Isolering av Viral Replication Kammer-beriket Sub-atom Fraksjoner fra Adenovirus-infiserte Normal humane celler

Summary

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Abstract

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Introduction

Adenoviruser inneholde en dobbeltkjedet DNA-genom som replikerer i den infiserte cellekjernen. Når det virale DNA kommer inn i kjernen, lokaliserer det ved siden av PML ^{kjernelegemene} 1. Etter viral tidlig genuttrykk, er kjernearkitektur dramatisk omlegging, indusere dannelsen av virus microenvironments, kalt viral replikasjon avdelinger (RC) ^2. Siden adenovirus (Ad) RC er områder hvor viral genom replikering og uttrykk av virale sene gener finner sted, gir de et miljø for rekruttering av alle nødvendige viral og cellulære faktorer som deltar i disse prosessene. Interessant, et utvalg av cellulære proteiner som er ansvarlig for den cellulære antiviral respons, slik som DNA-skade reaksjon, den medfødte immunrespons og tumorundertrykkelse er co-valgt til disse virale områdene ^2. Derfor kan Ad RC anses regulatoriske huber som fremmer effektiv virusreplikasjon, mens samtidig regulerercellulær antiviral respons, noe som indikerer at disse strukturer er nøkkelen til forståelse av virus-vertscelleinteraksjoner. Likevel, de molekylære mekanismene for RC formasjon, sammensetning og tilhørende aktiviteter er dårlig forstått.

Adenoviral RC, samt RC fra andre DNA-virus som replikerer i kjernen ikke er knyttet til membraner, i motsetning til cytoplasmisk RC ^3. Videre disse virus-induserte strukturer er sannsynlig å være sammensatt utelukkende av proteiner og nukleinsyrer. RC dannet i celler infisert med RNA-virus (vanligvis kalt viral fabrikker) er blitt isolert, dra nytte av deres cytoplasma lokalisering og membranbundne status, som har tilrettelagt sine detaljert morfologiske, funksjonelle og biokjemisk karakterisering ^fire.

Så vidt vi vet, har atom viral RC ikke blitt isolert, kanskje på grunn av kompleksiteten i den kjernefysiske arkitektur og fravær av intranuclear membranes som ville letter deres isolasjon. Deres studie har støttet seg i stedet på immunfluorescens mikroskopi, FISH og transmisjonselektronmikroskopi. Men til tross for komplikasjoner iboende å isolere subnuclear strukturer, andre atom domener som nucleoli og Cajal Bodies har vært isolert før ^5,6. Siden nucleoli og RC begge er sammensatt av proteiner og nukleinsyrer, og har en diameter på mellom 0,5 – 5 um, har vi antatt at RC må også være mottagelig for isolasjon. Derfor, for å mer nøyaktig karakterisere den molekylære sammensetning og funksjon er knyttet til RC, etablerte vi en ny metode for å isolere subnuclear fraksjoner anriket med fjernstyring. For dette formål ble det fremstilt sub-atomfraksjoner ved hjelp av hastighetsgradienter og sukrose puter som ligner på fremgangsmåter som brukes for å isolere nucleoli ⁷ eller andre kjerne domener ⁶ og etablert et cellefritt system som gjør det mulig å studere de molekylære sammensetning og tilhørende aktiviteter avRC. Denne teknikken bør derfor fremme forståelsen av virus-vertscellereaksjoner og representerer et kraftig verktøy som bør også legge til rette for detaljert analyse av RC fra andre virus som kopierer i kjernen og indusere dannelsen av replikering avdelinger av lignende dimensjoner til de som dannes i adenovirus- -infiserte celler, så som herpesvirus, papillomavirus eller polyomaviruses.

Protocol

1. HFF Cell Kultur og Ad-infeksjon Forplante Ad5 WT virus i monolag av HEK-293 celler og titer som fluorescerende forming units (FFU) på HFF celler som beskrevet tidligere åtte. Vokse Humant forhudsfibroblaster (HFF) i 10 ml DMEM / 10% føtalt bovint serum (FBS) i sterile kultur 100 mm skåler ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig inkubator. Bestem celle nummer ved hjelp av en Neubauer kammer ved å telle celler i de fire 16-kvadrat sett. Celletallet pr ml ble oppnådd ved å ber…

Representative Results

Siden virale replikasjons kamre (RC) er subnuclear viral-induserte strukturer som består av proteiner og nukleinsyrer, i likhet med andre kjerne domener, viste de seg å være mottagelig for isolering ved hastighetsgradienter basert på biokjemiske egenskaper. Kritiske trinn i fraksjoneringen protokollen er illustrert i figur 1. På hvert trinn prøvene må overvåkes ved lysfelt-mikroskopi for å sikre integriteten av de forskjellige sub-cellulære fraksjoner. For eksempel, når hevelse cellene, må i…

Discussion

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…

Materials

DMEM	Gibco	12100-046	Warm in 37 ºC water bath before use
Fetal Bovine Serum	Gibco	12484-028
Sucrose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC
Dounce homogenizer	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ultrasonic Bath	Branson	Z769533 SIGMA	Turn on 15 min before use.
Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-036-003	Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk
Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21121	Use at a 1:2,000 dilution in PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Open in a laminar flow cabinet
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Pierce ThermoScientific	34080