Adenovirus संक्रमित सामान्य मानव कोशिकाओं से वायरल प्रतिकृति कम्पार्टमेंट समृद्ध उप-परमाणु भागों का अलगाव
Summary
We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.
Abstract
During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.
Introduction
Adenoviruses संक्रमित कोशिका के नाभिक में replicates एक डबल असहाय डीएनए जीनोम होते हैं। वायरल डीएनए नाभिक में प्रवेश करती है, यह पीएमएल परमाणु निकायों 1 से सटे localizes। वायरल जल्दी जीन अभिव्यक्ति के बाद परमाणु वास्तुकला नाटकीय रूप से कहा जाता है, वायरल microenvironments के गठन के उत्प्रेरण, पुनर्गठित किया है वायरल प्रतिकृति डिब्बों (आरसी) 2। एडीनोवायरस (विज्ञापन) आर सी वायरल जीनोम प्रतिकृति और वायरल देर जीनों की अभिव्यक्ति जगह ले जहां साइटों रहे हैं, वे इन प्रक्रियाओं में भाग लेने कि सभी आवश्यक वायरल और सेलुलर कारकों की भर्ती के लिए एक वातावरण प्रदान करते हैं। दिलचस्प है, इस तरह के डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया के रूप में सेलुलर एंटीवायरल प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार सेलुलर प्रोटीन की एक किस्म, सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ट्यूमर दमन सहयोजित इन वायरल साइटों से 2 हैं। समन्वित रूप से विनियमित करने, जबकि कुशल वायरल प्रतिकृति को बढ़ावा देने कि इसलिए, विज्ञापन आरसी माना जा सकता है विनियामक केन्द्रोंइन संरचनाओं वायरस मेजबान सेल बातचीत की समझ के लिए महत्वपूर्ण हैं यह दर्शाता है कि सेलुलर एंटीवायरल प्रतिक्रिया,। फिर भी, आर सी के गठन के आणविक तंत्र, उनकी संरचना और संबद्ध गतिविधियों खराब समझ रहे हैं।
नाभिक में दोहराने कि अन्य डीएनए वायरस से adenoviral आरसी, साथ ही आर सी साइटोप्लास्मिक आर सी 3 के विपरीत, झिल्ली के लिए नहीं जुड़े रहे हैं। इसके अलावा, इन वायरस प्रेरित संरचनाओं प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की पूरी तरह से बना होने की संभावना है। आरएनए वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में गठित आर सी अपने विस्तृत रूपात्मक, कार्यात्मक और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन 4 में मदद की है, जो उनके साइटोप्लास्मिक स्थानीयकरण और झिल्ली बाध्य स्थिति का लाभ लेने, पृथक किया गया है (आमतौर पर वायरल कारखानों कहा जाता है)।
हमारे ज्ञान करने के लिए, परमाणु वायरल आर सी शायद कारण intranuclear मीटर की परमाणु वास्तुकला और अभाव की जटिलता के लिए, अलग-थलग नहीं किया गया हैउनके अलगाव की सुविधा होगी कि embranes। उनके अध्ययन के बजाय immunofluorescence माइक्रोस्कोपी, मछली और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पर भरोसा है। हालांकि, subnuclear संरचनाओं को अलग-थलग करने के लिए निहित जटिलताओं के बावजूद इस तरह के nucleoli और Cajal निकायों के रूप में अन्य परमाणु डोमेन 5,6 से पहले अलग-थलग कर दिया गया है। Nucleoli और आर सी दोनों प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड से बना है, और 0.5 के बीच एक व्यास कर रहे हैं के बाद से – 5 माइक्रोन, हम आर सी भी अलगाव के लिए उत्तरदायी होना चाहिए कि धारणा। इसलिए, और अधिक ठीक आर सी के लिए जुड़े आणविक संरचना और कार्यों को चिह्नित करने के क्रम में, हम आर सी के साथ समृद्ध subnuclear अंशों को अलग-थलग करने के लिए एक उपन्यास विधि की स्थापना की। यह अंत करने के लिए, हम nucleoli 7 या अन्य परमाणु डोमेन के 6 अलग करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं के समान वेग ढ़ाल और सुक्रोज तकिये का उपयोग करके उप-परमाणु अंशों तैयार किया है और आणविक संरचना के अध्ययन और संबंधित गतिविधियों की अनुमति देता है कि एक सेल मुक्त प्रणाली की स्थापनाआर सी। इस तकनीक को इसलिए वायरस मेजबान सेल बातचीत की समझ अग्रिम और भी नाभिक में दोहराने कि अन्य वायरस से आर सी का विस्तृत विश्लेषण की सुविधा और adenovirus- में गठन उन लोगों के लिए इसी तरह के आयामों की प्रतिकृति डिब्बों के गठन को प्रेरित करना चाहिए कि एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करना चाहिए इस तरह, herpesviruses, papillomaviruses या polyomaviruses के रूप में संक्रमित कोशिकाओं,।
Protocol
Representative Results
Discussion
In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) and Promep-SEP for R.A.G.; P.H. received a scholarship from CONACyT (447442).
Materials
| DMEM | Gibco | 12100-046 | Warm in 37 ºC water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12484-028 | |
| Sucrose, Ultra Pure | Research Organics | 0928S | Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC |
| Dounce homogenizer | Kontess Glass Company | 884900-0000 | |
| Branson 1800 Ultrasonic Bath | Branson | Z769533 SIGMA | Turn on 15 min before use. |
| Peroxidase AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-036-003 | Use at a 1:10,000 dilution in PBS/0.03% non-fat milk |
| Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21121 | Use at a 1:2,000 dilution in PBS |
| Silane-Prep Slides | Sigma | S4651-72EA | Open in a laminar flow cabinet |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce ThermoScientific | 34080 |
References
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