Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En rask og kvantitativ fluorimetrisk Metode for Protein-Targeting lite molekyl narkotikaundersøkelser

doi: 10.3791/53261 Published: October 16, 2015

Abstract

Vi viser en ny medikamentscreeningmetode for å bestemme bindingsaffiniteten av små medikamentmolekyler til et målprotein ved å danne fluorescerende gull (Au nanoclusters NCS) i medikamentbelastede protein, basert på differensial fluorescens-signalet som sendes ut av Au sokkelen. Albumin proteiner, slik som humant serumalbumin (HSA) og bovint serumalbumin (BSA) blir valgt som modellproteiner. Fire små molekylære medikamenter (for eksempel, ibuprofen, warfarin, fenytoin, og sulfanilamid) av forskjellige bindingsaffiniteter til albumin-proteinene er testet. Det ble funnet at dannelseshastigheten av fluorescerende Au NCs inne i stoffet som er lagt albumin proteinet under denaturerende betingelser (dvs. 60 ° C eller i nærvær av urea) er langsommere enn det som dannes i den uberørte protein (uten medikamenter). Videre er den fluorescerende intensitet av as-dannede NCs funnet å være inverst korrelert til bindingsaffinitetene av disse legemidlene til albumin proteiner. Spesieltjo høyere medikament-proteinbinding affinitet, jo langsommere hastighet på Au NCs formasjon, og således en lavere fluorescensintensitet av den resulterende Au norsk sokkel observert. Fluorescensintensiteten av de resulterende Au NCs derfor gir et enkelt mål på den relative bindingsstyrken av forskjellige medikamenter testet. Denne metoden er også utvides til å måle den spesifikke medikament-proteinbindingskonstant (K D) ved ganske enkelt å variere medikamentinnhold er forhåndslagret i protein ved en fast proteinkonsentrasjon. De målte resultatene samsvarer godt med verdiene oppnådd ved hjelp av andre prestisje, men mer kompliserte metoder.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Serumalbuminer, slik som humant serumalbumin (HSA) og bovint serumalbumin (BSA) er de mest tallrike protein i plasma, og spiller en viktig rolle i å opprettholde det osmotiske trykk på blodrommet. De er også anerkjent som bærerproteiner for små molekyler med lav vannløselighet, slik som steroider, fettsyrer, skjoldbruskkjertelhormoner, og et bredt spekter av medikamenter. Bindingen egenskap (f.eks bindingsseter, bindingsaffinitet eller styrke) av disse molekylene for å serumalbuminer utgjør et viktig tema i farmakokinetikk. 1-4 Flere analytiske metoder har blitt utviklet for å studere bindingsegenskapene til forskjellige medikamenter for å serumalbuminer, såsom røntgenkrystallografi, 5,6 kjernemagnetisk resonans (NMR), 7-11 og overflate-plasmonresonans (SPR), 12,13 etc. Imidlertid er disse fremgangsmåter begrenset av enten en omstendelig og tidkrevende prosess analyse (for eksempel, vekst av enkeltkrystall for X-ray krystallografiskegrafisk undersøkelse), krav om spesialisert og kostbart utstyr (SPR), eller som har behov for kostbare isotop merking (NMR) for deteksjon. Det er derfor sterkt ønskelig å utvikle alternative måter for små molekylære narkotika screening på en rask, rett fram, og kostnadseffektiv måte.

Gull (Au nanoclusters NCS) er en spesiell type nanomaterialer som inneholder flere titalls metallatomer med størrelser mindre enn 2 nm. 14-17 De har tiltrukket omfattende forskning interesser på grunn av deres størrelse og diskret avhengige elektroniske struktur, 18, 19 og molekylær-lignende absorptions og utslipp. 20-23 Slike unike materialegenskaper, spesielt sterk fluorescens, har funnet diverse applikasjoner som sensing og bildebehandling i biologiske systemer. 24-32 ultra fluorescerende Au NCs kan syntetiseres ved hjelp av funksjonelle proteiner, slik som serumalbuminer, som templat. 33 I en typisk protein malbasert syntese av Au sokkelen blir en viss mengde av Au-salter første innkapslet inne i proteinet, og deretter redusert med proteinet i seg selv. Den reduserende evne av protein tilskrives konstituerende funksjonelle aminosyrerester (f.eks, tyrosin) som kan aktiveres ved å øke oppløsningens pH til alkalisk. Utfoldelsen av proteinstruktur anses som et avgjørende skritt for dannelsen av Au norsk sokkel. Dette skyldes at i utfoldet protein, kan flere reduserende funksjonelle grupper bli utsatt for de innkapslede Au-salter. Protein utfolding kan oppnås ved varmebehandling eller eksponering for denaturerende midler. Innføring av små molekylære medikamenter kan også påvirke utbrettingsprosessen, det vil si å modifisere punktet denatureringstemperaturen og entalpien av utfoldelsen. 34,35 Effekten av alle disse faktorene, kan igjen bli reflektert av de formasjonskinetikken av fluorescerende Au norsk sokkel og manifestert i fluorescens intensitet resulterende Au norsk sokkel. 36

e_content "> Denne videoen demonstrerer metoden for legemiddelscreening ved å syntetisere Au norsk sokkel stoffbelastede albumin-proteiner ved en høyere temperatur (60 ° C), eller i nærvær av denatureringsmidler (for eksempel urea). Fluorescensintensiteten av resulterende Au NCs er signalet avlesning. Først blir Au NCs syntetisert på HSA og BSA-maler ble behandlet ved 60 ° C, eller i nærvær av urea for å vise hvordan protein utfolding (indusert ved varmebehandling eller denatureringsmidler) påvirker dannelsen kinetikken for Au sokkelen. For det andre, Au norsk sokkel syntetisert protein maler forhåndslastet med ulike legemidler, og den medikament-last virkning på de relative fluorescensstyrkene resulterende Au norsk sokkel studert, som gir et mål på relativ bindingsstyrke. Til slutt blir den Au NC-drug screening protokoll modifisert for kvantitativ måling av medikament-proteinbindingskonstant (K D) ved å variere medikamentinnhold er forhåndslagret i proteinet av en fastsatt konsentrasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Forsiktig: Sjå sikkerhetsdatablad (SDS) av alle involverte kjemikalier før bruk. Stoffet screening Forsøket involverer syntese og bruk av nanomaterialer, som kan ha ekstra risiko i forhold til deres bulk motstykke. Vennligst sikre alle nødvendige kontrolltiltak for å bli praktisert gjennom hele forsøket, herunder bruk av tekniske kontroller (avtrekk) og personlig verneutstyr (PVU, f.eks, sikkerhet lengde bukser, lukket-toe sko, kjemikaliebestandige hansker og vernebriller).

1. Utarbeidelse av kjemiske reagenser for narkotikaundersøkelser

  1. Forløpere for Au NCs syntese
    1. Oppløs 30 mg gull (III) klorid-oppløsning (99,99% spormetaller basis, 30 vekt.% I fortynnet HCl) i 6,9 ml ultrarent vann for å fremstille 15 mM av gull (III) klorid-oppløsning. Forsiktig: gull-oppløsning er etsende og irriterende. Bruk riktig verneutstyr for å unngå direkte kontakt med øyne og hud.
    2. Dissolve 74 mg av HSA eller BSA i 1 ml ultrarent vann for å fremstille 74 mg / ml proteinstamløsning.
  2. Narkotika løsninger
    1. Oppløs den ønskede mengde medikament, f.eks, 1,9 mg for (a) ibuprofen, 2,8 mg for (b) warfarin, 2,3 mg for (c) fenytoin, og 1,5 mg for (d) sulfanilamid i 20 ul DMSO for å fremstille 450 mM av narkotika stamløsninger.
      Merk: DMSO er valgt som løsningsmiddel, fordi disse stoffene er hydrofobe og har dårlig løselighet i vann.
  3. Andre reagenser
    1. Oppløs 600 mg NaOH-pellets i 10 ml ultrarent vann for å fremstille 1,5 M NaOH-løsning. Oppløs 2,4 g urea i 2 ml ultrarent vann for å fremstille 20 M ureaoppløsning.

2. Syntese av Protein-på mal Au NCs

  1. HSA-malbasert Au NCs (HSA-Au NCS)
    1. Plasser to hetteglass som hver inneholder en mikro magnetisk oppsikt bar i det, på to separate temperatur kontrollerbar magnetisk oppsiktrers.
    2. Sette temperaturen av en magnetisk rører til 60 ° C, og merker den hetteglass på toppen av det som "60 ° C"; mens den andre magnetrører ble holdt ved romtemperatur (RT), hvor hetteglass på toppen av den er merket som "RT".
    3. Tilsett 200 ul HSA-løsning, 200 ul av ultrarent vann, og 200 ul av gull (III) klorid-oppløsning til hver ampulle under konstant omrøring (angitt som 360 rpm, med mindre annet er angitt) for å tillate innkapsling av Au-ioner inne i proteinet malen.
    4. 2 minutter senere, tilsett 20 ul NaOH-løsning til hver ampulle for derved å aktivere den reduserende kapasitet av HSA i å danne Au norsk sokkel, og begynner å ta opp reaksjonstiden som 0 min.
    5. Hvert 20 min, tegne 50 ul av oppløsninger fra hver av prøven til en 384-brønners plate sort og måle emisjonsspektrum med en mikroplateleser. Den typiske skanning setup: λ ex = 370 nm, λ em = 410-850 nm.
    6. Stoppe magnetrører etter 100 min.
    7. Kjøl ned glassampullene under rennende vann i en vask. Forsiktig: hetteglass er varmt. Bruk varmebestandige hansker for å unngå brenning.
    8. Plott fotoemisjonsspektrene til enhver tid for hver prøve å tilegne seg dannelse kinetikk av Au NCs ved ulike temperaturforhold.
  2. BSA-malbasert Au NCs (BSA-Au NCS)
    1. Plasser et hetteglass inneholdende en mikro magnetisk rørestav på toppen av en magnetrører. La temperaturen som romtemperaturen.
    2. Bland 200 ul BSA-oppløsning, 200 pl urea, og 200 ul av gull (III) klorid-oppløsning i hetteglass under konstant omrøring.
    3. 2 minutter senere, tilsett 20 ul NaOH-løsning for å aktivere den reduserende evne til BSA for å danne Au norsk sokkel, og begynner å ta opp reaksjonstiden som 0 min. Mål fotoemisjonsspektrumet av reaksjonsblandingen hver time.
      Merk: fotoemisjonsspektrumet av BSA-Au norsk sokkel måltsjeldnere fordi dannelsen frekvensen av BSA-Au NCs er langsommere enn den for HSA-Au ved den samme temperatur på grunn av mindre effektiviteten av urea for å brette ut proteinet.
    4. Stoppe magnetrører etter 7 timer. Plott fotoemisjonsspektrene i det hele tatt tid til å se formasjonskinetikk av Au NCs av urea denaturering.

3. Liten Molecular narkotikaundersøkelser

  1. Skjerm relative bindingsaffinitet til forskjellige små molekylære stoffer til HSA
    1. Plassere fem glassampuller, som hver inneholdende en magnetisk rørestav i den, på toppen av en temperatur styrbar flerpunkts magnetrører. Etikett disse ampuller som a, b, c og d henholdsvis for hvert stoff, nemlig ibuprofen, warfarin, fenytoin, og sulfanilamid. Merke den med ren HSA som kontroll.
    2. Tilsett 200 ul av HSA til hver ampulle. Legg 1 mL av medikamentløsning til fire tilsvarende ampuller. Tilsett 1 pl av DMSO til kontrollen. Slå på røre og satt sentrifugehastigheten til 360rpm og inkuberes i 1 time for å tillate at medikamentet binding til HSA for å fullføre.
    3. 1 time senere, tilsett 200 ul Milli-Q vann og 200 ul av gull (III) klorid-oppløsning til hver ampulle under konstant omrøring. Temperaturen til 60 ° C under konstant omrøring i 10 min. Tilsett 20 ul 1,5 M NaOH til hver ampulle, og begynner å ta opp reaksjonstiden som 0 min.
    4. Raskt å trekke 50 ul av oppløsning fra hvert hetteglass til en 384-brønners plate, og sort måle emisjonsspekteret (resultater merket 0 min). Ta opp den emisjonsspektra for hver prøve hvert 10. minutt. Samle minst fire spektra ved fire forskjellige tidspunkt, er at 0, 10, 20, og 30 min.
    5. Gjenta trinn 3.1.1 - 3.1.4 flere ganger for å oppnå resultater med en konsistent trend. Stoppe magnetrører.
    6. Plotte tids-oppløst fotoemisjonsspektrene for hver prøve (a - d, og kontroll). Identifisere peak intensitet av alle prøver og plottet mot tiden for å sammenligne formasjonskinetikk av Au norsk sokkel different narkotikabelastede protein maler.
  2. Måle bindingen konstanten til et bestemt medikament til HSA
    1. Gjenta trinn 3.1.1 - 3.1.4. Erstatte stoffet løsning med ibuprofen løsninger på fire ulike konsentrasjoner (inkludert en kontrollprøve ved hjelp av HSA bare uten narkotika lasting). Label hetteglass i henhold til legemiddelkonsentrasjonen tilsvarende.
    2. 10 min senere, kjøle ned glassampullene under rennende vann i en vask. Forsiktig: hetteglass er varmt. Bruk varmebestandige hansker for å unngå brenning.
    3. Tegn 50 ul av de ovenfor nevnte løsninger fra hvert hetteglass til en 384-brønners plate sort og måle emisjonsspekteret.
    4. Gjenta trinn 3.2.1 - 3.2.3 to ganger mer å skaffe ytterligere to sett med resultater på ulike legemiddelkonsentrasjon.
    5. Stoppe magnetrører. Plotte fotoemisjonsspektrene og analysere resultatene.
      1. For de rå data oppnådd i hvert enkelt parti, plotte fotoemisjonsspektrene til hvertprøven i programvare som OriginPro programvare og finne ut toppintensiteten.
      2. Beregne og plotte den relative fluorescensintensitet [(I 0 - I) / I 0] mot legemiddelkonsentrasjonen, hvor I og I 0 refererer til fluorescens-intensiteten av Au dannet i NCs medikament-lastet HSA og ren HSA, respektivt.
      3. Beregn bindingen konstant ved å tilpasse dataene til en enkelt bindingsmodell ved å bruke Michaelis-Menten-ligningen: Y = R max x C / (K D + C), hvor R max indikerer maksimal responssignalet, C er konsentrasjonen av ligand og K D er bindingskonstanten. Utføre dette i programvare som OriginPro. Velg menyen Analyse Montering Nonlinear Curve Fit, så velg Hill funksjon fra Vekst / sigmoidal kategori. På Innstillinger: Function Selection siden, klikker du Tilpass til dukke opp de monterte resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protein utfoldelse er en viktig fremgangsmåte for dannelse av protein-malbasert Au NCs fordi flere reaktive funksjonelle grupper (for eksempel tyrosin-rester) av et protein kan bli utsatt for å redusere de innkapslede Au-ioner, og således akselerere dannelsen frekvensen av Au sokkelen. Oppvarming og ytre denatureringsmidler er to vanlige midler for å fremme protein utbrettingsprosessen. Figur 1 viser effekten av varme og legge ytre denatureringsmidler på formasjonskinetikken til Au sokkelen ved hjelp av HSA som en modell protein. Virkningen av varme på formasjons kinetikken av Au NCS først undersøkt ved å måle tidsforløpet utviklingen av photoluminescence spektra (figur 1A og 1B). Når reaksjonen utføres ved 60 ° C, blir rød-emitterende Au NCs hurtig dannet i løpet av kort tid (100 min), noe som bekreftes av den åpenbare topp sentrert ved 670 nm av det fotoemisjonsspektrene 33,36 som øker progressisvis sammen med tiden (figur 1B). Som en kontrast, er ingen utslipps toppene Au NCs på 670 nm observert for reaksjoner utført ved romtemperatur i samme periode (figur 1A).

Effekten av å innføre eksterne denatureringsmidler på formasjonskinetikk av Au norske sokkelen også er undersøkt ved hjelp av BSA som mal og urea som denaturering agent. Figur 1C viser tidsforløpet utviklingen av photoluminescence spektra av nysyntetisert Au norsk sokkel. Den tilsvarende emisjonstopp Au norsk kontinentalsokkel på 670 nm er også observert, noe som antyder at BSA er også anvendelig for syntese av fluorescerende Au NCs i nærvær av ytre denaturerende middel. Imidlertid fluorescensintensiteten av resulterende Au NCS mye lavere enn det som dannes ved 60 ° C, selv etter en lengre periode av reaksjonstiden (7 timer). Disse resultatene tyder på at dannelsen av Au NCs i nærvær av urea er mye tregere i forhold til det som dannes ved60 ° C på grunn av ineffektiviteten av protein utfolding indusert av et eksternt middel denaturering ved romtemperatur. Derfor er oppvarming ved 60 ° C, valgt som det foretrukne middel for denaturering for å screene for små molekylære stoffer i etterfølgende forsøk med hensyn til en hurtig assay tid.

Figur 2 viser resultatene av narkotika screening basert på dannelse kinetikk av Au NCs med narkotikabelastede HSA. Som vist i figur 2A, er fluorescensintensiteten av Au NCs utformet med den rene HSA malen konsekvent høy gjennom hele perioden av analysetiden (30 min), etterfulgt av de med sulfanilamid (d), fenytoin (c), warfarin (b ), og ibuprofen (a) i rekkefølge, noe som antyder at dannelsen frekvensen av Au NCs i ulike maler følger trenden av kontroll> d> c> b> a. Derfor, for å redusere analysetiden, bare den fotoemisjonsspektrene for alle de resulterende Au norsk kontinentalsokkel på 10 min er komparativeed å bestemme den relative bindingsaffinitet av legemidler til HSA (figur 2B). Flere kjøringer av eksperimentet er gjennomført for å bekrefte konsistensen av denne trenden (figur 2C). Spekteret intensitetsforskjell lett kan visualiseres fra digitale bilder av de resulterende Au NCs som vist i figur 2C (innfelt). Differensial fluorescensstyrkene de resulterende Au NCs i nærvær av forskjellige medikamentbelastet protein maler, er omvendt proporsjonal med bindekraft av disse stoffene til HSA, bestemt i tidligere studier 36, noe som antyder at bindingen av medikamenter forbedre stabiliteten til proteinet mot utfoldelse under dannelsen av Au norsk sokkel. Derfor kan bindingsaffinitetene av disse stoffene til HSA lett differensieres ved å sammenligne intensiteten av fluorescens-as-dannede Au NCs med medikament-loaded HSA.

Til slutt blir strømmen medikament screeningsmetoden anvendt for å måle bindingskonstant av et spesifikt medikament til protein. Ibuprofen er valgt for å demonstrere hvordan å måle bindingen av en konstant liten molekyl medikament til HSA. Ibuprofen løsninger av forskjellige konsentrasjoner (0 - 450 mM) er pre-inkubert med HSA (74 mg / ml, 200 ul) for å danne ibuprofen-HSA malen før syntesen av Au NCs Figur 3 viser fluorescensspektra av Au NCs dannet. i HSA malen forhåndslastet med ibuprofen i forskjellige konsentrasjoner i en enkelt batch på 10 min av reaksjonstiden. Det kan sees at fluorescensintensiteten avtar med økende mengde av medikament som er lagt til proteinet malen. For å bestemme bindingskonstanten ibuprofen til HSA-protein, relativ fluorescens (I 0 -I) / I 0 av hver Au NCs prøve erholdt fra en rekke forskjellige partier er beregnet, hvor I 0 er fluorescensintensiteten av NC syntetisert i ren HSA og I er fluorescensintensiteten av Au NCs syntetisert i ibuprofen-loaded HSA (tabell 1). Den (I 0 -I) / I 0-verdiene plottes mot legemiddelkonsentrasjonen (figur 4, stiplet linje). Dataene er videre montert til en enkelt bindingsmodell ved å bruke Michaelis-Menten-ligningen: Y = R max x C / (K D + C), hvor R max indikerer maksimal responssignalet, C er konsentrasjonen av ligand og K D er bindingskonstanten (figur 4, heltrukket linje). Dette beslag gir en K D verdi av ibuprofen til HSA på 0,74 ± 0,1 mikrometer. Denne verdi er meget nær den (0,5 ± 1,0 uM) måles ved hjelp av NMR-teknikk 37 og dermed ytterligere bekrefter påliteligheten av nåværende metode for å måle bindingskonstant små molekylære legemiddel i homogene oppløsninger, uten bruk av avansert utstyr.

3261fig1.jpg "/>
Figur 1. Effekt av ulike denaturerende forholdene på dannelsen kinetikk av Au norsk sokkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tid løst fotoemisjonsspektrene for Au NCs dannet i (A) HSA ved romtemperatur, (B) HSA ved 60 ° C, og (C) BSA med 6,4 M urea.

Figur 2
Figur 2. HSA-målretting narkotika screening basert på fluorescens intensitet av Au NCs dannet i narkotikabelastede protein maler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

(A) Dannelse kinetikken av Au NCs dannet i (a) ibuprofen-HSA, (b) warfarin-HSA, (c) fenytoin-HSA, (d) sulfanilamid-HSA, og ren HSA (kontroll). (B) fotoemisjonsspektrene for HSA-Au NCs fremstilt ved 60 ° C i nærvær av forskjellige stoffer: (a) ibuprofen-HSA, (b) warfarin-HSA, (c) fenytoin-HSA, (d) sulfanilamid-HSA, og ren HSA (kontroll). (C) Normalisert fotoemisjons intensiteten av HSA-narkotika-Au NCs mot HSA-Au NCs (kontroll). Både spektra og digitale bilder (innfelt av C) ble tatt ved 10 min etter tilsetning av NaOH ved 60 ° C. 36 Gjengitt med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry.

Figur 3
Figur 3. Konsentrasjon avhengig studie av legemiddelmengde på HSA protein.

Fotoemisjonsspek Au NCs dannet i HSA lastet med ibuprofen ved forskjellige konsentrasjoner i en enkelt parti over 10 min av reaksjonstid. 36 Bearbeidet av tillatelse fra The Royal Society of Chemistry.


Figur 4. Bestemmelse av protein-medikament bindingskonstanten fra eksperimentelle data.

K D ibuprofen binding til HSA ble fastsatt basert på de relative fluorescensstyrkene HSA-ibuprofen-Au NCs syntetisert ved 60 ° C med økende mengde narkotika. Den eksperimentelle data ble tilpasset til en enkelt bindingsmodell ved å bruke Michaelis-Menten-ligningen: Y = R max x C / (K D + C), hvor R max indikerer maksimal responssignalet, C er konsentrasjonen av ligand og K D er bindende konstant. 36 Gjengitt med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry.

Tabell 1
Tabell 1. Beregning av relativfluorescensstyrkene Au NCs dannet i protein maler med narkotika av varierende konsentrasjoner.

Relativ fluorescens intensitet [(I 0 - I) / I 0, I og I 0 refererer til fluorescens-intensiteten av Au NCs dannet i medikament-lastet HSA og ren HSA] av Au NCs dannet i HSA lastet med ibuprofen ved forskjellige konsentrasjoner over 10 min reaksjonstid. Prøvenummer xy refererer til y th prøven utarbeidet i x th batch. 36 Bearbeidet av tillatelse fra The Royal Society of Chemistry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det er flere viktige skritt som må fremhevet i denne metoden. I protokollen for screening den relative bindingsaffinitet av forskjellige små molekylære stoffer, trinnene 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 og er avgjørende for å oppnå gode resultater viser gående tendens for den relative binding styrke. I disse trinnene, bør handlingene til tilsette kjemikalier og tegning reaksjons løsninger for måling være så raskt som mulig for å minimere tidsforsinkelsen effekt og samme sekvens av tilsette kjemikalier og tegning reaksjons løsninger for måling skal praktiseres for å sikre konsistens. I protokollen for måling av bindingskonstanten av ibuprofen til HSA, er trinn 3.2.4 meget viktig til suksess for K D måling. Selv om flere konsentrasjonspunkter kan velges, blir tidsforsinkelsen effekt på grunn av flere prøver for å måle dypere. For å minimalisere tidsforsinkelsen effekt, kan syntesen ved forskjellige konsentrasjoner deles inn i flere ulike geografiskent batcher parallelt. I hvert parti, bør en kontroll uten medikament bli inkludert for å sikre konsistens og eliminere eventuelle systemfeil.

I denne videoen er HSA valgt som modell protein å dirigere syntese av fluorescerende Au NCs for narkotika screening. Bare fire forskjellige stoffer, dvs. (a) ibuprofen (b) warfarin, (c) fenytoin, og (d) sulfanilamid blir testet her. Som et spørsmål om faktum, er den nåværende metoden generisk og kan bli endret i flere forskjellige former. Teoretisk kan denne fremgangsmåte anvendes på andre stoffer, små molekyler, slik som steroider, fettsyrer, skjoldbruskkjertelhormoner, og stiftes peptider, forutsatt at disse molekylene kan binde seg til HSA og forbedre stabiliteten av proteinet mot utfolding til en annen grad. Andre proteiner, ikke begrenset til, albuminer slik som HSA og BSA, som vist her, kan også benyttes som det funksjonelle mal for medikamentscreening, så lenge de er i stand til å dirigere syntesen av fluorescerende Au NCs (inclusive av aktive funksjonelle grupper for Au NCs dannelse, for eksempel tyrosinrester) uten at det påvirker narkotikabindingsseter. Selv valget av metall er fleksibel; andre metall NCs slik som Ag NCs kan også brukes som den fluorescerende probe for medikament-screening.

I sammendrag, er aktuell metode enkel, rask og kostnadseffektiv i forhold til andre mer avanserte teknikker som røntgen-krystallografi og NMR for å undersøke protein-interaksjoner. Det krever ingen isotop merking og tillater direkte fluorescerende påvisning av protein-medikament binding i homogen løsning. I denne aktuelle arbeidet har vi vist konseptet ved hjelp av eksempler på stoffet binding for å forbedre proteinstabilitet. Det kan også være mulig å forlenge den nåværende metoden for å screene medikamenter som destabilisere proteiner ved binding som et interessant tema for fremtidige studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (III) chloride solution, 30% Sigma-Aldrich 484385 Corrosive, irritant
Human serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A1887
Bovine Serum albumin, 96% Sigma-Aldrich A2153
Ibuprofen, 98% Sigma-Aldrich I4883 
warfarin, 98% Sigma-Aldrich A2250
phenytoin Sigma-Aldrich PHR1139
sulphanilamide, 99% Sigma-Aldrich S9251
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
urea Sigma-Aldrich U5128
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Magnetic stirrer IKA RT5
Microplate reader Tecan Infinite M200
384-well plate Corning
5 ml air displacement pipette Eppendorf
1,000 μl air displacement pipette Eppendorf
100 μl air displacement pipette Eppendorf
5,000 μl Eppendorf tips
1,000 μl Eppendorf tips
100 μl Eppendorf tips
1.5 ml micro tube Eppendorf
20 ml glass vial with screw cap
4 ml glass vial with screw cap

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
  2. Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis. Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).
  3. Zsila, F. Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model. Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).
  4. Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability. J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).
  5. Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).
  6. Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin. J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).
  7. Dalvit, C., et al. High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments. J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).
  8. Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study. Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).
  9. Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).
  10. Salvi, N., et al. Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States. J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).
  11. Zsila, F. Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin. J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).
  12. Navratilova, I., Hopkins, A. L. Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance. ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).
  13. Wang, Y., et al. Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability. Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).
  14. Lu, Y., Chen, W. Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries. Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).
  15. Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters. Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).
  16. Jin, R. Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters. Nanoscal. 2, 343-362 (2010).
  17. Jiang, D. -e The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond. Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).
  18. Aikens, C. M. Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters. J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).
  19. Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS. ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).
  20. Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).
  21. Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties. J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).
  22. Yu, Y., et al. Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster. J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).
  23. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).
  24. Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters. Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).
  25. Niesen, B., Rand, B. P. Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices. Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).
  26. Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications. Nano Toda. 6, 401-418 (2011).
  27. Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo. Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).
  28. Archana, R., et al. Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging. Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).
  29. Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions. Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).
  30. Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water. 20, 951-1907 (2010).
  31. Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance. J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).
  32. Negishi, Y., et al. Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity. J. Phys. Chem. C. (2015).
  33. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters. J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).
  34. Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility. Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).
  35. Layton, C. J., Hellinga, H. W. Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes. Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).
  36. Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening. Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).
  37. Shortridge, M. D. Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. The University of Nebraska - Lincoln. (2010).
En rask og kvantitativ fluorimetrisk Metode for Protein-Targeting lite molekyl narkotikaundersøkelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., Tan, Y. N. A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening. J. Vis. Exp. (104), e53261, doi:10.3791/53261 (2015).More

Yu, Y., New, S. Y., Lin, J., Su, X., Tan, Y. N. A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening. J. Vis. Exp. (104), e53261, doi:10.3791/53261 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter