की।
      नोट: इन दवाओं हाइड्रोफोबिक कर रहे हैं और पानी में गरीब घुलनशीलता है क्योंकि DMSO विलायक के रूप में चयन किया गया है।
  3. अन्य अभिकर्मकों
    1. NaOH समाधान के 1.5 एम तैयार करने के लिए ultrapure पानी की 10 मिलीलीटर में NaOH के छर्रों के 600 मिलीग्राम भंग। यूरिया समाधान के 20 एम तैयार करने के लिए ultrapure पानी के 2 मिलीलीटर में यूरिया की 2.4 ग्राम भंग।

प्रोटीन टेम्प्लेट Au एनसीएस 2. संश्लेषण

  1. एचएसए-templated Au एनसीएस (एचएसए-Au NCS)
    1. दो अलग-अलग तापमान चलाया हुआ चुंबकीय हलचल पर दो कांच की शीशियों, उस में एक सूक्ष्म चुंबकीय हलचल पट्टी जिसमें प्रत्येक रखेंrers।
    2. 60 डिग्री सेल्सियस के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक का तापमान सेट, और "60 डिग्री सेल्सियस के रूप में" यह की चोटी पर कांच की शीशी लेबल; अन्य चुंबकीय उत्तेजक यह की चोटी पर कांच की शीशी "आरटी" के रूप में चिह्नित किया जाता है, जहां कमरे के तापमान (आरटी) में रखा जाता है।
    3. प्रोटीन टेम्पलेट के अंदर Au आयनों के encapsulation अनुमति देने के लिए एचएसए समाधान के 200 μl, ultrapure पानी के 200 μl, और (जब तक अन्यथा निर्दिष्ट 360 आरपीएम के रूप में सेट) लगातार सरगर्मी के तहत प्रत्येक शीशी सोना (तृतीय) क्लोराइड समाधान के 200 μl जोड़ें।
    4. Au एनसीएस के गठन में एचएसए के कम करने की क्षमता को सक्रिय करने और 0 मिनट के रूप में प्रतिक्रिया समय रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करने के लिए इतनी के रूप में 2 मिनट के बाद, प्रत्येक शीशी NaOH के समाधान के 20 μl जोड़ें।
    5. हर 20 मिनट, 384 अच्छी तरह से काले रंग की थाली के लिए नमूना से प्रत्येक से समाधान के 50 μl आकर्षित और एक microplate पाठक के साथ उत्सर्जन स्पेक्ट्रम उपाय। ठेठ स्कैनिंग स्थापना: - 850 एनएम λ पूर्व = 370 एनएम, λ उन्हें 410 =।
    6. 100 मिनट के बाद चुंबकीय उत्तेजक बंद करो।
    7. एक सिंक में पानी चलाने के अंतर्गत कांच की शीशियों शांत हो जाओ। सावधानी: कांच की शीशियों गर्म कर रहे हैं। जलने से बचने के लिए गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने पहनें।
    8. प्रत्येक नमूना अलग तापमान की स्थिति पर Au एनसीएस के गठन कैनेटीक्स का अधिग्रहण करने के लिए सभी समय पर photoemission स्पेक्ट्रा प्लॉट।
  2. बीएसए templated Au एनसीएस (बीएसए Au NCS)
    1. एक चुंबकीय उत्तेजक के शीर्ष पर एक माइक्रो चुंबकीय हलचल बार युक्त एक कांच की शीशी में रखें। कमरे के तापमान के रूप में तापमान छोड़ दें।
    2. बीएसए समाधान के 200 μl, यूरिया के 200 μl, और निरंतर क्रियाशीलता के तहत कांच की शीशी में सोने (तृतीय) क्लोराइड समाधान के 200 μl मिलाएं।
    3. 2 मिनट बाद, Au एनसीएस फार्म के लिए बीएसए को कम करने की क्षमता को सक्रिय करने और 0 मिनट के रूप में प्रतिक्रिया समय रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करने के लिए NaOH के समाधान के 20 μl जोड़ें। प्रति घंटा प्रतिक्रिया मिश्रण की photoemission स्पेक्ट्रम उपाय।
      नोट: बीएसए Au एनसीएस के photoemission स्पेक्ट्रम मापा जाता है,कम बार बीएसए Au एनसीएस के गठन दर की वजह से यूरिया की कम प्रभाव के लिए एक ही तापमान पर एचएसए-Au की तुलना में धीमी है क्योंकि प्रोटीन प्रकट करने के लिए।
    4. 7 घंटे के बाद चुंबकीय उत्तेजक बंद करो। यूरिया विकृतीकरण से Au एनसीएस के गठन कैनेटीक्स देखने के लिए सभी समय पर photoemission स्पेक्ट्रा प्लॉट।

3. छोटे आणविक दवा स्क्रीनिंग

  1. एचएसए के लिए विभिन्न छोटे आणविक दवाओं की स्क्रीन रिश्तेदार बंधन आत्मीयता
    1. पांच कांच की शीशियों, एक तापमान चलाया हुआ बहु चुंबकीय उत्तेजक के शीर्ष पर यह एक चुंबकीय हलचल पट्टी, जिसमें प्रत्येक रखें। ए, बी, सी के रूप में इन शीशियों लेबल और प्रत्येक दवा, अर्थात् इबुप्रोफेन, warfarin, फ़िनाइटोइन, और sulfanilamide के लिए क्रमशः घ। नियंत्रण के रूप में शुद्ध एचएसए के साथ एक लेबल।
    2. प्रत्येक शीशी एचएसए के 200 μl जोड़ें। चार इसी शीशियों के लिए दवा समाधान के 1 μl जोड़ें। नियंत्रण करने के लिए DMSO के 1 μl जोड़ें। दोषी पर स्विच और 360 को स्पिन गति सेटआरपीएम और एचएसए के लिए बाध्य दवा को पूरा करने के लिए अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    3. 1 घंटा बाद में, मिल्ली क्यू पानी की 200 μl और निरंतर क्रियाशीलता के तहत प्रत्येक शीशी सोना (तृतीय) क्लोराइड समाधान के 200 μl जोड़ें। 10 मिनट के लिए लगातार सरगर्मी के तहत 60 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर सेट करें। प्रत्येक शीशी 1.5 एम NaOH के 20 μl जोड़ें और 0 मिनट के रूप में प्रतिक्रिया समय रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करते हैं।
    4. जल्दी उत्सर्जन स्पेक्ट्रम (परिणाम 0 मिनट के रूप में लेबल) एक 384 अच्छी तरह से काले रंग की थाली करने के लिए प्रत्येक शीशी से समाधान के 50 μl आकर्षित और उपाय। प्रत्येक नमूना हर 10 मिनट के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड। चार अलग-अलग समय में कम से कम चार स्पेक्ट्रा लीजिए, कि 0, 10, 20, और 30 मिनट है।
    5. एक लगातार प्रवृत्ति के साथ परिणाम प्राप्त करने के लिए 3.1.4 कई बार दोहराएँ - 3.1.1 कदम। चुंबकीय उत्तेजक बंद करो।
    6. (- डी, और नियंत्रण क) प्रत्येक नमूने के लिए समय हल photoemission स्पेक्ट्रा प्लॉट। Di में एयू एनसीएस के गठन कैनेटीक्स तुलना करने के लिए समय के खिलाफ सभी नमूनों और साजिश के शिखर तीव्रता को पहचानेंfferent दवा भरी हुई प्रोटीन टेम्पलेट्स।
  2. एचएसए के लिए एक विशेष दवा के बंधन निरंतर उपाय
    1. 3.1.4 - दोहराएँ 3.1.1 कदम। (केवल दवा लोड के बिना एचएसए का उपयोग कर एक नियंत्रण नमूना भी शामिल है) के चार अलग अलग सांद्रता में इबुप्रोफेन समाधान के साथ दवा समाधान बदलें। तदनुसार दवा एकाग्रता के अनुसार कांच की शीशी लेबल।
    2. 10 मिनट के बाद, एक सिंक में पानी चलाने के अंतर्गत कांच की शीशियों शांत हो जाओ। सावधानी: कांच की शीशियों गर्म कर रहे हैं। जलने से बचने के लिए गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने पहनें।
    3. 384 अच्छी तरह से काले रंग की थाली करने के लिए प्रत्येक शीशी से ऊपर समाधान के 50 μl ड्रा और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम उपाय।
    4. विभिन्न दवा सांद्रता में परिणाम का एक और दो सेट प्राप्त करने के लिए 3.2.3 दो बार अधिक - दोहराएँ 3.2.1 कदम।
    5. चुंबकीय उत्तेजक बंद करो। Photoemission स्पेक्ट्रा साजिश है और परिणामों का विश्लेषण।
      1. प्रत्येक व्यक्ति के बैच में प्राप्त कच्चे डेटा के लिए, प्रत्येक की photoemission स्पेक्ट्रा साजिशसॉफ्टवेयर में नमूना ऐसे OriginPro सॉफ्टवेयर के रूप में और शिखर तीव्रता पता लगाना।
      2. रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना और साजिश [(मैं 0 - मैं) / मैं 0] मैं और मैं क्रमश: दवा भरी हुई एचएसए और शुद्ध एचएसए में गठित Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता का उल्लेख करने के 0 जहां दवा एकाग्रता के खिलाफ।
      3. Michaelis-Menten समीकरण का उपयोग एक ही साइट बाध्यकारी मॉडल के लिए डेटा ढाले से बाध्यकारी निरंतर की गणना: आर अधिकतम अधिकतम प्रतिक्रिया संकेत इंगित करता है जहां सी / (कश्मीर डी + सी), × वाई = आर मैक्स, सी ligand की एकाग्रता है और कश्मीर डी बाध्यकारी स्थिर है। ऐसे OriginPro के रूप में सॉफ्टवेयर में इस प्रदर्शन करना। गैररेखीय वक्र फ़िट फिटिंग मेनू विश्लेषण का चयन करें, तो विकास / sigmoidal श्रेणी से हिल समारोह का चयन करें। सेटिंग: समारोह चयन पेज, सज्जित परिणाम दिखाने के लिए फ़िट क्लिक करें।

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Representative Results

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एक प्रोटीन की अधिक प्रतिक्रियाशील कार्य समूहों (जैसे, टाइरोसीन अवशेषों) समझाया Au आयनों को कम करने और इस प्रकार Au एनसीएस के गठन दर में तेजी लाने को उजागर किया जा सकता है, क्योंकि खुलासा प्रोटीन प्रोटीन templated Au एनसीएस के गठन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। ताप और बाहरी अप्राकृतिकरण एजेंटों प्रोटीन खुलासा प्रक्रिया को बढ़ावा देने के लिए दो आम साधन हैं। 1 एक मॉडल प्रोटीन के रूप में एचएसए का उपयोग कर, Au एनसीएस के गठन कैनेटीक्स पर हीटिंग के प्रभाव और जोड़ने बाहरी अप्राकृतिकरण एजेंटों को दर्शाता है चित्रा। Au एनसीएस के गठन कैनेटीक्स पर हीटिंग का प्रभाव पहले photoluminescence स्पेक्ट्रा के समय के पाठ्यक्रम विकास (चित्रा 1 ए और 1 बी) को मापने के द्वारा जांच की है। प्रतिक्रिया 60 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है जब progressi बढ़ जाती है कि photoemission स्पेक्ट्रा 33,36 के 670 एनएम पर केंद्रित स्पष्ट चोटी से इसकी पुष्टि के रूप में, लाल उत्सर्जक Au एनसीएस तेजी से समय (100 मिनट) की एक छोटी सी अवधि में बनते हैंvely समय के साथ (चित्रा 1 बी) के साथ। एक विपरीत के रूप में, 670 एनएम पर Au एनसीएस का कोई उत्सर्जन चोटियों समय (चित्रा 1 ए) की इसी अवधि में कमरे के तापमान पर किया जाता प्रतिक्रियाओं के लिए मनाया जाता है।

Au एनसीएस के गठन कैनेटीक्स पर बाहरी अप्राकृतिकरण एजेंटों को शुरू करने का प्रभाव भी denaturing एजेंट के रूप में टेम्पलेट और यूरिया के रूप में बीएसए का उपयोग कर जांच की है। चित्रा 1C के रूप में संश्लेषित Au एनसीएस के photoluminescence स्पेक्ट्रा के समय के पाठ्यक्रम विकास से पता चलता। 670 एनएम पर Au एनसीएस के इसी तरह के उत्सर्जन चोटी भी मनाया बीएसए भी बाहरी अप्राकृतिकरण एजेंट की उपस्थिति में फ्लोरोसेंट Au एनसीएस के संश्लेषण के लिए लागू होता है पता चलता है कि जो है। हालांकि, उसके एवज में एयू एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता भी प्रतिक्रिया समय (7 घंटा) की एक लम्बी अवधि के बाद 60 डिग्री सेल्सियस पर गठित तुलना में काफी कम है। ये परिणाम है कि कम से गठित की तुलना में यूरिया की उपस्थिति में एयू एनसीएस के गठन बहुत धीमी है कि सलाह देते हैंप्रोटीन की अक्षमता के कारण 60 डिग्री सेल्सियस कमरे के तापमान पर एक बाहरी अप्राकृतिकरण एजेंट से प्रेरित खुलासा। इसलिए, 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने के लिए एक तेजी से परख समय के विचार के साथ बाद के प्रयोगों में छोटे आणविक दवाओं के लिए स्क्रीन के विकृतीकरण के पसंदीदा साधन के रूप में चयन किया गया है।

चित्रा 2 दवा भरी हुई एचएसए के साथ Au एनसीएस के गठन के कैनेटीक्स के आधार पर दवा स्क्रीनिंग के परिणामों से पता चलता है। चित्रा 2A में दिखाया गया है, शुद्ध एचएसए टेम्पलेट के साथ बनाई Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता sulfanilamide (घ), फ़िनाइटोइन (ग), warfarin (ख के साथ उन लोगों के द्वारा पीछा परख समय (30 मिनट) की पूरी अवधि के दौरान, लगातार सबसे ज्यादा है ), और अलग टेम्पलेट्स में एयू एनसीएस के गठन दर नियंत्रण> डी> सी> b> एक की प्रवृत्ति के बाद पता चलता है कि जो अनुक्रम में इबुप्रोफेन (क),। इसलिए, परख समय कम करने के लिए, 10 मिनट पर सभी परिणामी Au एनसीएस के ही photoemission स्पेक्ट्रा compar हैंएड एचएसए (चित्रा 2 बी) के लिए दवाओं के रिश्तेदार बंधन आत्मीयता का निर्धारण करने के लिए। प्रयोग के कई रन इस प्रवृत्ति (चित्रा -2) की निरंतरता पुष्टि करने के लिए किया गया है। चित्रा -2 (इनसेट) के रूप में दिखाया स्पेक्ट्रम तीव्रता अंतर को आसानी से परिणामी Au एनसीएस के डिजिटल तस्वीरों से देखे जा सकते हैं। पिछले अध्ययनों 36 में निर्धारित रूप में विभिन्न दवा भरी हुई प्रोटीन टेम्पलेट्स की उपस्थिति में परिणामी Au एनसीएस के अंतर प्रतिदीप्ति तीव्रता दवाओं के बाध्यकारी प्रोटीन की स्थिरता में सुधार का सुझाव है कि जो, एचएसए के लिए इन दवाओं के बंधन ताकत के व्युत्क्रमानुपाती होती है Au एनसीएस के गठन के दौरान खुलासा खिलाफ। इसलिए, एचएसए के लिए इन दवाओं के बंधन समानताएं आसानी से दवा भरी हुई एचएसए के साथ के रूप में गठित Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना द्वारा भेदभाव किया जा सकता है।

अंत में, वर्तमान दवा स्क्रीनिंग विधि बाध्यकारी को मापने के लिए लागू किया जाता हैप्रोटीन के लिए एक विशिष्ट दवा की लगातार। ब्रुफेन एचएसए के लिए एक छोटे आणविक दवा के बंधन निरंतर मापने के लिए कैसे पर प्रदर्शित करने के लिए चयन किया जाता है। विभिन्न सांद्रता (0 - 450 मिमी) की ब्रुफेन समाधान। चित्रा 3 Au एनसीएस के संश्लेषण से पहले इबुप्रोफेन-एचएसए टेम्पलेट के रूप में करने एचएसए (74 मिलीग्राम / एमएल, 200 μl) के साथ पूर्व incubated का गठन Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा से पता चलता कर रहे हैं एचएसए टेम्पलेट में प्रतिक्रिया समय के 10 मिनट पर एक ही बैच में विभिन्न सांद्रता की इबुप्रोफेन के साथ पहले से भरी हुई है। यह प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोटीन टेम्पलेट से भरी हुई दवा की बढ़ती मात्रा के साथ कम हो जाती है कि देखा जा सकता है। एचएसए प्रोटीन, के सापेक्ष प्रतिदीप्ति (मैं 0 -मैं) इबुप्रोफेन के बंधन निरंतर निर्धारित करने के लिए / मैं कई अलग अलग बैचों से प्राप्त प्रत्येक Au एनसीएस नमूना 0 मैं 0 शुद्ध में संश्लेषित नेकां के प्रतिदीप्ति तीव्रता है, जहां गणना की जाती है एचएसए और मैं संश्लेषित Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता है इबुप्रोफेन लोड एचएसए में (1 टेबल)। (मैं 0 -मैं) / मैं 0 मूल्यों दवा एकाग्रता (चित्रा 4, बिंदीदार रेखा) के खिलाफ साजिश रची है। डेटा Michaelis-Menten समीकरण का उपयोग एक ही साइट बाध्यकारी मॉडल के लिए आगे फिट है: आर अधिकतम अधिकतम प्रतिक्रिया संकेत इंगित करता है जहां सी / (कश्मीर डी + सी), × वाई = आर मैक्स, सी ligand और कश्मीर डी की एकाग्रता है बाध्यकारी निरंतर (चित्रा 4, ठोस लाइन) है। यह सही भी 0.74 ± 0.1 माइक्रोन की एचएसए को इबुप्रोफेन की एक कश्मीर डी मूल्य देता है। यह मान इस प्रकार आगे अत्याधुनिक उपकरणों का उपयोग किए बिना, सजातीय समाधान में छोटे आणविक दवा के बंधन स्थिरांक को मापने के लिए वर्तमान पद्धति की विश्वसनीयता की पुष्टि एनएमआर तकनीक 37 का उपयोग करके मापा कि (0.5 ± 1.0 माइक्रोन) के बहुत करीब है।

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चित्रा Au एनसीएस के गठन कैनेटीक्स पर अलग अप्राकृतिकरण की स्थिति के 1. प्रभाव। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Au एनसीएस के समय हल photoemission स्पेक्ट्रा 60 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर (ए) एचएसए, (बी) एचएसए में गठन किया है, और (सी) बीएसए के साथ 6.4 एम यूरिया।

चित्र 2
चित्रा 2. दवा भरी हुई प्रोटीन टेम्पलेट्स में गठित Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर दवा स्क्रीनिंग एचएसए-लक्ष्य। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

(ए) (क) इबुप्रोफेन-एचएसए, (ख) वारफ़रिन-एचएसए, (ग) फ़िनाइटोइन एच एस में गठन Au एनसीएस के गठन कैनेटीक्सए, (घ) sulfanilamide-एचएसए, और शुद्ध एचएसए (नियंत्रण)। एचएसए-Au एनसीएस (बी) Photoemission स्पेक्ट्रा विभिन्न दवाओं की उपस्थिति में 60 डिग्री सेल्सियस पर तैयार: (क),-एचएसए ibuprofen (ख) वारफ़रिन-एचएसए, (ग) फ़िनाइटोइन-एचएसए, (घ) sulfanilamide-एचएसए, और शुद्ध एचएसए (नियंत्रण)। (सी) एचएसए-Au एनसीएस के खिलाफ एचएसए-दवा-Au एनसीएस (नियंत्रण) की सामान्यीकृत photoemission तीव्रता। स्पेक्ट्रा और डिजिटल तस्वीरें (सी के इनसेट) दोनों 60 डिग्री सेल्सियस पर NaOH के अलावा के बाद 10 मिनट पर ले जाया गया। 36 रसायन विज्ञान के रॉयल सोसाइटी की अनुमति से Reproduced।

चित्र तीन
एचएसए प्रोटीन पर दवा लोडिंग के 3. एकाग्रता निर्भर अध्ययन चित्रा।

एचएसए में गठित Au एनसीएस के Photoemission स्पेक्ट्रा प्रतिक्रिया समय के 10 मिनट से अधिक एक ही बैच में अलग सांद्रता में इबुप्रोफेन के साथ भरा हुआ है। 36 रसायन विज्ञान के रॉयल सोसाइटी की अनुमति से अनुकूलित।


प्रयोगात्मक डेटा से प्रोटीन दवा बाध्यकारी निरंतर चित्रा 4 निर्धारण।

एचएसए के लिए बाध्य इबुप्रोफेन की कश्मीर डी दवाओं की मात्रा में वृद्धि के साथ 60 डिग्री सेल्सियस पर संश्लेषित एचएसए-इबुप्रोफेन-Au एनसीएस के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर निर्धारित किया गया था। प्रयोगात्मक डेटा Michaelis-Menten समीकरण का उपयोग एक ही साइट बाध्यकारी मॉडल के लिए लगाया गया था: आर अधिकतम अधिकतम प्रतिक्रिया संकेत इंगित करता है जहां सी / (कश्मीर डी + सी), × वाई = आर मैक्स, सी ligand और कश्मीर डी की एकाग्रता है बाध्यकारी निरंतर। 36 रसायन विज्ञान के रॉयल सोसाइटी की अनुमति से reproduced है।

तालिका एक
रिश्तेदार की तालिका 1. गणनाAu एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता विविध सांद्रता की दवा के साथ प्रोटीन टेम्पलेट्स में गठन किया।

रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता - अलग सांद्रता में इबुप्रोफेन के साथ भरी हुई एचएसए में गठित Au एनसीएस के [(मैं 0 आई) / मैं 0, मैं और मैं क्रमश: दवा भरी हुई एचएसए और शुद्ध एचएसए में गठित Au एनसीएस के प्रतिदीप्ति तीव्रता का उल्लेख करने के 0] प्रतिक्रिया समय के 10 से अधिक मिनट। नमूना संख्या XY बैच वें एक्स में तैयार Y वें नमूना को दर्शाता है। 36 रसायन विज्ञान के रॉयल सोसाइटी की अनुमति से अनुकूलित।

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इस विधि में प्रकाश डाला करने की जरूरत है कि कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। , विभिन्न छोटे आणविक दवाओं के रिश्तेदार बंधन आत्मीयता स्क्रीनिंग के प्रोटोकॉल चरणों में 3.1.2, 3.1.3, और 3.1.4 रिश्तेदार बाध्यकारी शक्ति के लिए लगातार प्रवृत्ति दिखा अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन चरणों में, माप के लिए प्रतिक्रिया समाधान रसायन जोड़ने और ड्राइंग की कार्रवाई समय अंतराल के प्रभाव और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए अभ्यास किया जाना चाहिए माप के लिए प्रतिक्रिया समाधान रसायन जोड़ने और ड्राइंग की इसी अनुक्रम को कम करने के रूप में जल्दी संभव के रूप में होना चाहिए। एचएसए के लिए इबुप्रोफेन के बंधन निरंतर मापने के प्रोटोकॉल में, चरण 3.2.4 कश्मीर डी माप की सफलता की दिशा में बहुत महत्वपूर्ण है। अधिक एकाग्रता अंक का चयन किया जा सकता है, को मापने के लिए और अधिक नमूनों की वजह से समय अंतराल के प्रभाव और अधिक गहरा हो जाता है। समय अंतराल के प्रभाव को कम करने के लिए, अलग सांद्रता में संश्लेषण कई विभिन्न में विभाजित किया जा सकता हैसमानांतर में NT बैचों। प्रत्येक बैच में, दवा के बिना एक नियंत्रण स्थिरता सुनिश्चित करने और संभव प्रणाली त्रुटियों को समाप्त करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए।

इस वीडियो में, एचएसए दवा स्क्रीनिंग के लिए फ्लोरोसेंट Au एनसीएस के संश्लेषण के निर्देशन के लिए मॉडल प्रोटीन के रूप में चयन किया गया है। यानी, (क) इबुप्रोफेन (ख) warfarin, (ग) फ़िनाइटोइन, और (घ) sulfanilamide केवल चार अलग अलग दवाओं, यहां परीक्षण कर रहे हैं। तथ्य की बात के रूप में, वर्तमान पद्धति सामान्य है और कई अलग अलग रूपों में संशोधित किया जा सकता है। सैद्धांतिक रूप से, इस विधि, अन्य दवाओं, ऐसे स्टेरॉयड, फैटी एसिड, थायराइड हार्मोन, और नत्थी पेप्टाइड्स के रूप में छोटे अणुओं के लिए लागू इन अणुओं एचएसए करने के लिए बाध्य है और एक अलग हद तक खुलासा खिलाफ प्रोटीन की स्थिरता में सुधार कर सकते हैं प्रदान किया जा सकता है। यहाँ दिखाया गया है, के रूप में इस तरह के एचएसए और बीएसए के रूप में albumins तक ही सीमित नहीं अन्य प्रोटीन, भी जब तक वे फ्लोरोसेंट Au एनसीएस के संश्लेषण को निर्देशित करने में सक्षम हैं के रूप में दवा स्क्रीनिंग के लिए कार्यात्मक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (inclusदवा बाध्यकारी साइटों को प्रभावित किए बिना इस तरह के टाइरोसीन अवशेष के रूप में एयू एनसीएस गठन के लिए सक्रिय कार्य समूह) की Ive। यहाँ तक कि धातु की पसंद लचीला है; ऐसे एजी एनसीएस के रूप में अन्य धातु एनसीएस भी दवा स्क्रीनिंग के लिए प्रतिदीप्ति जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

सारांश में, वर्तमान पद्धति ऐसे प्रोटीन-दवा बातचीत के अध्ययन के लिए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर के रूप में अन्य अधिक परिष्कृत तकनीक की तुलना में प्रभावी सरल, तेज और लागत है। यह कोई आइसोटोप लेबलिंग की आवश्यकता है और समरूप समाधान में बाध्यकारी प्रोटीन-दवा के प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। इस वर्तमान काम में, हम प्रोटीन स्थिरता में सुधार करने के लिए बाध्य दवा के उदाहरण का उपयोग अवधारणा का प्रदर्शन किया है। यह भी भविष्य के अध्ययन के लिए एक दिलचस्प विषय के रूप में बाध्यकारी पर प्रोटीन को अस्थिर है कि दवाओं की छानबीन के लिए वर्तमान पद्धति का विस्तार करने के लिए संभव हो सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (III) chloride solution, 30% Sigma-Aldrich 484385 Corrosive, irritant
Human serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A1887
Bovine Serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A2153
Ibuprofen, 98% Sigma-Aldrich I4883 
warfarin, 98% Sigma-Aldrich A2250
phenytoin Sigma-Aldrich PHR1139
sulphanilamide, 99% Sigma-Aldrich S9251
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
urea Sigma-Aldrich U5128
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Magnetic stirrer IKA RT5
Microplate reader Tecan Infinite M200
384-well plate Corning
5 ml air displacement pipette Eppendorf
1,000 μl air displacement pipette Eppendorf
100 μl air displacement pipette Eppendorf
5,000 μl Eppendorf tips
1,000 μl Eppendorf tips
100 μl Eppendorf tips
1.5 ml micro tube Eppendorf
20 ml glass vial with screw cap
4 ml glass vial with screw cap

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References

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प्रोटीन को टारगेट कर छोटे अणु दवा स्क्रीनिंग के लिए एक तेजी से और मात्रात्मक fluorimetric विधि
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Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., Tan, Y. N. A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening. J. Vis. Exp. (104), e53261, doi:10.3791/53261 (2015).More

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., Tan, Y. N. A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening. J. Vis. Exp. (104), e53261, doi:10.3791/53261 (2015).

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