Abstract
Vi demonstrerer et nyt lægemiddel screeningsmetode til bestemmelse af bindingsaffiniteten af små lægemiddelmolekyler til et målprotein ved at danne fluorescerende guld nanoclusters (Au NCS) i medikamentfyldt protein, baseret på forskellen fluorescens udsendt med Au nationale kontrolsystem. Albumin proteiner, såsom humant serumalbumin (HSA) og bovint serumalbumin (BSA) er valgt som model proteiner. Fire små molekylære lægemidler (f.eks, ibuprofen, warfarin, phenytoin og sulfanilamid) med forskellige bindingsaffiniteter til albuminproteiner testes. Det konstateredes, at dannelseshastigheden af fluorescerende Au NCs inde i lastet stof albumin protein under denaturerende betingelser (dvs. 60 ° C eller i tilstedeværelse af urea) er langsommere end den, der er dannet i den uberørte protein (uden medicin). Desuden er fluorescensintensiteten af som dannede NCs sig at være omvendt korreleret til bindingsaffiniteterne af disse lægemidler til albuminproteiner. Isærjo højere den lægemiddel-protein bindingsaffinitet, jo langsommere hastigheden af Au NCs dannelse, og er således observeret en lavere fluorescensintensitet af den resulterende Au nationale kontrolsystem. Fluorescensintensiteten af de resulterende Au NCs tilvejebringer derfor et simpelt mål for den relative bindingsstyrke af forskellige testede lægemidler. Denne metode er også forlænges til at måle specifikke lægemiddel-proteinbinding konstant (K D) ved blot at variere indholdet stof indlæst i proteinet ved en fast koncentration protein. De målte resultater passer godt med de værdier, der opnås ved hjælp af andre prestige men mere komplicerede metoder.
Introduction
Serumalbuminer, såsom humant serumalbumin (HSA) og bovint serumalbumin (BSA) er den mest rigelige protein i plasma og spiller en afgørende rolle i at opretholde det osmotiske tryk i blodet rum. De er også anerkendt som bærerproteiner for små molekyler med lav vandopløselighed, såsom steroider, fedtsyrer, skjoldbruskkirtelhormoner, og en lang række lægemidler. Bindingen egenskab (f.eks bindingssteder, bindingsaffinitet eller styrke) af disse molekyler til serumalbuminer danner et vigtigt emne i farmakokinetik. Der er blevet udviklet 1-4 Adskillige analysemetoder til at studere bindingsegenskaberne af forskellige lægemidler til serum albuminer, såsom røntgenkrystallografi, 5,6 kernemagnetisk resonans (NMR), 7-11 og overfladeplasmonresonans (SPR), 12,13 mm Imidlertid er disse metoder begrænset af enten en kedelig og tidskrævende proces analyse (f.eks væksten af enkeltkrystal for X-ray Crystallografisk undersøgelse), kravet om specialiseret og dyrt udstyr (SPR), eller har behov for kostbar isotop mærkning (NMR) til detektion. Det er derfor meget ønskeligt at udvikle alternative metoder til små molekylære lægemiddelscreening på en hurtig, straight-forward og omkostningseffektiv måde.
Guld nanoclusters (Au NCS) er en særlig type nanomateriale, som indeholder flere til snesevis af metal atomer med størrelser mindre end 2 nm. 14-17 De har tiltrukket omfattende forskning interesser på grund af deres diskrete og størrelse afhængig elektroniske struktur, 18, 19 og molekylær-lignende absorptioner og emissioner. 20-23 Sådanne unikke materialer egenskaber, især den stærke fluorescens, har fundet forskellige applikationer såsom registrering og billeddannelse i biologiske systemer. 24-32 ultrasmå fluorescerende Au nationale koordinatorer kan syntetiseres ved hjælp af funktionelle proteiner, såsom serumalbuminer, som template. 33 I en typisk protein-template syntese af Au NCS er en vis mængde Au-salte første indkapslet inde i proteinet og efterfølgende reduceres med selve proteinet. Den reducerende evne af proteinet tilskrives bestanddel funktionelle aminosyrerester (f.eks tyrosin), der kan aktiveres ved at øge opløsningens pH til alkalisk. Udfoldning af proteinstruktur betragtes som et afgørende skridt for dannelsen af Au nationale koordinatorer. Dette skyldes, at i en udfoldet protein, kan flere reducerende funktionelle grupper udsættes for de indkapslede Au-salte. Proteinudfoldning kan opnås ved varmebehandling eller udsættelse for denatureringsmidler. Indførelse af små molekylære medicin kan også påvirke udfoldelsen processen, dvs. modificering midtpunktet denatureringstemperatur og enthalpi udfoldelse. 34,35 Virkningen af alle disse faktorer, til gengæld kan afspejles ved dannelse kinetik fluorescerende Au nationale koordinatorer og manifesteret i fluorescensintensiteten af de resulterende Au NCs. 36
e_content "> Denne video viser fremgangsmåden til lægemiddelscreening ved syntese Au NCs i læqemiddelladede albuminproteiner ved en højere temperatur (60 ° C) eller i nærvær af denatureringsmidler (fx urinstof). fluorescensintensitet resulterende Au NCs er det signal udlæsning. Først Au NCs syntetiseret i HSA og BSA skabeloner behandlet ved 60 ° C eller i nærværelse af urinstof at vise, hvordan proteinudfoldning (induceret ved varmebehandling eller denatureringsmidler) påvirker dannelsen kinetik Au NCs. For det andet, Au NCs syntetiseres i protein skabeloner indlæst med forskellige lægemidler, og lægemiddelfyldning effekt på de relative intensiteter af de resulterende Au NCS undersøgt, hvilket giver et mål for relative bindingsstyrke. Endelig er Au NC-lægemiddel-screening protokol modificeret til kvantitativ måling af lægemiddel-proteinbinding konstant (K D) ved at variere lægemiddelindhold indlæst i proteinet af en fast koncentration.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsigtig: Se venligst sikkerhedsdatablade (SDS) for alle involverede kemikalier før brug. Lægemidlet screeningseksperimentet involverer syntese og håndtering af nanomaterialer, som kan have yderligere risici i forhold til deres omfang modstykke. Venligst sikre alle nødvendige kontrolforanstaltninger for at blive praktiseret i hele eksperimentet, herunder brugen af tekniske kontroller (stinkskab) og personlige værnemidler (PPE, f.eks sikkerhed længde bukser, lukkede toe sko, kemikalieresistente handsker og beskyttelsesbriller).
1. Fremstilling af kemiske reagenser til Drug Screening
- Forstadier for Au NCs syntese
- Opløs 30 mg af guld (III) chlorid-opløsning (99,99% spormetaller basis 30 vægt.% I fortyndet HCI) i 6,9 ml ultrarent vand til fremstilling af 15 mM af guld (III) chlorid-opløsning. Forsigtig: gold-opløsning er ætsende og lokalirriterende. Bær ordentlig PPE at undgå direkte kontakt med øjne og hud.
- Dissolve 74 mg HSA eller BSA i 1 ml ultrarent vand til fremstilling af 74 mg / ml protein stamopløsning.
- Lægemiddelopløsninger
- Opløs den ønskede mængde lægemiddel, fx 1,9 mg til (a) ibuprofen, 2,8 mg til (b) warfarin, 2,3 mg til (c) phenytoin, og 1,5 mg for (d) sulfanilamid i 20 pi DMSO til fremstilling af 450 mM af lægemiddel stamopløsninger.
Bemærk: DMSO vælges som opløsningsmiddel, fordi disse stoffer er hydrofobe og har ringe opløselighed i vand.
- Opløs den ønskede mængde lægemiddel, fx 1,9 mg til (a) ibuprofen, 2,8 mg til (b) warfarin, 2,3 mg til (c) phenytoin, og 1,5 mg for (d) sulfanilamid i 20 pi DMSO til fremstilling af 450 mM af lægemiddel stamopløsninger.
- Andre reagenser
- Opløs 600 mg af NaOH-pellets i 10 ml ultrarent vand til fremstilling af 1,5 M NaOH-opløsning. 2,4 g urinstof opløses i 2 ml ultrarent vand til fremstilling af 20 M urinstofopløsning.
2. Syntese af protein-template Au nationale koordinatorer
- HSA-template Au NCs (HSA-Au NCS)
- Placer to hætteglas, der hver indeholder en mikro magnetisk omrører i det, på to separate temperatur kontrollerbar magnetomrørerrers.
- Indstil temperaturen på en magnetomrører til 60 ° C, og etikettere hætteglas oven på det som "60 ° C"; mens den anden magnetomrører holdes ved stuetemperatur (RT), hvor glasset anbringes på toppen af det er mærket som "RT".
- Tilsæt 200 pi HSA-opløsning, 200 pi ultrarent vand, og 200 pi af guld (III) chlorid-opløsning til hvert hætteglas under konstant omrøring (angivet som 360 rpm medmindre andet er angivet) for at tillade indkapsling af Au ioner inde i proteinet skabelon.
- 2 min senere, tilsættes 20 pi NaOH-opløsning til hvert hætteglas, således at aktivere den reducerende evne af HSA i udformningen Au NCs og begynde at optage reaktionstiden bliver så 0 min.
- Hver 20 min, trækker 50 pi løsninger fra hver af prøven til et 384-brønds plade og sort måle emissionsspektret med en mikropladelæser. Den typiske scanning opsætning: λ ex = 370 nm, λ em = 410-850 nm.
- Stop magnetomrører efter 100 min.
- Køl ned hætteglas under rindende vand i en vask. Forsigtig: hætteglas er varme. Bær varmebestandige handsker for at undgå afbrænding.
- Plot photoemission spektre til enhver tid for hver prøve for at erhverve dannelse kinetik Au nationale koordinatorer ved forskellige temperaturforhold.
- BSA-template Au NCs (BSA-Au NCS)
- Placer en glasbeholder indeholdende en mikro magnetisk omrører på toppen af en magnetomrører. Lad temperatur som stuetemperatur.
- Bland 200 pi BSA-opløsning, 200 pi urinstof, og 200 pi af guld (III) chlorid-opløsning i hætteglas under konstant omrøring.
- 2 min senere, tilsættes 20 pi NaOH-opløsning for at aktivere den reducerende evne BSA til dannelse af Au NCs og begynde at optage reaktionstiden bliver så 0 min. Mål photoemission spektrum af reaktionsblandingen hver time.
Bemærk: photoemission spektrum af BSA-Au nationale koordinatorer målesmindre hyppigt, fordi dannelsen på BSA-au NCS langsommere end for HSA-Au ved den samme temperatur på grund af mindre effektive urinstof for at udfolde proteinet. - Stop magnetomrøreren efter 7 timer. Plot photoemission spektre overhovedet tid til at se dannelsen kinetik Au nationale koordinatorer af urinstof denaturering.
3. Små Molecular Drug Screening
- Screen relative bindingsaffinitet af forskellige små molekylære lægemidler til HSA
- Placer fem hætteglas, der hver indeholder en magnetisk omrører i det, oven på en temperatur kontrollerbar multipoint magnetomrører. Mærke disse hætteglas som a, b, c og d henholdsvis for hvert lægemiddel, nemlig ibuprofen, warfarin, phenytoin, og sulfanilamid. Mærk den med rent HSA som kontrol.
- Tilsæt 200 pi HSA til hvert hætteglas. Tilsæt 1 pi lægemiddelopløsning til de fire tilsvarende hætteglas. Tilsæt 1 pi DMSO til kontrollen. Tænd for omrører og indstil centrifugeringshastighed til 360rpm og inkuberes i 1 time for at tillade medikamentet binding til HSA at fuldføre.
- 1 time senere tilsættes 200 pi Milli-Q-vand og 200 pi af guld (III) chlorid-opløsning til hvert hætteglas under konstant omrøring. Indstil temperaturen til 60 ° C under konstant omrøring i 10 minutter. Tilføj 20 pi 1,5 M NaOH til hvert hætteglas og begynde at optage reaktionstiden bliver så 0 min.
- Hurtigt tegne 50 pi opløsning fra hvert hætteglas til en 384-brønds plade og sort måle emissionsspektret (resultater mærket som 0 min). Optag emissionsspektret af hver prøve hver 10 min. Saml mindst fire spektre ved fire forskellige tidspunkter, dvs. 0, 10, 20 og 30 min.
- Gentag trin 3.1.1 - 3.1.4 flere gange for at opnå resultater med en konsekvent tendens. Stop magnetomrører.
- Plot tidsopløst photoemission spektre for hver prøve (a - d, og kontrol). Identificer topintensiteten af alle prøver og komplot mod tiden at sammenligne dannelsen kinetik Au nationale koordinatorer i different narkotika-loaded protein skabeloner.
- Mål bindingskonstant af et specifikt lægemiddel til HSA
- Gentag trin 3.1.1 - 3.1.4. Erstat lægemiddelopløsningen med ibuprofen opløsninger ved fire forskellige koncentrationer (herunder en kontrolprøve ved hjælp HSA blot uden medikamentbelastning). Mærk hætteglasset ifølge koncentration lægemidlet tilsvarende.
- 10 min senere nedkøle hætteglas under rindende vand i en vask. Forsigtig: hætteglas er varme. Bær varmebestandige handsker for at undgå afbrænding.
- Tegn 50 pi af ovennævnte løsninger fra hvert hætteglas til en 384-brønds plade og sort måle emissionsspektret.
- Gentag trin 3.2.1 - 3.2.3 to gange mere for at opnå yderligere to sæt resultater ved forskellige lægemiddelkoncentrationer.
- Stop magnetomrører. Plot photoemission spektre og analysere resultaterne.
- For de rå data opnået i hvert enkelt parti, plotte photoemission spektre af hverprøve i software som OriginPro software og finde ud af den maksimale intensitet.
- Beregne og plotte den relative fluorescensintensitet [(I 0 - I) / I 0] mod lægemiddelkoncentrationen, hvor I og I 0 henvise til fluorescensintensiteten af Au NCs dannet i medikamentfyldt HSA og HSA ren, henholdsvis.
- Beregn bindingskonstanten ved at tilpasse dataene til et enkelt sted bindende model ved hjælp af Michaelis-Menten ligningen: Y = R max × C / (KD + C), hvor R max angiver den maksimale svarsignal, C er koncentrationen af ligand og KD er bindingskonstanten. Udfør denne i software som OriginPro. Vælg menuen Analyse Montering Nonlinear Curve Fit, og vælg derefter Hill funktion fra Vækst / sigmoidal kategori. På Indstillinger: Funktion Valg, skal du klikke Tilpas til dukke op de monterede resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteinudfoldning er en vigtig procedure for dannelsen af protein-template Au NCs fordi flere reaktive funktionelle grupper (f.eks tyrosinrester) af et protein kan blive udsat for at reducere de indkapslede Au ioner og dermed fremskynde dannelsen på Au nationale kontrolsystem. Varme og ekstern denaturering agenter er to almindelige midler til at fremme proteinudfoldning proces. Figur 1 viser effekten af opvarmning og tilføje eksterne denaturering agenter på dannelsen kinetik Au NCS hjælp HSA som model protein. Virkningen af opvarmning på dannelsen kinetik Au NCS først undersøgt ved at måle tidsforløbet udviklingen i fotoluminescensspektrene (figur 1A og 1B). Når reaktionen udføres ved 60 ° C, er rød-emitterende Au NCs hurtigt dannet i en kort periode (100 min), hvilket bekræftes af den indlysende top centreret ved 670 nm af photoemission spektre 33,36, der øger progressiholdsvis sammen med tiden (figur 1B). Som modsætning hertil er ingen emissionstoppe af Au NCs ved 670 nm observeret for reaktioner udført ved stuetemperatur i samme periode (figur 1A).
Virkningen af at indføre en ekstern denatureringsmidler på dannelsen kinetik Au NCS også undersøgt under anvendelse af BSA som template og urinstof som denatureringsmiddel. Figur 1C viser tidsforløbet udviklingen i fotoluminescensspektrene af syntetiseret Au NCs. Den tilsvarende emission peak for Au NCs ved 670 nm er også observeret, hvilket antyder, at BSA gælder også for syntesen af fluorescerende Au NCs i nærvær af eksterne denatureringsmiddel. Men fluorescensintensitet resulterende Au NCS meget lavere end dannet ved 60 ° C, selv efter en længere periode reaktionstid (7 timer). Disse resultater antyder, at dannelsen af Au NCs i nærvær af urinstof er meget langsommere sammenlignet med den dannet ved60 ° C på grund af den ineffektive proteinudfoldning induceret af en ekstern denatureringsmiddel ved stuetemperatur. Derfor er opvarmning ved 60 ° C valgt som det foretrukne middel til denaturering til at screene for små molekylære lægemidler i efterfølgende eksperimenter med behandlingen af en hurtig analyse tid.
Figur 2 viser resultaterne af lægemiddel-screening baseret på dannelsen kinetik Au NCs med medikamentfyldt HSA. Som vist i figur 2A, fluorescensintensiteten af Au NCs dannet med den rene HSA skabelonen er konsekvent højeste i hele perioden assay tid (30 min), efterfulgt af dem med sulfanilamid (d), phenytoin (c), warfarin (b ) og ibuprofen (a) i rækkefølge, hvilket tyder på, at dannelsen på Au NCs i forskellige skabeloner følger tendensen af kontrol> d> c> b> a. Derfor, for at forkorte analysetiden kun photoemission spektre af alle de resulterende Au NCs på 10 min er COMPARed at bestemme den relative bindingsaffinitet af lægemidler til HSA (figur 2B). Flere kørsler af eksperimentet er udført for at bekræfte sammenhængen i denne tendens (figur 2C). Spektret intensitet Forskellen kan let visualiseres fra de digitale billeder af de resulterende Au NCs som vist i figur 2C (indsat). Den differentielle fluorescens intensiteter af de resulterende Au NCs i nærværelse af forskellige læqemiddelladede protein skabeloner er omvendt proportional med bindingsstyrken af disse lægemidler til HSA som bestemt i tidligere undersøgelser 36, hvilket tyder på, at bindingen af narkotika forbedre stabiliteten af proteinet mod udfoldning under dannelsen af Au nationale koordinatorer. Derfor kan bindingsaffiniteterne af disse lægemidler til HSA let differentieres ved at sammenligne fluorescensintensitet som dannede Au NCs med lægemiddel-loaded HSA.
Endelig er aktuelle stof screeningsmetode anvendes til at måle bindingkonstant af et specifikt lægemiddel til protein. Ibuprofen er valgt til over hvordan man kan måle bindingskonstant af en lille molekylær lægemiddel til HSA. Ibuprofen opløsninger af forskellige koncentrationer (0 - 450 mM) præinkuberes med HSA (74 mg / ml, 200 pi) til dannelse af ibuprofen-HSA template, før syntesen af Au NCs Figur 3 viser fluorescens-spektre af Au NCs dannet. i HSA skabelonen præinstalleret med ibuprofen i forskellige koncentrationer i en enkelt batch på 10 min reaktionstid. Det kan ses, at fluorescensintensiteten falder med stigende mængde af lægemiddel indlæst til proteinet skabelon. For at bestemme bindingskonstanten af ibuprofen til HSA protein, den relative fluorescens (I 0 -I) / I 0 i hver Au NCs prøve opnået fra flere forskellige batcher beregnes, hvor jeg 0 er fluorescensintensiteten af NC syntetiseret i ren HSA og jeg er fluorescensintensiteten af Au nationale koordinatorer syntetiseret i ibuprofen-loaded HSA (tabel 1). Den (I 0 -I) / I 0-værdier er plottet mod koncentrationen lægemiddel (figur 4, punkteret linie). Dataene er endvidere monteret på et enkelt sted bindende model ved hjælp af Michaelis-Menten ligningen: Y = R max × C / (KD + C), hvor R max angiver den maksimale svarsignal, C er koncentrationen af ligand og KD er den bindingskonstant (figur 4, optrukket linje). Denne fitting giver en Kd-værdi af ibuprofen til HSA på 0,74 ± 0,1 uM. Denne værdi er meget tæt på at (0,5 ± 1,0 pM) målt under anvendelse af NMR-teknik 37 således bekræfter yderligere pålideligheden af nuværende metode til måling bindingskonstanterne af små molekylære lægemiddel i homogene opløsninger, uden brug af avanceret udstyr.
3261fig1.jpg "/>
Figur 1. Effekt af forskellige denaturerende betingelser på dannelsen kinetik Au nationale koordinatorer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tid fotoemission spektre af Au NCs dannet i (A) HSA ved stuetemperatur, (B) HSA ved 60 ° C, og (C) BSA med 6,4 M urinstof.
Figur 2. HSA-targeting narkotika screening baseret på fluorescens-intensiteten af Au nationale koordinatorer dannet i narkotika-loaded protein skabeloner. Klik her for at se en større version af dette tal.
(A) dannelse kinetik Au NCs dannet i (a) ibuprofen-HSA, (b) warfarin-HSA, (c) phenytoin-HSA, (d) sulfanilamid-HSA og rent HSA (kontrol). (B) photoemission spektre af HSA-Au NCs fremstillet ved 60 ° C i nærværelse af forskellige stoffer: (a) ibuprofen-HSA, (b) warfarin-HSA, (c) phenytoin-HSA, (d) sulfanilamid-HSA, og rent HSA (kontrol). (C) Normalized photoemission intensiteten af HSA-lægemiddel-Au NCs mod HSA-Au NCs (kontrol). Både spektre og digitale billeder (indeniliggende C) blev taget ved 10 minutter efter tilsætning af NaOH ved 60 ° C. 36 Gengivet med tilladelse fra Royal Society of Chemistry.
Figur 3. Koncentrationsafhængig undersøgelse af lægemiddelfyldning på HSA-protein.
Photoemission spektre af Au nationale koordinatorer dannet i HSA fyldt med ibuprofen i forskellige koncentrationer i et enkelt parti i løbet af 10 minutter af reaktionstid. 36 Tilpasset med tilladelse fra Royal Society of Chemistry.
Figur 4. Bestemmelse af protein-drug bindingskonstant fra eksperimentelle data.
KD ibuprofen binding til HSA blev bestemt baseret på de relative intensiteter af fluorescens HSA-ibuprofen-Au NCs syntetiseret ved 60 ° C med stigende mængde af lægemidler. Den eksperimentelle data blev tilpasset til et enkelt sted bindende model ved hjælp af Michaelis-Menten ligningen: Y = R max × C / (KD + C), hvor R max angiver den maksimale svarsignal, C er koncentrationen af ligand og KD er bindende konstant. 36 Gengivet med tilladelse fra Royal Society of Chemistry.
Tabel 1. Beregning af relativfluorescensintensiteter af Au NCs dannet i protein skabeloner med lægemiddel med varierede koncentrationer.
Relativ fluorescensintensiteterne [(I 0 - I) / I 0, I og I 0 henvise til fluorescensintensiteten af Au NCs dannet i medikamentfyldt HSA og rent HSA, henholdsvis] for Au NCs dannet i HSA fyldt med ibuprofen ved forskellige koncentrationer over 10 min reaktionstid. Prøve nummer xy refererer til y th prøve fremstillet i x th batch. 36 Tilpasset med tilladelse fra Royal Society of Chemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske trin, der skal fremhæves i denne metode. I protokollen for screening af den relative bindingsaffinitet af forskellige små molekylære lægemidler, trin 3.1.2, 3.1.3 og 3.1.4 er kritiske for at opnå gode resultater, der viser konsekvent tendens for den relative binding styrke. I disse trin, bør handlinger tilføje kemikalier og tegning reaktion løsninger til måling så hurtigt som muligt være at minimere timelag-effekt, og den samme sekvens af at tilføje kemikalier og tegning reaktionsopløsninger til måling bør praktiseres for at sikre sammenhæng. I protokollen for at måle den bindende konstant af ibuprofen til HSA, trin 3.2.4 er meget vigtigt i retning af succes K D måling. Selvom der kan vælges flere koncentration punkter, det timelag-effekt på grund af flere prøver for at måle bliver mere dybtgående. For at minimere tidsforsinkelsen virkning, kan syntesen ved forskellige koncentrationer adskilles i flere Forskelnt batches parallelt. I hvert parti, bør en kontrol uden lægemiddel inkluderes for at sikre sammenhæng og eliminere de mulige systemfejl.
I denne video, er HSA valgt som model protein til at dirigere syntesen af fluorescerende Au NCs til lægemiddelscreening. Kun fire forskellige lægemidler, dvs., (a) ibuprofen (b) warfarin, (c) phenytoin, og (d) sulfanilamid testes her. Som en kendsgerning, den nuværende metode er generisk og kan modificeres i flere forskellige former. Teoretisk set kan denne metode anvendes til andre lægemidler, små molekyler, såsom steroider, fedtsyrer, skjoldbruskkirtelhormoner, og hæftede peptider, forudsat at disse molekyler kan binde til HSA og forbedre stabiliteten af proteinet mod udfoldning i forskelligt omfang. Andre proteiner, ikke begrænset til albuminer såsom HSA og BSA som vist her, kan også anvendes som den funktionelle skabelon til lægemiddelscreening, så længe de er i stand til at dirigere syntesen af fluorescerende Au NCs (inclusive af aktive funktionelle grupper for Au NCs formation, såsom tyrosinrester) uden at påvirke drug bindingssteder. Selv valget af metal er fleksibel; andet metal NCs såsom Ag NCs kan også anvendes som fluorescens-probe til lægemiddelscreening.
Sammenfattende nuværende metode er enkel, hurtig og omkostningseffektiv sammenlignet med andre mere sofistikerede teknikker, såsom røntgenkrystallografi og NMR til at undersøge protein-interaktioner. Det kræver ingen isotop mærkning og tillader direkte fluorescerende påvisning af protein-drug bindende i homogen opløsning. I denne igangværende arbejde har vi vist, at begrebet med eksempler af lægemiddel binding til forbedring af proteinstabilitet. Det kunne også være muligt at forlænge den nuværende metode til at screene lægemidler, der destabiliserer proteiner efter binding som et interessant emne for fremtidig undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 ml air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1,000 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 μl air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5,000 μl Eppendorf tips | |||
| 1,000 μl Eppendorf tips | |||
| 100 μl Eppendorf tips | |||
| 1.5 ml micro tube | Eppendorf | ||
| 20 ml glass vial with screw cap | |||
| 4 ml glass vial with screw cap |
References
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
- Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
- Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
- Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
- Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
- Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
- Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
- Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
- Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
- Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
- Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
- Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
- Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
- Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
- Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
- Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
- Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
- Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
- Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
- Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
- Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
- Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
- Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
- Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
- Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
- Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
- Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
- Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
- Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
- Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. , (2015).
- Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
- Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
- Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
- Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).
