Abstract
Nós demonstramos um novo método de rastreio de fármacos para a determinação da afinidade de ligação de pequenas moléculas de droga a uma proteína-alvo através da formação de nanopartículas de ouro (Au fluorescentes CN) dentro da proteína carregadas com fármaco, com base no sinal diferencial fluorescência emitida pela UA CN. Proteínas, tais como albumina de soro de albumina humana (HSA) e de albumina de soro bovino (BSA) são seleccionados como as proteínas modelo. Quatro pequenas drogas moleculares (por exemplo, ibuprofeno, a varfarina, fenitoína, e sulfanilamida) de diferentes afinidades de ligação para as proteínas de albumina são testados. Verificou-se que a taxa de formação de Au CNs fluorescentes no interior do fármaco carregado proteína albumina sob condições desnaturantes (por exemplo, 60 ° C ou na presença de ureia) é mais lento do que se formou na proteína primitiva (sem droga). Além disso, a intensidade de fluorescência do SAE-formado como se encontra a ser inversamente correlacionadas com as afinidades de ligação destas drogas para as proteínas de albumina. Particularmente,quanto maior a afinidade da proteína de ligação de drogas, mais lenta é a taxa de formação de Au CNs, e, assim, uma intensidade de fluorescência menor do Au CNs resultante é observado. A intensidade de fluorescência das resultantes Au CNs, por conseguinte, fornece uma medida simples da força de ligação relativa de diferentes fármacos testados. Este método também é extensível para medir a constante de ligação específica à proteína droga (K D) variando simplesmente o conteúdo de medicamento pré-carregado na proteína a uma concentração fixa de proteína. Os resultados medidos correspondem bem com os valores obtidos usando outros métodos de prestígio mas mais complicados.
Introduction
Albuminas do soro tais como albumina do soro humano (HSA) e de albumina de soro bovino (BSA) são a proteína mais abundante no plasma e desempenham um papel fundamental na manutenção da pressão osmótica do compartimento de sangue. Eles também são reconhecidos como proteínas veículo para moléculas pequenas de baixa solubilidade em água, tais como esteróides, ácidos gordos, hormonas da tiróide, e uma vasta variedade de drogas. A propriedade de ligação (por exemplo, locais de ligação, a afinidade de ligação ou a resistência) dessas moléculas de soro de albuminas forma um tópico importante na farmacocinética. 1-4 vários métodos analíticos foram desenvolvidos para estudar as propriedades de ligação de drogas diferentes para as albuminas do soro, tal como cristalografia de raios-X, 5,6 ressonância magnética nuclear (RMN), 7-11 e de ressonância de plasmon de superfície (SPR), 12,13 etc. No entanto, estes métodos estão limitados por qualquer um processo de análise tediosa e consumidora de tempo (por exemplo, crescimento de cristal único para Crystallo de raios-Xestudo gráfico), a exigência de equipamento especializado e caro (SPR), ou em necessidade de marcação isotópica dispendioso (RMN) para a detecção. Por conseguinte, é altamente desejável desenvolver formas alternativas de pequena seleção da droga molecular de uma maneira rápida, simples e direta, e custo-eficiente.
Nanopartículas de ouro (Au NCs) são um tipo especial de nanomaterial, que contêm várias dezenas de átomos de metal com tamanhos inferiores a 2 nm. 14-17 Eles têm atraído interesses de investigação extensas, devido à sua estrutura eletrônica discreta e dependentes de tamanho, 18, 19 e molecular como absorções e emissões. 20-23 Tais propriedades de materiais exclusivos, em particular a forte fluorescência, foram encontradas diversas aplicações, tais como detecção e visualização em sistemas biológicos. 24-32 ultrasmall fluorescente Au NCs pode ser sintetizado usando proteínas funcionais, tais como albuminas do soro, como molde. 33 Numa síntese típica da modelada por proteínas Au CNs, uma certa quantidade de sais de Au são encapsulados no interior da primeira proteína e subsequentemente reduzido pela própria proteína. A capacidade de reduzir a proteína é atribuída a constitutivos funcionais resíduos de aminoácidos (por exemplo, tirosina) que podem ser activados pelo aumento do pH da solução para alcalino. Desdobramento da estrutura da proteína é considerada como um passo crítico para a formação de Au NCs. Isto porque, em uma proteína desdobrada, os grupos funcionais mais redutores podem ser expostas a A UA sais encapsulados. Proteína se desdobrar pode ser alcançada por tratamento com calor ou a exposição a agentes desnaturantes. Introdução de pequenas drogas moleculares também pode afetar o processo de desdobramento, ou seja, modificação da temperatura de desnaturação do ponto médio e a entalpia de desdobramento. 34,35 O efeito de todos esses fatores, por sua vez, pode ser refletido pela cinética de formação de fluorescente Au NCs e manifestado em a intensidade de fluorescência resultantes Au NCs. 36
e_content "> Este vídeo demonstra o método de rastreio de fármacos através da síntese de Au CN de proteínas de albumina carregadas com fármaco a uma temperatura mais elevada (60 ° C) ou na presença de agentes desnaturantes (por exemplo, ureia). A intensidade da fluorescência resultante Au CNs é a leitura do sinal. Em primeiro lugar, Au CNs são sintetizados em moldes HSA e BSA tratadas a 60 ° C ou na presença de ureia para mostrar como a proteína se desdobrar (induzida por tratamento térmico ou desnaturantes) afecta a cinética de formação de Au NCs. Em segundo lugar, Au CNs são sintetizados em moldes de proteína pré-carregadas com drogas diferentes, e o efeito de carga da droga sobre as intensidades de fluorescência relativas dos resultante Au CNs é estudada, que fornece a medida da força de ligação relativa. Finalmente, o protocolo de rastreio Au NC-droga é modificada para medição quantitativa de proteína-droga constante de ligação (K D) variando o conteúdo de medicamento pré-carregado na proteína de uma concentração fixa.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Atenção: Por favor, consultar as fichas de segurança (SDS) de todos os produtos químicos envolvidos antes de usar. A experiência de rastreio de drogas envolve a síntese e manipulação de nanomateriais, que podem ter riscos adicionais em comparação com o seu homólogo grandes quantidades. Por favor, garantir todas as medidas de controlo necessárias para ser praticado durante todo o experimento, incluindo o uso de controles de engenharia (extractor de fumo) e equipamentos de proteção individual (EPI, por exemplo, calças de comprimento de segurança, sapatos fechados, luvas resistentes a produtos químicos, e óculos de segurança).
1. Preparação de reagentes químicos para Rastreio de drogas
- Os precursores para a síntese de Au CNs
- Dissolve-se 30 mg de uma solução de ouro (III), cloreto (99,99% base metais vestigiais, 30 p.% Em ácido clorídrico diluído) em 6,9 ml de água ultrapura para preparar 15 mM de (III) solução de cloreto de ouro. Cuidado: solução de cloreto de ouro é corrosivo e irritante. Utilizar EPI adequado para evitar o contato direto com os olhos ea pele.
- Dissolve 74 mg de HSA ou de BSA em 1 ml de água ultrapura para preparar a 74 mg / ml de solução-mãe de proteínas.
- As soluções de fármaco
- Dissolve-se a quantidade desejada de droga, por exemplo, 1,9 mg de (um) de ibuprofeno, 2,8 mg de (b), a varfarina, 2,3 mg de (c), fenitoína, e 1,5 mg de (d) sulfanilamida em 20 ul de DMSO para preparar a 450 mM das soluções de droga.
Nota: DMSO é seleccionado como solvente porque estas drogas são hidrofóbicos e têm baixa solubilidade em água.
- Dissolve-se a quantidade desejada de droga, por exemplo, 1,9 mg de (um) de ibuprofeno, 2,8 mg de (b), a varfarina, 2,3 mg de (c), fenitoína, e 1,5 mg de (d) sulfanilamida em 20 ul de DMSO para preparar a 450 mM das soluções de droga.
- Outros reagentes
- Dissolve-se 600 mg de pastilhas de NaOH em 10 ml de água ultrapura para preparar a 1,5 M de solução de NaOH. Dissolve-se 2,4 g de ureia em 2 ml de água ultrapura para preparar a 20 M de solução de ureia.
2. Síntese de Templated-Protein Au NCs
- HSA-templated Au NCs (HSA-Au CNs)
- Coloque dois frascos de vidro, cada uma contendo um micro barra magnética nele, em dois de temperatura separado de agitação magnética controlávelRER.
- Ajustar a temperatura de um agitador magnético a 60 ° C, e Rotular o frasco de vidro em cima dele como "60 ° C"; enquanto o outro agitador magnético é mantida à temperatura ambiente (RT), em que o frasco de vidro em cima do que é rotulado como "RT".
- Adicionar 200 ul de solução de HSA, 200 ul de água ultrapura, e 200 ul de solução de ouro (III), cloreto de para cada frasco, sob agitação constante (definida como 360 rpm, a menos que especificado de outro modo) para permitir o encapsulamento de Au iões dentro do modelo de proteína.
- 2 minutos mais tarde, adicionar 20 ul de uma solução de NaOH a cada frasco, de modo a activar a capacidade redutora do conjugado de HSA na formação de Au CNs e começar a gravar o tempo de reacção como 0 min.
- Cada 20 minutos, extrair 50 mL de soluções de cada da amostra para uma placa preta de 384 cavidades e medir o espectro de emissão com um leitor de microplacas. A configuração de varredura típico: λ ex = 370 nm, em = λ 410-850 nm.
- Parar o agitador magnético após 100 min.
- Arrefecer os frascos de vidro com água corrente em uma pia. Atenção: Os frascos de vidro estiverem quentes. Usar luvas resistentes ao calor para evitar a queima.
- Traça-se a espectros de fotoemissão em todo o tempo, para cada amostra para obter a cinética de formação de Au CNs em diferentes condições de temperatura.
- BSA-templated Au NCs (BSA-Au CNs)
- Colocar num frasco de vidro contendo um micro barra de agitação magnética no topo de um agitador magnético. Deixar a temperatura como a temperatura ambiente.
- Misturar 200 ml de solução de BSA, 200 ul de ureia, e 200 ul de solução de ouro (III), cloreto de dentro do recipiente de vidro sob agitação constante.
- 2 minutos mais tarde, adicionar 20 ul de uma solução de NaOH para activar a capacidade redutora de BSA para formar Au CNs e começar a gravar o tempo de reacção como 0 min. Medir o espectro de fotoemissão da mistura de reacção por hora.
Nota: O espectro de fotoemissão de BSA-Au NCs é medidomenos frequentemente porque a taxa de formação de BSA-au CNs é mais lento do que o de HSA-Au, à mesma temperatura, devido à menor eficácia de ureia para desdobrar a proteína. - Parar o agitador magnético após 7 h. Traçar o espectro de fotoemissão em todos os tempos para ver a cinética de formação de Au NCs por uréia desnaturação.
3. Apresentação de pequeno Drogas Molecular
- Tela afinidade de ligação relativa das diferentes drogas moleculares pequenos para HSA
- Coloque cinco frascos de vidro, cada uma contendo uma barra de agitação magnética, em que, na parte superior de uma temperatura controlável multiponto agitador magnético. Rotular estes frascos como a, b, c e d, respectivamente, para cada fármaco, ou seja, o ibuprofeno, a varfarina, fenitoína, e sulfanilamida. Rotular a um puro com HSA como controle.
- Adicionar 200 mL de HSA a cada frasco. Adicionar 1 ml de solução de fármaco para os quatro frascos correspondentes. Adicionar 1 ml de DMSO com o controlo. Ligue o agitador e definir a velocidade de rotação para 360rpm e incubar durante 1 h para permitir a ligação à ASH de drogas para completar.
- 1 h depois, adicionar 200 mL de água Milli-Q e 200 ul de solução de ouro (III), cloreto de para cada frasco, sob agitação constante. Ajustar a temperatura para 60 ° C, sob agitação constante durante 10 min. Adicionar 20 mL de NaOH 1,5 M a cada frasco e começar a gravar o tempo de reação como 0 min.
- Desenhar se rapidamente 50 ml de solução a partir de cada frasco para uma placa preta de 384 cavidades e medir o espectro de emissão (resultados rotulado como 0 min). Grave os espectros de emissão de cada amostra a cada 10 min. Recolher pelo menos quatro espectros no tempo diferente de quatro, que é 0, 10, 20, e 30 min.
- Repita os passos 3.1.1 - 3.1.4 várias vezes para se obter resultados com uma tendência consistente. Parar o agitador magnético.
- Traçar o espectro de fotoemissão resolvida no tempo para cada amostra (a - d, e controle). Identificar o pico de intensidade de todas as amostras e conspiração contra o tempo para comparar a cinética de formação de Au NCs em dimodelos fferent proteína carregado de drogas.
- Medir a constante de ligação de um fármaco específico para HSA
- Repita os passos 3.1.1 - 3.1.4. Substitua a solução de um fármaco com soluções de ibuprofeno em quatro concentrações diferentes (incluindo uma amostra de controlo usando HSA só que sem a carga de droga). Rotular o frasco de vidro de acordo com a concentração do fármaco correspondentemente.
- 10 min mais tarde, arrefecer os frascos de vidro com água corrente em uma pia. Atenção: Os frascos de vidro estiverem quentes. Usar luvas resistentes ao calor para evitar a queima.
- Desenhar 50 ul das soluções acima a partir de cada frasco para uma placa preta de 384 cavidades e medir o espectro de emissão.
- Repita os passos 3.2.1 - 3.2.3 mais duas vezes para se obter mais dois conjuntos de resultados em diferentes concentrações da droga.
- Parar o agitador magnético. Traçar o espectro de fotoemissão e analisar os resultados.
- Para os dados brutos obtidos em cada lote individual traçar o espectro de fotoemissão de cadaamostra em software como o software OriginPro e descobrir a intensidade de pico.
- Calcular e representar graficamente a intensidade relativa de fluorescência [(I 0 - I) / I 0] contra a concentração de fármaco, e onde I I 0 referem-se a intensidade de fluorescência de Au CNs formado no carregadas com droga HSA e HSA puro, respectivamente.
- Calcula-se a constante de ligação através do ajuste dos dados a um modelo único local de ligação utilizando a equação de Michaelis-Menten: Y = Rmax × C / (K D + C), onde R max indica o sinal de resposta máxima, C é a concentração do ligando e K D a constante de ligação é. Execute isso em software como OriginPro. Selecione o menu Análise Fitting Nonlinear Curve Fit, em seguida, selecione a função monte de Crescimento / categoria Sigmoidal. No Settings: página Seleção de Função, clique em Ajustar a mostrar-se os resultados embutidos.
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Representative Results
Proteína desdobramento é um procedimento importante para a formação de proteínas modeladas por Au CNs porque os grupos funcionais mais reactivos (por exemplo, resíduos de tirosina de uma proteína) pode ser exposto a reduzir os iões Au encapsulado e, assim, acelerar a velocidade de formação de Au NCs. Os agentes de desnaturação e de aquecimento externo são dois meios comuns para promover o processo de desdobramento da proteína. A Figura 1 demonstra o efeito do aquecimento e adição de agentes desnaturantes externos sobre a cinética de formação de Au CNs, utilizando HSA como uma proteína modelo. O efeito do aquecimento sobre a cinética de formação de Au CNs é inicialmente investigada pela medição da evolução decurso temporal de espectros de fotoluminescência (Figura 1A e 1B). Quando a reacção é levada a cabo a 60 ° C, vermelho emissores de Au CNs são rapidamente formados em um curto período de tempo (100 min), tal como confirmado pelo pico óbvio centrado em 670 nm do espectro de fotoemissão 33,36 que aumenta progressipectivamente, juntamente com o tempo (Figura 1B). Em contraste, não houve picos de emissão de Au CNs a 670 nm são observados para reacções levadas a cabo à temperatura ambiente no mesmo período de tempo (Figura 1A).
O efeito da introdução de agentes desnaturantes externos sobre a cinética de formação de Au CNs também é investigada utilizando BSA como molde e ureia como agente desnaturante. A Figura 1C mostra a evoluo no tempo da evolução espectros de fotoluminescência da tal como sintetizada Au NCs. O pico de emissão semelhante de Au CNs a 670 nm também é observada, o que sugere que a BSA é também aplicável para a síntese de Au CNs fluorescentes na presença de agente desnaturante externo. No entanto, a intensidade de fluorescência de Au CNs resultante é muito mais baixo do que o formado a 60 ° C, mesmo depois de um prolongado período de tempo de reacção (7 horas). Estes resultados sugerem que a formação de Au CNs na presença de ureia é muito mais lenta em comparação com o que se formou no60 ° C, devido à ineficiência da proteína se desdobrar induzida por um agente externo de desnaturação à temperatura ambiente. Por conseguinte, o aquecimento a 60 ° C é seleccionado como o meio preferido de desnaturação para o rastreio de drogas pequenas moleculares em experiências subsequentes com a consideração de um tempo de ensaio rápido.
A Figura 2 mostra os resultados da triagem de drogas com base na cinética de formação de Au CNs com HSA carregadas com fármaco. Como mostrado na Figura 2A, a intensidade de fluorescência de Au CNs formada com o modelo de HSA puro é consistentemente mais elevada ao longo de todo o período de tempo de ensaio (30 min), seguido por aqueles com sulfanilamida (d), fenitoína (c), warfarina (b ) e ibuprofeno (a) em sequência, o que sugere que a taxa de formação de Au NCs em diferentes modelos segue a tendência de controle> d> c> b> a. Portanto, para encurtar o tempo de ensaio, apenas o espectro de fotoemissão de todas as resultantes Au CNs em 10 min são ComparEd para determinar a afinidade de ligação relativa de medicamentos para HSA (Figura 2B). Várias execuções do experimento foram realizados para confirmar a consistência dessa tendência (Figura 2C). A diferença da intensidade do espectro pode ser facilmente visualizado a partir das fotografias digitais dos resultantes Au CNs, como mostrado na Figura 2C (inset). As intensidades diferencial de fluorescência da resultante Au CNs, na presença de diferentes modelos de proteínas carregadas com fármaco é inversamente proporcional à resistência de ligação desses fármacos para HSA, como determinado em estudos anteriores 36, o que sugere que a ligação de drogas a melhorar a estabilidade da proteína contra desdobramento durante a formação do Au CNs. Portanto, as afinidades de ligação destas drogas a HSA pode ser facilmente diferenciadas através da comparação da intensidade de fluorescência como Au-formados CNs com HSA-carregadas com droga.
Finalmente, o método de rastreio de drogas corrente é aplicada para medir a ligaçãoconstante de uma droga específica para a proteína. O ibuprofeno é seleccionado para demonstrar sobre como medir a constante de ligação de uma pequena droga molecular para HSA. Soluções de ibuprofeno de diferentes concentrações (0 - 450 mM) são pré-incubados com HSA (74 mg / ml, 200 ul) para formar modelo de ibuprofeno-HSA antes da síntese de Au CNs Figura 3 mostra os espectros de fluorescência do Au CNs formado. no modelo de HSA, pré-carregadas com diferentes concentrações de ibuprofeno num único lote a 10 min de tempo de reacção. Pode ser visto que a intensidade de fluorescência diminui com o aumento da quantidade de fármaco carregada para o modelo de proteína. Para determinar a constante de ligação de ibuprofeno para a proteína HSA, a fluorescência relativa (I -I 0) / I 0 de cada uma das amostras obtidas a partir de Au CNs vários lotes diferentes é calculado, onde 0 representa a intensidade de fluorescência do NC sintetizado puro HSA e I é a intensidade de fluorescência do Au CNs sintetizado em ibuprofeno-loaded HSA (Tabela 1). O (I -I 0) / I 0 valores são representados graficamente contra a concentração de fármaco (Figura 4, linha pontilhada). Os dados está ainda equipada com um único modelo de local de ligação utilizando a equação de Michaelis-Menten: Y = Rmax × C / (K D + C), onde R max indica o sinal de resposta máxima, C é a concentração do ligando e K D é a constante de ligação (Figura 4, linha sólida). Este encaixe dá um valor de K D de ibuprofeno à ASH de 0,74 ± 0,1 uM. Este valor é muito próximo daquele (0,5 ± 1,0 uM) medido usando a técnica de RMN 37 confirma, assim, ainda mais a fiabilidade do método de corrente para medir as constantes de ligação de droga molecular pequeno em soluções homogéneas, sem a utilização de equipamentos sofisticados.
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Figura 1. Efeito de diferentes condições de desnaturação na cinética de formação de Au NCs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tempo espectros de fotoemissão resolvido de Au CNs formado em (a) HSA à temperatura ambiente, (B) de HSA a 60 ° C, e (C) com BSA a 6,4 M de ureia.
Figura 2. HSA-alvo seleção da droga com base na intensidade de fluorescência de Au NCs formados em modelos de proteína carregado de drogas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
(A), cinética de formação de Au CNs formado em (a) HSA-ibuprofeno, (b) varfarina-HSA, (c), fenitoína-HSA, (d) sulfanilamida-HSA, HSA e puro (controlo). (B) os espectros de Fotoemissão do conjugado de HSA-Au CNs preparado a 60 ° C na presença de drogas diferentes: (a) o ibuprofeno-HSA, (b) varfarina-HSA, (c), fenitoína-HSA, (d) sulfanilamida-HSA, e HSA pura (controle). (C) intensidade fotoemissão Normalizada do conjugado de HSA-droga-Au CNs contra HSA-Au NCS (controlo). Ambos os espectros e fotos digitais (inserção de C) foram tiradas em 10 min após a adição de NaOH a 60 ° C. 36 Reproduzido com permissão da The Royal Society of Chemistry.
Figura 3. Concentração estudo dependente da carga de droga em proteína HSA.
Espectros de fotoemissão de Au NCs formados em HSA carregado com ibuprofeno em diferentes concentrações em um único lote ao longo de 10 min de tempo de reação. 36 Adaptado com permissão de The Royal Society of Chemistry.
Figura 4. Determinação da constante de ligação proteína-fármaco a partir de dados experimentais.
O K D de ligação à ASH de ibuprofeno foi determinado com base nas intensidades de fluorescência relativas do conjugado de HSA-ibuprofeno-Au CNs sintetizados a 60 ° C com o aumento da quantidade de medicamentos. Os dados experimentais foram ajustados a um modelo único local de ligação utilizando a equação de Michaelis-Menten: Y = Rmax × C / (K D + C), onde R max indica o sinal de resposta máxima, C é a concentração do ligando e K D é a constante de ligação 36. Reproduzido com permissão da The Royal Society of Chemistry.
Tabela 1. Cálculo da relativaintensidades de fluorescência de Au CNs formado em modelos de proteína com concentrações variadas de fármaco.
Intensidades de fluorescência relativa [(I 0 - I) / I 0, I e I 0 referem-se a intensidade de fluorescência de Au CNs formado no carregadas com droga HSA e puro HSA, respectivamente] Au CNs formado em HSA carregado com o ibuprofeno em diferentes concentrações mais de 10 min de tempo de reacção. Número da amostra xy refere-se à amostra th y preparado no x th lote. 36 Adaptado com permissão de The Royal Society of Chemistry.
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Discussion
Há vários passos críticos que precisam ser destacadas neste método. No protocolo de rastreio da afinidade de ligação relativa das diferentes drogas moleculares pequenos, Passos 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 e são críticas para se obter bons resultados que mostram tendência consistente para a força de ligação relativa. Nestas etapas, as acções de adição de produtos químicos e de desenho soluções de reacção para a medição devem ser tão rapidamente quanto possível para minimizar o efeito de atraso no tempo e a mesma sequência de adição de produtos químicos e de desenho soluções de reacção para a medição deve ser praticado para assegurar consistência. No protocolo de medição da constante de ligação de ibuprofeno à ASH, Passo 3.2.4 é muito importante para o sucesso da medição K D. Embora mais pontos de concentração pode ser seleccionada, o efeito de desfasamento temporal devido à mais amostras para medir torna-se mais profunda. Para minimizar o efeito de desfasamento temporal, a síntese em diferentes concentrações podem ser separados em vários diferent lotes em paralelo. Em cada lote, um controle sem droga deve ser incluída para garantir a consistência e eliminar os erros do sistema possíveis.
Neste vídeo, HSA é selecionada como a proteína modelo para dirigir a síntese de fluorescentes Au CNs para o rastreio de drogas. Apenas quatro drogas diferentes, isto é, (a), o ibuprofeno (b) varfarina, (c), fenitoína, e (d) sulfanilamida são testados aqui. Por uma questão de facto, o método actual é genérica e pode ser modificada em várias formas diferentes. Teoricamente, este método pode ser aplicado a outros fármacos, pequenas moléculas, tais como esteróides, ácidos gordos, hormonas da tiróide, péptidos e grampeados, desde que estas moléculas podem ligar-se a HSA e melhorar a estabilidade da proteína contra desdobramento a um grau diferente. Outras proteínas, não se limitando a albuminas tais como HSA e BSA, como mostrado aqui, também pode ser utilizado como o modelo funcional para o rastreio de drogas desde que eles são capazes de dirigir a síntese de Au fluorescente NCS (inclusive de grupos ativos funcionais para formação Au CNs, como resíduos de tirosina) sem afetar locais de ligação de drogas. Mesmo a escolha do metal é flexível; outros CNs metálicos como Ag CNs também pode ser utilizado como a sonda de fluorescência para o rastreio de drogas.
Em resumo, o método actual é simples, rápido e de baixo custo, em comparação com outras técnicas mais sofisticadas tais como cristalografia de raios-X e RMN para estudar interacções proteina-droga. Não requer nenhuma marcação isotópica e permite a detecção de fluorescência direta de ligação em solução homogénea proteína de drogas. No presente trabalho, nós demonstramos o conceito utilizando exemplos de drogas de ligação para melhorar a estabilidade da proteína. Também pode ser possível estender o método atual para rastrear medicamentos que desestabilizam as proteínas após a ligação como um tema interessante para futuros estudos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 ml air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1,000 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5,000 μl Eppendorf tips | |||
| 1,000 μl Eppendorf tips | |||
| 100 μl Eppendorf tips | |||
| 1.5 ml micro tube | Eppendorf | ||
| 20 ml glass vial with screw cap | |||
| 4 ml glass vial with screw cap |
References
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