Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

Published: October 16, 2015 doi: 10.3791/53261
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Abstract

אנו מדגימים שיטת הקרנת תרופה חדשה לקביעת הזיקה המחייבת של מולקולות תרופה קטנות לחלבון מטרה על ידי יצירת nanoclusters ניאון זהב (Au NCS) בתוך החלבון טעון התרופה, המבוסס על אותות הקרינה הנפלטים על ידי ההפרש NCS Au. חלבונים כגון אלבומין אלבומין האנושי בסרום (HSA) ואלבומין בסרום השור (BSA) נבחרו כמודל החלבונים. ארבע תרופות מולקולריות קטנות (למשל, איבופרופן, קומדין, פניטואין, וsulfanilamide) של זיקות מחייבות שונות לחלבוני אלבומין נבדקות. נמצא כי השיעור של NCS Au ניאון בתוך חלבון אלבומין תרופה טעון היווצרות תנאי denaturing (כלומר, C 60 ° או בנוכחות של אוריאה) הוא איטי יותר מזה שנוצר בחלבון הטהור (ללא תרופות). יתר על כן, עוצמת הניאון של NCS בנוי כפי שנמצאה בקורלציה הפוכה לזיקות מחייבות של תרופות אלה לחלבוני אלבומין. במיוחד,גבוה יותר זיקה לתרופות חלבון מחייבת, איטי קצב היווצרות Au NCS, ובכך עוצמת הקרינה נמוכה של Au NCS התוצאה הוא ציין. עוצמת הקרינה של NCS Au התוצאה לכן מספקת מדד פשוט של הכוח המחייב היחסי של תרופות שונות שנבדקו. שיטה זו היא גם להארכה למדוד קבוע סמים חלבון מחייב הספציפי (K D) פשוט על ידי שינוי תוכן התרופה שנטען מראש בחלבון בריכוז חלבון קבוע. התוצאות שנמדדו להתאים היטב עם הערכים שהתקבלו תוך שימוש בשיטות יוקרה אבל יותר מסובכת אחרות.

Introduction

albumins סרום כגון אלבומין בסרום אדם (HSA) ואלבומין בסרום שור (BSA) הוא החלבון הנפוץ ביותר בפלזמה ולשחק תפקיד חיוני בשמירה על הלחץ האוסמוטי של תא הדם. הם גם מוכרים כחלבונים מובילים למולקולות קטנות של מסיסות במים נמוכה, כגון סטרואידים, חומצות שומן, הורמוני בלוטת התריס, ועוד מגוון רחב של תרופות. הנכס המחייב (לדוגמא, אתרי קישור, מחייב זיקה או כוח) של מולקולות אלה לסרום albumins מהווה נושא חשוב בהפרמקוקינטיקה. 1-4 שיטות אנליטיות כמה פותחו כדי ללמוד את המאפיינים המחייבים של תרופות שונות לסרום albumins, כגון קריסטלוגרפיה רנטגן, 5,6 תהודה מגנטית גרעינית (NMR), 7-11 והתהודה plasmon פני השטח (SPR), 12,13 וכו ' עם זאת, שיטות אלה מוגבלים על ידי שני תהליך ניתוח מייגע וגוזל זמן (למשל, צמיחה של גביש יחיד לcrystallo רנטגןמחקר גרפי), דרישה של ציוד מיוחד ויקר (SPR), או בצורך של תיוג היקר איזוטופ (NMR) לצורך זיהוי. לכן רצוי מאוד לפתח דרכים חלופיות להקרנת סמים מולקולרית קטנה באופן מהיר, ישר קדימה, ועלות-יעילה.

nanoclusters זהב (Au NCS) הוא סוג מיוחד של nanomaterial, שכולל מספר לעשרות אטומי מתכת בגדלים קטנים יותר מ 2 ננומטר. 14-17 הם משכו תחומי מחקר נרחבים בשל המבנה שלהם הבדיד וגודל תלוי האלקטרוני, 18, 19 וכמו-מולקולריים קליטה ופליטה. 20-23 תכונות חומרים ייחודיים כגון, בפרט הקרינה החזקה, מצאו יישומים מגוונים כגון חישה והדמיה במערכות ביולוגיות. 24-32 ניאון ultrasmall Au NCS יכול להיות מסונתז באמצעות חלבונים פונקציונליים, כגון albumins סרום, כתבנית. 33 בסינתזת חלבון-בתבניות אופיינית של NCS Au, כמות מסוימת של מלחי Au כמוסות ראשונה בתוך החלבון ומופחת לאחר מכן על ידי החלבון עצמו. יכולת הפחתה של החלבון מיוחסת למרכיב פונקציונלי שאריות חומצת אמינו (לדוגמא, טירוזין) שיכול להיות מופעלות על ידי הגדלת ה- pH הפתרון לבסיסי. התגלגלות של מבנה חלבון נחשבת כצעד קריטי להיווצרות של NCS Au. סיבה לכך הוא בחלבון מקופל, יכולות להיחשף קבוצות פונקציונליות הפחתה יותר למלחי Au במארז. חלבון התפרשותו יכול להיות מושגת על ידי טיפול בחום או חשיפה לחומרי denaturing. מבוא של תרופות מולקולריות קטנות יכול להשפיע גם על תהליך התגלגלות, כלומר שינוי טמפרטורת denaturation האמצע ואנתלפיה של התגלגלות. 34,35 ההשפעה של כל הגורמים הללו, בתורו יכולים לבוא לידי ביטוי על ידי קינטיקה ההיווצרות של ניאון Au NCS ובא לידי ביטוי ב עוצמת הקרינה של NCS Au תוצאה. 36

e_content "> וידאו זה מדגים את השיטה של הקרנת סמים על ידי סינתזת Au NCS בחלבוני אלבומין טעון תרופה בטמפרטורה גבוהה (60 מעלות צלזיוס) או בנוכחות של סוכני denaturing (למשל, אוריאה). עוצמת הקרינה של תוצאת Au NCS הוא את הודעת האות. ראשית, NCS Au מסונתז בתבניות HSA וBSA טופלו ב 60 ° C או בנוכחות של אוריאה להראות כיצד חלבון התפרשותו (הנגרם על ידי טיפול בחום או denaturants) משפיע על קינטיקה היווצרות Au NCS. שנית, NCS Au מסונתז בתבניות חלבון מראש עם תרופות שונות, והשפעת טעינת סמים בעוצמות הקרינה היחסית של התוצאה Au NCS היא למדה, המספקים מדד לכוח מחייב יחסית. לבסוף, פרוטוקול הקרנת Au NC-התרופה שונה ל מדידת כמותית של מתמיד מחייב תרופה-חלבון (K D) על ידי שינוי תוכן התרופה שנטען מראש בחלבון של ריכוז קבוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

זהירות: יש להתייעץ גיליונות נתוני בטיחות (SDS) של כל הכימיקלים המעורבים לפני השימוש. ניסוי הקרנת סמים כרוך הסינתזה וטיפול של ננו, אשר עשוי להיות לי מפגעים נוספים בהשוואה לעמיתו בתפוצה רחבה שלהם. אנא להבטיח את כל אמצעי הבקרה הדרוש כדי להיות מתורגל לאורך כל הניסוי, כולל השימוש בפקדי הנדסה (מנדף) וציוד מגן אישי (PPE, למשל, מכנסיים באורך בטיחות, נעליים סגורות הבוהן, כפפות עמידות כימיות, ומשקפי בטיחות).

1. הכנת ריאגנטים כימיים עבור הקרנת סמים

  1. מבשרים לסינתזת Au NCS
    1. ממיסים 30 מ"ג של פתרון זהב כלוריד (III) (99.99% בסיס עקבות מתכות, 30 WT.% בHCl לדלל) ב6.9 מיליליטר של מים ultrapure להכין 15 מ"מ של זהב (III) פתרון כלוריד. זהירות: פתרון כלוריד זהב הוא מאכל וגירוי. ללבוש PPE הראוי להימנע ממגע ישיר עם עיניים ועור.
    2. דיssolve 74 מ"ג של HSA או BSA ב 1 מיליליטר של מים ultrapure להכין 74 מ"ג / מיליליטר של פתרון מניות חלבון.
  2. פתרונות תרופות
    1. ממיסים את הכמות הרצויה של תרופה, למשל, 1.9 מ"ג ל( א) איבופרופן, 2.8 מ"ג ל( ב) קומדין, 2.3 מ"ג לפניטואין (ג), ו -1.5 מ"ג לsulfanilamide (ד) ב -20 μl של DMSO להכין 450 מ"מ של פתרונות מניות סמים.
      הערה: DMSO נבחר כממס כי תרופות אלו הן הידרופובי ויש מסיסות עניה במים.
  3. ריאגנטים אחרים
    1. ממיסים 600 מ"ג של כדורי NaOH ב 10 מיליליטר של מים ultrapure להכין 1.5 M של פתרון NaOH. ממיסים 2.4 גרם של אוריאה ב 2 מיליליטר של מים ultrapure להכין 20 M של פתרון אוריאה.

2. סינתזה של חלבון-Templated Au NCS

  1. NCS Au בתבניות-HSA (HSA-Au NCS)
    1. מניחים שני בקבוקוני זכוכית, המכיל בר ומערבבים מגנטי מיקרו בזה, ובמערבבים מגנטיים לשליטה שתי טמפרטורה נפרדתrers.
    2. הגדר את הטמפרטורה של בוחש מגנטי אחד עד 60 מעלות צלזיוס, ולתייג את בקבוקון הזכוכית על גבי זה כ" 60 מעלות צלזיוס "; בעוד הבוחש המגנטי האחר נשמר בטמפרטורת חדר (RT) שבו בקבוקון הזכוכית על גבי זה נקרא בשם "RT".
    3. הוסף 200 μl של פתרון HSA, 200 μl מים ultrapure, ו -200 μl של פתרון זהב כלוריד (III) לכל בקבוקון תחת ערבוב מתמיד (המוגדר כ360 סל"ד אלא אם צוין אחרת) כדי לאפשר אנקפסולציה של יוני Au בתוך תבנית החלבון.
    4. 2 דקות מאוחר יותר, להוסיף 20 μl של פתרון NaOH לכל בקבוקון כדי להפעיל את יכולת הפחתה של HSA ביצירת Au NCS ולהתחיל להקליט את זמן התגובה כ0 דקות.
    5. כל 20 דקות, לצייר 50 μl של פתרונות מכל אחת מהמדגם לצלחת שחורה 384 גם ולמדוד את ספקטרום הפליטה עם קורא microplate. התקנת הסריקה הטיפוסית: λ = 370 ננומטר לשעבר, λ = 410-850 ננומטר.
    6. לעצור את הבוחש המגנטי לאחר 100 דקות.
    7. להתקרר בקבוקוני הזכוכית תחת מים זורמים בכיור. זהירות: בקבוקוני הזכוכית חמים. ללבוש כפפות עמידות בחום כדי למנוע שריפה.
    8. עלילה ספקטרום photoemission בכל הזמן לכל דגימה לרכוש קינטיקה ההיווצרות של NCS Au בתנאי טמפרטורה שונים.
  2. NCS Au בתבניות-BSA (BSA-Au NCS)
    1. הנח בקבוקון זכוכית המכיל בר ומערבבים מגנטי מיקרו על החלק העליון של בוחש מגנטי. השאר את טמפרטורת טמפרטורת חדר.
    2. מערבבים 200 μl של פתרון BSA, 200 μl של אוריאה, ו -200 μl של פתרון זהב כלוריד (III) בבקבוקון הזכוכית תחת ערבוב מתמיד.
    3. 2 דקות מאוחר יותר, להוסיף 20 μl של פתרון NaOH כדי להפעיל את יכולת הפחתה של BSA כדי ליצור Au NCS ולהתחיל להקליט את זמן התגובה כ0 דקות. למדוד את ספקטרום photoemission של תערובת התגובה לשעה.
      הערה: ספקטרום photoemission של BSA-Au NCS נמדדבתדירות נמוכה יותר משום שקצב ההיווצרות של BSA-Au NCS הוא איטי יותר מזה של HSA-Au באותה הטמפרטורה בשל פחות אפקטיבי של אוריאה להתפתח החלבון.
    4. לעצור את הבוחש המגנטי לאחר 7 שעות. עלילה ספקטרום photoemission בכל הזמן כדי לראות את קינטיקה ההיווצרות של NCS Au ידי denaturation אוריאה.

הקרנת 3. קטנות מולקולריות והתרופות

  1. זיקה מחייבת ביחס מסך של תרופות מולקולריות קטנות שונות לHSA
    1. הנח חמש צלוחיות זכוכית, המכיל בר מגנטי ומערבבים בזה, על גבי בוחש מגנטי מרובת טמפרטורה לשליטה. תווית בקבוקונים אלה כ, B, C ו- D בהתאמה לכל תרופה, כלומר איבופרופן, קומדין, פניטואין, וsulfanilamide. תווית אחת עם HSA הטהור כשליטה.
    2. הוסף 200 μl של HSA לכל בקבוקון. הוסף 1 μl של פתרון תרופה לארבעה בקבוקונים מקביל. הוסף 1 μl של DMSO לשליטה. הפעל את הבוחש ולקבוע את מהירות הסיבוב כדי 360סל"ד ו דגירה עבור שעה 1 כדי לאפשר את התרופה מחייבת HSA כדי להשלים.
    3. 1 שעה מאוחר יותר, להוסיף 200 μl מים מילי- Q ו -200 μl של פתרון זהב כלוריד (III) לכל בקבוקון תחת ערבוב מתמיד. הגדר את הטמפרטורה עד 60 מעלות צלזיוס מתחת ערבוב מתמיד במשך 10 דקות. הוסף 20 μl של 1.5 M NaOH לכל בקבוקון ולהתחיל להקליט את זמן התגובה כ0 דקות.
    4. מהירות לצייר 50 μl של פתרון מבקבוקון אחד לצלחת שחורה 384 גם ולמדוד את ספקטרום הפליטה (תוצאות שכותרתו 0 דקות). רשום את ספקטרום הפליטה של ​​כל דגימה כל 10 דקות. לאסוף לפחות ארבעה ספקטרום בארבעה זמן שונה, כי הוא 0, 10, 20, ו -30 דקות.
    5. חזור על שלבים 3.1.1 - 3.1.4 מספר פעמים כדי להשיג תוצאות עם מגמה עקבית. לעצור את הבוחש המגנטי.
    6. עלילה ספקטרום photoemission הזמן לפתור עבור כל דגימה (- ד, ושליטה). זהה את עוצמת השיא של כל הדגימות והמזימה נגד הזמן כדי להשוות קינטיקה ההיווצרות של NCS Au בdiתבניות חלבון fferent טעונות בסמים.
  2. למדוד את הקבוע המחייב של תרופה ספציפית לHSA
    1. חזור על השלבים 3.1.1 - 3.1.4. החלף את פתרון סמים עם פתרונות איבופרופן בארבעה ריכוזים שונים (כולל מדגם שליטה באמצעות HSA רק בלי טעינת סמים). תווית בקבוקון הזכוכית על פי ריכוז התרופה בהתאמה.
    2. 10 דקות מאוחר יותר, לצנן את בקבוקוני הזכוכית תחת מים זורמים בכיור. זהירות: בקבוקוני הזכוכית חמים. ללבוש כפפות עמידות בחום כדי למנוע שריפה.
    3. צייר 50 μl של הפתרונות לעיל מכל בקבוקון לצלחת שחורה 384 גם ולמדוד את ספקטרום הפליטה.
    4. חזור על שלבים 3.2.1 - 3.2.3 פעמיים נוספות כדי להשיג עוד שני סטים של תוצאות בריכוזים תרופה שונות.
    5. לעצור את הבוחש המגנטי. העלילה ספקטרום photoemission ולנתח את התוצאות.
      1. לנתונים הגולמיים המתקבלים בכל אצווה בודדת, להתוות את ספקטרום photoemission של כלמדגם בתוכנה כגון תוכנת OriginPro ולגלות את עוצמת השיא.
      2. לחשב ולתכנן את העצמה היחסית הקרינה [(אני 0 - I) / אני 0] נגד ריכוז התרופה, שבו אני ואני 0 מתייחסים לעוצמת הקרינה של Au NCS נוצרה בטעון הסמים HSA והטהור HSA, בהתאמה.
      3. חישוב מחייב קבוע על ידי התאמת הנתונים למודל אתר אחד מחייב שימוש במשוואת מיכאליס-מנטן: Y = מקסימום R × C / (K D + C), שבו מקסימום R מציין את אות התגובה המרבית, C הוא הריכוז של יגנד וK D הוא קבוע המחייב. לבצע את זה בתוכנה כגון OriginPro. בחר את ניתוח תפריט התאמה קוי עקום Fit, לאחר מכן בחר פונקצית היל מ/ קטגוריה sigmoidal צמיחה. בהגדרות: דף בחירת פונקציה, לחץ על התאמה להראות את התוצאות מצוידים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חלבון התגלגלות הוא הליך חשוב ליצירת NCS Au-בתבניות חלבון כי קבוצות תגובתי יותר פונקציונליות (למשל, שאריות טירוזין) של חלבון יכולות להיות חשופים להפחתת יוני Au במארז ובכך להאיץ את קצב ההיווצרות של Au NCS. סוכני חימום וdenaturing החיצוני הם שני אמצעים נפוצים לקידום תהליך התגלגלות החלבון. איור 1 מדגים את ההשפעה של חימום וסוכני denaturing חיצוני הוספה על קינטיקה ההיווצרות של NCS Au, באמצעות HSA כחלבון מודל. האפקט של חימום על קינטיקה של היווצרות Au NCS נחקר לראשונה על ידי מדידת האבולוציה כמובן הזמן של ספקטרום photoluminescence (איור 1 א ו -1 B). כאשר התגובה מתבצעת על 60 מעלות צלזיוס, NCS Au פולטות אדום נוצרים במהירות בפרק זמן קצר (100 דקות), כפי שאושר על ידי השיא הברור מרוכז ב670 ננומטר של ספקטרום photoemission 33,36 שמגדיל progressively יחד עם זמן (איור 1). כניגוד לכך, אין פסגות פליטה של NCS Au ב670 ננומטר הם נצפו לתגובות בוצעו בטמפרטורת חדר באותו פרק הזמן (איור 1 א).

ההשפעה של החדרת סוכני denaturing חיצוניים על קינטיקה של היווצרות Au NCS גם נחקרה באמצעות BSA כתבנית ואוריאה כסוכן denaturing. תרשים 1C מציג את האבולוציה כמובן הזמן של ספקטרום photoluminescence של NCS Au כ- מסונתז. שיא הפליטה דומה של NCS Au ב670 ננומטר הוא ציין גם, שמצביע על כך שארגון ה- BSA הוא גם ישים לסינתזה של NCS Au ניאון בנוכחות סוכן denaturing החיצוני של. עם זאת, עוצמת הקרינה של התוצאה Au NCS היא נמוכה בהרבה מזה שנוצר על 60 מעלות צלזיוס גם לאחר תקופה ממושכת של זמן תגובה (7 שעות). תוצאות אלו מצביעות על כך שההיווצרות של NCS Au בנוכחות של אוריאה היא הרבה יותר איטית בהשוואה לזה שנוצר ב60 מעלות צלזיוס בשל חוסר היעילות של חלבון התפרשות הנגרמת על ידי סוכן denaturing חיצוני בטמפרטורת חדר. לכן, חימום על 60 מעלות צלזיוס נבחר כאמצעי המועדף של denaturation למסך לתרופות מולקולריות קטנות בניסויים הבאים עם התחשבות בזמן assay מהיר.

איור 2 מציג את התוצאות של בדיקות סמים המבוססים על קינטיקה ההיווצרות של NCS Au עם HSA טעון בסמים. כפי שניתן לראות באיור 2 א, עוצמת הקרינה של Au NCS נוצרה עם תבנית HSA הטהורה היא באופן עקבי הגבוה ביותר לאורך כל תקופת זמן assay (30 דקות), ואחריו אלה עם sulfanilamide (ד), פניטואין (ג), קומדין (ב ), ואיבופרופן (א) ברצף, אשר טוען כי קצב ההיווצרות של Au NCS בתבניות שונות כדלקמן המגמה של> ד> ג> b> שליטה. לכן, כדי לקצר את זמן assay, רק את ספקטרום photoemission של כל NCS Au התוצאה ב 10 דקות הם comparאד כדי לקבוע את הזיקה מחייבת היחסית של תרופות לHSA (איור 2). ריצות מרובות של ניסוי בוצעו כדי לאשר את העקביות של מגמה זו (איור 2 ג). הבדל עוצמת הספקטרום ניתן דמיין בקלות מהתמונות הדיגיטליות של NCS Au התוצאה כפי שמוצג באיור 2C (הבלעה). עוצמות הקרינה ההפרש של NCS Au התוצאה בנוכחות תבניות חלבון טעון סמים שונים היא ביחס הפוך לכוח המחייב של תרופות אלה לHSA כפי שנקבעו במחקרים קודמים 36, אשר טוען כי הכריכה של תרופות לשפר את היציבות של חלבון נגד התגלגלות במהלך ההיווצרות של NCS Au. לכן, זיקות מחייבות של תרופות אלה לHSA יכולות להיות מובחנות בקלות על ידי השוואת עוצמת הקרינה של NCS Au בנוי כעם HSA סמים טעונים.

לבסוף, שיטת הקרנת סמים נוכחית מיושמת למדידה מחייבתקבוע של תרופה ספציפית לחלבון. איבופרופן נבחר כדי להדגים כיצד למדוד קבוע המחייב של תרופה מולקולרית קטנה לHSA. פתרונות איבופרופן של ריכוזים שונים (0 - 450 מ"מ) מודגרת מראש עם HSA (74 מ"ג / מיליליטר, μl 200) כדי ליצור תבנית איבופרופן-HSA לפני הסינתזה של Au NCS איור 3 מציג את ספקטרום הקרינה של NCS Au נוצר. בתבנית HSA טעון מראש עם איבופרופן של ריכוזים שונים בתצווה אחת ב -10 דקות של זמן תגובה. ניתן לראות כי עוצמת הקרינה יורדת עם הכמות הולך והגדלה של סמים נטענות לתבנית החלבון. כדי לקבוע קבוע המחייב של איבופרופן לחלבון HSA, הקרינה היחסית (אני 0 -אני) / אני 0 של כל דגימת Au NCS התקבלה מכמה קבוצות שונות מחושב, שבו אני 0 הוא את עוצמת הקרינה של NC מסונתז בטהור HSA ואני הוא את עוצמת הקרינה של NCS Au מסונתז בHSA איבופרופן-הטעון (טבלת 1). (אני 0 -אני) / אני 0 ערכים הם זממו נגד ריכוז התרופה (איור 4, קו מקווקו). הנתונים הוא מצוידים בהמשך למודל אתר אחד מחייב שימוש במשוואה מיכאליס-מנטן: Y = מקסימום R × C / (K D + C), שבו מקסימום R מציין את אות התגובה המרבית, C הוא הריכוז של יגנד ו- K D הוא קבוע המחייב (איור 4, קו מוצק). ראוי זה נותן ערך K D של איבופרופן לHSA של 0.74 ± 0.1 מיקרומטר. ערך זה הוא קרוב מאוד של( מיקרומטר 0.5 ± 1.0) נמדד באמצעות טכניקת NMR 37 וכך נוספים מאשר את האמינות של שיטה הנוכחית למדידה קבוע המחייב של תרופה מולקולרית קטנה בפתרונות הומוגנית, ללא שימוש בציוד מתוחכם.

3261fig1.jpg "/>
איור 1. השפעה של תנאי denaturing שונים על קינטיקה של היווצרות Au NCS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ספקטרום photoemission נפתרה זמן של Au NCS נוצר בHSA () בטמפרטורת חדר, HSA (ב ') על 60 מעלות צלזיוס, ו- (ג) BSA עם 6.4 M אוריאה.

איור 2
איור 2. HSA מיקוד הקרנת סמים המבוססת על עוצמת הקרינה של NCS Au נוצר בתבניות חלבון טעון סמים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

() קינטיקה כינונה של Au NCS נוצרה ב( א) איבופרופן-HSA, (ב) קומדין-HSA, (ג) פניטואין-HS , (ד) sulfanilamide-HSA, וטהור HSA (שליטה). (ב) ספקטרום photoemission של HSA-Au NCS מוכן ב 60 ° C בנוכחות תרופות שונות: (א) (ב) קומדין-HSA, (ג) פניטואין-HSA, (ד) sulfanilamide-HSA איבופרופן-HSA,, וHSA הטהור (שליטה). עוצמת photoemission מנורמלת של HSA-סמים-Au NCS נגד HSA-Au NCS (שליטה) (ג). ספקטרום ותמונות דיגיטליות (הבלעה של C) שניהם נלקחו בשעת 10 דקות אחרי תוספת של NaOH ב 60 ° C. 36 מיוצרים באישור של האגודה המלכותית לכימיה.

איור 3
איור מחקר תלוי 3. ריכוז של טעינת סמים בחלבון HSA.

ספקטרום photoemission של NCS Au נוצר בHSA עמוס איבופרופן בריכוזים שונים ביצווה אחת מעל 10 דקות של זמן תגובה. 36 מעובד על ידי רשות של האגודה המלכותית לכימיה.

= "Jove_content" FO: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 4
קביעת 4. איור של קבוע מחייב חלבון-סמים מנתוני ניסוי.

K D של איבופרופן מחייב HSA נקבע בהתבסס על עוצמות הקרינה היחסית של HSA-איבופרופן-Au NCS המסונתזת ב 60 ° C עם עלייה בכמות התרופות. נתוני הניסוי היה מצויד למודל אתר אחד מחייב שימוש במשוואה מיכאליס-מנטן: Y = מקסימום R × C / (K D + C), שבו מקסימום R מציין את אות התגובה המרבית, C הוא הריכוז של יגנד ו- K D הוא קבוע המחייב. 36 מיוצר באישור של האגודה המלכותית לכימיה.

טבלת 1
חישוב טבלה 1. יחסיעוצמות הקרינה של Au NCS נוצרו בתבניות חלבון עם תרופה של ריכוזים שונים.

עוצמות הקרינה יחסית [(אני 0 - I) / אני 0, אני ואני 0 מתייחסים לעוצמת הקרינה של Au NCS נוצרה בטעון הסמים HSA והטהור HSA, בהתאמה] של Au NCS נוצר בHSA עמוס איבופרופן בריכוזים שונים מעל 10 דקות של זמן תגובה. XY מספר המדגם מתייחס למדגם ה y הוכן בx ה אצווה. 36 מעובד על ידי רשות של האגודה המלכותית לכימיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם מספר צעדים קריטיים שצריך להיות מודגשים בשיטה זו. בפרוטוקול של הקרנת הזיקה מחייבת היחסית של תרופות מולקולריות קטנות שונות, שלבי 3.1.2, 3.1.3, ו3.1.4 הם קריטיים כדי להשיג תוצאות טובות מראה מגמה עקבית לכוח המחייב ביחס. בשלבים הבאים, הפעולות של הוספת כימיקלים וציור פתרונות תגובה למדידה צריכה להיות מהר ככל האפשר על מנת למזער את השפעת פער זמן ועל אותו רצף של הוספת כימיקלים וציור פתרונות תגובה למדידה צריך להיות מתורגל כדי להבטיח עקביות. בפרוטוקול של מדידה הקבועה המחייב של איבופרופן לHSA, שלב 3.2.4 חשוב מאוד להצלחה של מדידת K D. למרות שניתן לבחור יותר נקודות ריכוז, ההשפעה בפיגור הזמן בשל יותר דגימות למדוד הופכת עמוקה יותר. כדי למזער את השפעת פער הזמן, הסינתזה בריכוזים שונים ניתן להפריד לכמה differeקבוצות NT במקביל. בכל אצווה, שליטה ללא תרופה צריכה להיות כלולה כדי להבטיח את העקביות ולחסל את שגיאות מערכת אפשריות.

בסרטון הזה, HSA נבחר כחלבון המודל לכוון את הסינתזה של NCS Au ניאון להקרנת סמים. רק ארבעה תרופות שונות, כלומר, קומדין (א) איבופרופן (ב), פניטואין (ג), וsulfanilamide (ד) נבדקו כאן. כעניין של עובדה, השיטה הנוכחית היא כללית וניתן לשנות לכמה צורות שונות. באופן תיאורטי, בשיטה זו יכולה להיות מיושמת על תרופות אחרות, מולקולות קטנות כגון סטרואידים, חומצות שומן, הורמוני בלוטת התריס, ופפטידים מהודקים, ובלבד מולקולות אלה יכולים להיקשר לHSA ולשפר את היציבות של חלבון נגד התגלגלות שונה במידה. גם חלבונים אחרים, אינו מוגבלים לalbumins כגון HSA וBSA כפי שמוצג כאן, יכולים לשמש כתבנית הפונקציונלית להקרנת סמים כל עוד הם מסוגלים לכוון את הסינתזה של ניאון Au NCS (inclusאייב של קבוצות פעילים פונקציונליות להיווצרות Au NCS, כגון שאריות טירוזין) מבלי להשפיע על אתרי תרופה מחייבת. גם הבחירה של מתכת גמישה; גם NCS מתכת אחר כגון Ag NCS יכול לשמש כבדיקת הקרינה להקרנת סמים.

לסיכום, שיטה הנוכחית היא פשוטה, מהירה וחסכונית בהשוואה לטכניקות מתוחכמות יותר אחרות כגון קריסטלוגרפיה רנטגן וNMR לחקר אינטראקציות חלבון-סמים. זה לא דורש תיוג איזוטופ ומאפשר זיהוי ניאון ישיר של חלבון-תרופה המחייבת בפתרון הומוגני. בעבודה הנוכחית, יש לנו הפגנו המושג באמצעות דוגמאות של תרופה מחייבת כדי לשפר את יציבות החלבון. זה יכול להיות גם ניתן להאריך את השיטה הנוכחית למסך תרופות שלערער על חלבונים מחייבים כנושא מעניין למחקר עתידי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (III) chloride solution, 30% Sigma-Aldrich 484385 Corrosive, irritant
Human serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A1887
Bovine Serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A2153
Ibuprofen, 98% Sigma-Aldrich I4883 
warfarin, 98% Sigma-Aldrich A2250
phenytoin Sigma-Aldrich PHR1139
sulphanilamide, 99% Sigma-Aldrich S9251
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
urea Sigma-Aldrich U5128
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Magnetic stirrer IKA RT5
Microplate reader Tecan Infinite M200
384-well plate Corning
5 ml air displacement pipette Eppendorf
1,000 μl air displacement pipette Eppendorf
100 μl air displacement pipette Eppendorf
5,000 μl Eppendorf tips
1,000 μl Eppendorf tips
100 μl Eppendorf tips
1.5 ml micro tube Eppendorf
20 ml glass vial with screw cap
4 ml glass vial with screw cap

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
  2. Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
  3. Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
  4. Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
  5. Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
  6. Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
  7. Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
  8. Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
  9. Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
  10. Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
  11. Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
  12. Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
  13. Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
  14. Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
  15. Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
  16. Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
  17. Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
  18. Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
  19. Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
  20. Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
  21. Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
  22. Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
  23. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
  24. Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
  25. Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
  26. Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
  27. Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
  28. Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
  29. Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
  30. Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
  31. Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
  32. Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
  33. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
  34. Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
  35. Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
  36. Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
  37. Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 104 nanoclusters זהב סינתזה אלבומין בסרום האנושי הקרינה הקרנת סמים מחייב קבוע יציבות חלבון התגלגלות
מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., … More

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., Tan, Y. N. A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening. J. Vis. Exp. (104), e53261, doi:10.3791/53261 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter