Isolering av Viral Replication Fack-berikade underkärn Fraktioner från adenovirus-infekterade Normal humana celler
Summary
We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.
Abstract
During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.
Introduction
Adenovirus innehåller ett dubbelsträngat DNA-genom som replikerar i den infekterade cellkärnan. När viralt DNA in i kärnan, lokaliserar det i anslutning till PML nukleära organ 1. Efter viral tidigt genuttryck, är kärn arkitekturen dramatiskt omorganiseras, inducera bildning av virala mikromiljöer, kallas virusreplikation Fack (RC) 2. Eftersom adenovirus (Ad) RC är platser där virusgenom replikation och uttryck av virala sena gener sker, de ger en miljö för rekrytering av alla nödvändiga virala och cellulära faktorer som deltar i dessa processer. Intressant, en mängd olika cellulära proteiner som är ansvariga för det cellulära antivirala svaret, såsom DNA-skada svaret, det medfödda immunförsvaret och tumörsuppression är adjungerad till dessa virus platser 2. Därför kan Ad RC anses regel nav som främjar en effektiv virusreplikation medan samtidigt regleracellulär antiviralt svar, vilket indikerar att dessa strukturer är nyckeln till förståelsen av virusvärdcellinteraktioner. Ändå, de molekylära mekanismerna för RC bildning, deras sammansättning och därmed förenlig verksamhet är dåligt förstådd.
Adenoviral RC, samt RC från andra DNA-virus som replikerar i kärnan är inte förknippade till membran, i motsats till cytoplasmisk RC 3. Dessutom är dessa virusinducerade strukturerna sannolikt kommer att helt bestå av proteiner och nukleinsyror. RC bildas i celler infekterade med RNA-virus (brukar benämnas virusfabriker) har isolerats, att dra nytta av deras cytoplasmiska lokalisering och membranbundna status, vilket har underlättat deras detaljerade morfologiska, funktionella och biokemisk karakterisering 4.
Såvitt vi vet, har kärn viral RC inte isolerats, kanske på grund av komplexiteten i kärn arkitektur och frånvaro av intranukleär membranes som skulle underlätta deras isolering. Deras studie har förlitat sig i stället på immunfluorescensmikroskopi, FISH och transmissionselektronmikroskop. Trots komplikationer inneboende isolera subnukleära strukturer, andra kärnområden såsom nukleoler och Cajal organ har isolerats före 5,6. Eftersom nukleoler och RC är båda består av proteiner och nukleinsyror, och har en diameter mellan 0,5 till 5 pm, hypotes vi att RC också bör vara möjligt att isolering. Därför, för att mer exakt karakterisera den molekylära sammansättning och funktioner associerade till RC har vi etablerat en ny metod för att isolera subnukleära fraktioner berikade med fjärrstyrning. För detta ändamål, beredda vi under nukleära fraktioner med hjälp hastighetsgradienter och sackaros kuddar liknande metoder som används för att isolera nukleolerna 7 eller andra kärnområden 6 och etablerade ett cellfritt system som tillåter studiet av molekylära sammansättning och tillhörande verksamhetRC. Denna teknik bör därför utveckla förståelsen av virus-värdcellinteraktioner och representerar ett kraftfullt verktyg som även bör underlätta detaljerad analys av RC från andra virus som replikerar i kärnan och inducera bildning av replikationsutrymmena i liknande dimensioner till de som bildas i adenovirus- infekterade-celler, såsom, herpesvirus, papillomavirus eller polyomavirus.
Protocol
Representative Results
Discussion
In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).
Materials
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-036-003 | Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
References
- Doucas, V., et al. Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure. Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).
- Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. Cytoplasmic viral replication complexes. Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).
- Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment. J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).
- Busch, H., et al. Isolation of Nucleoli. Exp Cell Res. 24, 150-163 (1963).
- Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells. Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).
- Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. The nucleolus. J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).
- Groitl, P., Dobner, T. Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants. Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).
- Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein. Virology. 128, 480-484 (1983).
- Leppard, K. N. Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein. J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).
- Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts. J. Virol. 80, 964-974 (2006).
- Castillo-Villanueva, E., et al. The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection. ISRN Virology. 2014, 14 (2014).
- Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter. J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).
- Wright, J., Leppard, K. N. The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53. J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).
