Summary
Este protocolo utiliza técnicas de análisis y proyección de imagen (3D) tridimensionales para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Las técnicas son aplicables a otras situaciones donde una señal fluorescente se utiliza para aislar un subconjunto de los datos de otra señal fluorescente.
Abstract
El objetivo de este protocolo es estudiar las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidermal. Por lo tanto, se desarrollaron técnicas de análisis y proyección de imagen 3D para aislar mitocondrias nerviosas específicas y evaluar alteraciones inducidas por la enfermedad de las mitocondrias en el extremo distal de los nervios sensitivos. El protocolo combina fluorescencia inmunohistoquímica, microscopia confocal y técnicas de análisis de imagen en 3D para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Parámetros detallados se definen a través de los procedimientos con el fin de ofrecer un ejemplo concreto de cómo utilizar estas técnicas para aislar mitocondrias del nervio específico. Anticuerpos se utilizaron para etiqueta del nervio y señales mitocondriales dentro de secciones del tejido de la piel del sacador biopsias, que fue seguido por inmunofluorescencia indirecta para visualizar los nervios y las mitocondrias con una señal fluorescente verde y roja respectivamente. Se adquirieron imágenes de serie Z con microscopia confocal y análisis 3D fue utilizado para procesar y analizar las señales. No es necesario seguir los parámetros exactos descritos dentro, pero es importante ser coherentes con los elegidos a lo largo de la tinción, adquisición y análisis de los pasos. La fuerza de este protocolo es que es aplicable a una variedad amplia de circunstancias donde una señal fluorescente se utiliza para aislar otro tipo de señales que de otro modo sería imposible estudiar solos.
Introduction
Las mitocondrias sirven funciones celulares vitales que incluyen la producción de energía celular, buffer de calcio y regulación necrosis y apoptosis celular muerte1,2,3. El sistema nervioso tiene una tasa metabólica alta en comparación con el cuerpo4 , lo que sugiere que las neuronas generan un alto grado de energía celular en forma de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la respiración mitocondrial. Muchos documentos de evidencia que las funciones neuronales dependen de ATP5, especialmente en las sinapsis6. Por lo tanto, es importante la distribución de las mitocondrias dentro de las neuronas.
En los últimos 10 años que una gran cantidad de información ha demostrado que la trata y acoplamiento de las mitocondrias neuronales se regula altamente. Proteínas motoras están implicadas en la distribución de las mitocondrias a compartimentos celulares específicos a lo largo de la neurona. Trata de las mitocondrias es particularmente importante porque las neuronas proyecto axones y las dendritas del soma. Proteínas motoras quinesina dirigen principalmente anterógrada (de soma) trata de mitocondrias a lo largo de los microtúbulos y dineína proteínas motoras directas motilidad retrógrada (hacia el soma)7,8,9 , 10. hay señales celulares tal potencial de membrana mitocondrial y conducción de los impulsos que influyen en la presencia y dirección de mitocondrial tráfico11,12,13.
Además de transportar las mitocondrias, hay proteínas especializadas para localizar las mitocondrias a compartimentos celulares específicos que tienen las demandas de alta energía, tales como nodos de Ranvier y las sinapsis8,14, 17. de hecho, la mayoría de las mitocondrias dentro de axones son no-motile9,13,18. Proteínas especializadas como mitocondrias de anclaje syntaphilin a microtúbulos a lo largo de axones mientras que otras proteínas de anclaje las mitocondrias a la actinia citoesqueleto19–21. Iones como el calcio y factores de crecimiento se han divulgado para apoyar la cesación del movimiento de las mitocondrias para localizar a las regiones donde son necesarios21,22,23.
Tomados en conjunto, la trata y acoplamiento de las mitocondrias son vitales para el funcionamiento correcto de las neuronas. En apoyo de esto, interrupción en el tráfico mitocondrial se ha asociado con varias enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Huntington, espástica hereditaria paraparesia y atrofia óptica15,24,25,26,27. Estudios recientes se han centrado en la patología y disfunción mitocondrial como un mecanismo potencial para la neuropatía diabética, la pérdida sensorial asociada con diabetes28,29,30,31 ,32,33. La hipótesis es que la diabetes altera la distribución de las mitocondrias dentro de las proyecciones sensoriales del conclusión de nervio cutáneo. Por lo tanto, se desarrolló una técnica para visualizar y cuantificar las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas de intraepidermal (IENFs), las extremidades distales de los aferentes sensoriales del ganglio de raíz dorsal. La técnica combina fluorescencia inmunohistoquímica específica mitocondrial y etiquetas fibra de nervio con microscopia confocal de la serie z adquisición de señales con software de análisis de imagen en 3D de gran alcance para medir la distribución del nervio específico mitocondrias de las biopsias del sacador cutáneo humano para lograr este objetivo.
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Protocol
las biopsias del sacador de la piel fueron obtenidas de sujetos que fueron reclutados de una red de gran atención primaria comunitaria en el centro de Diabetes de la Universidad de Utah (Salt Lake City, UT). Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Michigan y el cumplimiento de los principios de la declaración de Helsinki. Se obtuvo consentimiento informado de cada sujeto antes de la prueba por escrito.
1. inmunohistoquímica de fluorescencia
- preparar las biopsias del sacador de intraepidermal fibra nerviosa inmunohistoquímica:
- piel de 3 mm realizar biopsias por médico personal y la biopsia todo en 1.5 mL Zamboni ' s solución de fijación (2% paraformaldehído, 0.3% saturada de ácido pícrico en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4) a 4 ° C durante la noche.
- Lavar las muestras con una solución de sacarosa al 30% en PBS a 4 ° C durante 16-24 h o hasta que la muestra se hunde.
- Muestras de incrustar en la temperatura óptima de corte compuesto (OCT) utilizando un cryomold. La biopsia de 3 mm todo con la epidermis hacia abajo en el molde y llenar el molde con aproximadamente 2 mL de octubre congelar el molde en hielo seco. Tienda a-80 ° C hasta que esté listo para usar.
- Corte de 50 μm de espesor con un criostato cortes transversales y almacena en los pocillos de una placa de 96 pozos utilizando como solución de almacenamiento de información de anticongelante de 180 μl por pocillo (30% de etilenglicol, glicerol 30% en PBS). Las siguientes instrucciones son para 8 pocillos de una placa bien 96. Mancha de las secciones de cada sitio de la biopsia que son 200-300 μm de uno al otro.
día 1:
- saciar no específicas de etiquetado del corneum del estrato:
- placa de etiqueta de 96 pocillos como se muestra en la figura 1.
- Pipetear 150 μL de solución de potenciador de señal común para reducir el atascamiento no específico de anticuerpos secundaria 34 , 35 en cada pozo. Transferencia de secciones en la solución de potenciador de señal utilizando un asa de inoculación.
Nota: tenga cuidado al trabajar con el tejido para evitar daño o desgarro de las secciones de tejido. Mantener en la solución de potenciador de señal durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rocker plano. - Preparar enjuague pozos en las filas 2 y 3 de la placa de 96 pocillos añadiendo 150 μL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) en cada pocillo.
- Transferir cuidadosamente las secciones en la fila 2 y enjuague de PBS 1 x durante 10 min a temperatura ambiente.
- Enjuague una segunda vez en PBS 1 x durante 10 min a temperatura ambiente (fila 3).
- Prepare 5% albúmina de suero bovino (BSA) bloqueo de solución:
- Prepare 5 bloqueo de solución que contiene 5% de BSA y 0,3% de Triton X 100 (TX-100) en 0.1 M PBS (ver tabla 1) mientras que las secciones están incubando en solución de potenciador de señal. BSA no va en la solución fácilmente. Solución de Vortex hasta que BSA se disuelva completamente.
- Preparar bloqueo pozos en fila 4 de la placa de 96 pocillos, agregar 150 μL de BSA 5% bloquea la solución en cada pocillo.
- Transferencia de secciones en pocillos individuales de BSA 5% solución de bloqueo e incubar secciones en 5% BSA bloqueo solución para 1-2 h a temperatura ambiente en un rocker plano.
- Preparar BSA 1% Enjuague solución y la dilución de anticuerpos primarios:
- Prepare 1% solución de enjuague que contiene 1% de BSA y 0.3% TX-100 en 0.1 M PBS (ver tabla 2) mientras que las secciones son Incubar en la solución al bloqueo 5% BSA. BSA no va en la solución fácilmente. Solución de Vortex hasta que BSA se disuelva completamente.
- Diluir anticuerpos primarios en solución de enjuague de BSA 1% mientras que las secciones están incubando en solución al bloqueo 5% BSA.
- 1.500 μl de solución de anticuerpo primario y añadir a cada uno en fila 5.
- Diluir los anticuerpos primarios: Utilice la etiqueta específica del nervio, conejo policlonales anti-proteína gen producto 9.5 (PGP9.5) a 1:1, 000. Use la etiqueta específica de las mitocondrias, el ratón anticuerpos de E2/E3bp monoclonal anti-piruvato deshidrogenasa (PDH) a 1: 100 en 1% de BSA enjuague solución.
- Anticuerpo primario preparación:
- Pipetear 150 μL de anticuerpo primario en cada bien en la fila 5 de la placa de 96 pozos.
- Con la herramienta lazo, transferencia de secciones de la solución de bloqueo (fila 4) en la fila que contiene el anticuerpo primario de 5.
- Envolver la placa firmemente con parafilm para evitar que se sequen.
- Colocar las muestras en el plano del eje de balancín a temperatura ambiente durante 1 h y luego incubar las muestras a 4 º c en un plano del eje de balancín durante una noche.
día 2:
- enjuagar las muestras:
- preparar pozos de enjuague en las filas 6, 7 y 8 de la placa de 96 pocillos añadiendo 150 μL de BSA 1% Enjuague solución en cada pocillo.
- Transferencia de secciones en la primera solución de enjuague BSA 1% (fila 6) e incubar 1 h a temperatura ambiente. Repita el enjuague dos veces más por incubación de las secciones de BSA 1% solución de enjuague en las filas 7 y 8 de 1 h a temperatura ambiente.
- Diluir los anticuerpos secundarios en BSA 1% Enjuague solución:
- hacer 1.500 μl de solución de anticuerpo secundario mientras que las secciones están incubando en el último aclarado de BSA 1% Enjuague solución (fila 8).
- Diluir anticuerpos secundarios: para PGP9.5 (anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado fluorescente verde, 1: 1000), de la PDH (rojo fluorescente conjugado cabra anti-ratón, 1:1, 000) en el 1% de BSA enjuague solución.
- Preparación de anticuerpo secundario:
- Pipetear 150 μL del anticuerpo secundario en fila 9 de la placa de 96 pozos.
- Suavemente, transferir las secciones de 1% de BSA enjuague solución (fila 8) en los pocillos de anticuerpo secundario (fila 9).
- Con parafilm, envolver la placa firmemente para evitar que se sequen. Cubrir con papel de aluminio. Coloque las muestras en el plano del eje de balancín a temperatura ambiente durante 1 h y luego incubar las muestras a 4 ° c en un plano del eje de balancín durante una noche.
día 3:
- preparación limpiar 1 x PBS por filtración a través de un filtro de 0,22 μm:
- Pipetear 150 μL del filtrado 1 x PBS en fila 10, 11 y 12.
- Transferencia de muestras a fila 10 y enjuague de 1 x PBS por 1 h a temperatura ambiente. Cubra la placa de 96 pocillos con papel de aluminio y coloque en un plano del eje de balancín durante el enjuague. Repetir filtrada 1 x enjuague de PBS dos veces más durante 1 h a temperatura ambiente en las filas 11 y 12.
- Preparar portaobjetos para el montaje de las secciones de tejido:
- depositar 50 μl de filtrado 1 x PBS en una diapositiva.
- Sección de transferencia de 1 x PBS (fila 12) en los años 50 μl de la gota. Coloque la sección en la gota de PBS por desplegar el tejido y lo aplana suavemente el portaobjetos de vidrio. Retire el exceso PBS con una pipeta de vidrio para evitar diluir el reactivo de montaje. No toque las secciones con el bulbo de cristal.
- Pipeta de 1 - 2 gotas de reactivo de montaje con DAPI directamente encima de la sección de la diapositiva del microscopio usando con cuidado para no perturbar la orientación de la sección. Coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio de 50 mm x 24 mm #1.5 microscopio sobre la sección de.
- Eliminar cualquier burbuja de aire que se formaron mientras coloca el cubreobjetos y limpie el exceso de líquido fuera de los bordes del cubreobjetos. Preparar una diapositiva nueva y repetir el montaje prOcess para cada sección.
- Cura seco los medios de montaje colocando las diapositivas en la oscura noche a temperatura ambiente. Transfiera los portaobjetos a 4 ° C para a corto plazo (1-2 semanas) o a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo (más de 2 semanas).
Nota: Controles negativos omitieron anticuerpos primarios para PGP9.5 o PDH en paso 1.4.2.2 y no muestran distinguible etiquetado de nervios o de las mitocondrias en la epidermis. Se realizan controles positivos para la PDH anticuerpo para probarlo etiquetas todas las mitocondrias (datos no mostrados). Los controles positivos fueron realizados en cultivo primario de ratón raíz dorsal ganglio las neuronas que fueron transduced con un baculovirus a las mitocondrias de la etiqueta con una señal de la proteína fluorescente verde (GFP) fijas y teñidas con el anticuerpo de la PDH y rojo fluorescente anticuerpo secundario. Todas las mitocondrias que fueron expresando GFP se co etiquetadas con la etiqueta roja para PDH immunohistochemistry (datos no mostrados).
2. Proyección de imagen confocal
- realizar proyección de imagen confocal:
- recoger imágenes utilizando un láser de barrido confocal microscopio con 40 X objetivo de inmersión en aceite (1.25 apertura numérica (N.A.)) en un microscopio invertido.
- En cada plano focal secuencialmente adquirir señales fluorescentes:
núcleos: excitación λ = 405 nm, emisión espectral filtro λ = 420-480 nm
fibras nerviosas: excitación λ = 488 nm, emisión espectral filtro λ = 505-560 nm
Mitoch Ondria: excitación λ = 543 nm, emisión espectral filtro λ = 606-670 nm
- En cada plano focal secuencialmente adquirir señales fluorescentes:
- especifique los siguientes parámetros de análisis en el software del microscopio: frecuencia de barrido de 600 Hz con un promedio de marco 2 y zoom de 2.2; resolución de intensidad 12 bits (4096 gris niveles).
- Configure el software del microscopio para optimizado resolución lateral (scan resolución = 1.024 x 1.024) y seccionamiento óptico y resolución axial (abertura confocal = 1 unidad de airy (AU) con tamaño de paso z de 210 nm).
Nota: La resolución resultante de XYZ es 172.2 nm x 172.2 nm nm x 210 con un tamaño de imagen de 176.1 μm x 176.1 μm x 30 a 50 μm.
- Configure el software del microscopio para optimizado resolución lateral (scan resolución = 1.024 x 1.024) y seccionamiento óptico y resolución axial (abertura confocal = 1 unidad de airy (AU) con tamaño de paso z de 210 nm).
- Activar un escaneado de la señal del nervio (verde-fluorescencia) y ajuste el control de foco de z para encontrar y para fijar la parte superior e inferior planos focales en el software del microscopio que abarcan la señal del nervio dentro de la sección del tejido. La gama total de z es normalmente 30-50 μm para una sección de tejido de 50 μm.
- Gire el campo de análisis con el software del microscopio durante un escaneado para que la epidermis se coloca horizontalmente o verticalmente en la imagen.
- Escanear cada señal por separado y ajustar el detector (tubo fotomultiplicador, PMT) tensión y desplazamiento a minimizar o quitar cualquier sobre y debajo de pixeles saturados.
Nota: Tiempos de la exploración con los parámetros anteriores toman aproximadamente 20-40 minutos dependiendo del número de cortes z.
- recoger imágenes utilizando un láser de barrido confocal microscopio con 40 X objetivo de inmersión en aceite (1.25 apertura numérica (N.A.)) en un microscopio invertido.
3. visualización en 3D y análisis de las mitocondrias dentro de fibras de nervio humano Intraepidermal
- aislar la epidermis 3D:
- duplicar la imagen original y utilizar la máxima intensidad proyección (ver enfoque extendido) de la imagen para identificar y aislar la epidermis.
- Utilizar una región de herramienta de interés para trazar a lo largo de los bordes superiores e inferiores de la epidermis para eliminar áreas no deseadas como la capa córnea y la dermis que están ausentes de las fibras nerviosas intraepidermal. Cultivo para esta selección.
- Deconvolución de uso en el nervio y señales fluorescentes mitocondriales:
Nota: deconvolución ayuda a restaurar la integridad de las señales fluorescentes. La restauración en este protocolo se llama deconvolución ciega porque utiliza las señales fluorescentes en las imágenes para determinar cuánto difundir las señales de su fuente original (extensión de punto de función). El proceso mejora señal resolución reasignando la señal propagación hacia su lugar de origen.- Calcular un punto extendido función (PSF) para la señal del nervio fluorescente verde (verde-fluorescencia) con los parámetros siguientes:
- sistema PSF calculada confocal. Establecer índice de refracción medio en apertura numérica y 1.515 a 1.25. Sistema agujero de alfiler del detector a 1 unidad de Airy (A.U.). La longitud de onda de excitación láser set a longitud de onda nm y emisión 488 a 515 nm.
- Calcular una PSF para la señal mitocondrial fluorescente rojo (rojo-fluorescencia) con los parámetros siguientes:
- conjunto calculado PSF confocal. Establecer índice de refracción medio en apertura numérica y 1.515 a 1.25. Sistema de agujero de alfiler del detector a 1 AU. La longitud de onda de excitación láser set a 543 nm y emisión de longitud de onda de a 617 nm.
- Optimizar las señales fluorescentes del nervio y las mitocondrias por deconvolución usando el PSFs correspondientes mencionadas y la característica de restauración iterativo fijan en 100% de confianza y un límite de 10 ciclos de iteración.
- Calcular un punto extendido función (PSF) para la señal del nervio fluorescente verde (verde-fluorescencia) con los parámetros siguientes:
- Crear superficies específicas del nervio:
- uso el " crear superficie " herramienta para hacer una superficie sólida de los nervios de la verde fluorescente deconvolved secundario etiquetado de la PGP9.5 identificado nervios.
- Desactive el " suave " cuentan y utilice la función de la intensidad absoluta para fijar el umbral de la señal del nervio ya que es considerablemente más brillante que la fluorescencia del fondo.
- Utilizar la función de intensidad absoluta para fijar el umbral de la señal del nervio ya que es considerablemente más brillante que la fluorescencia del fondo. Valor de umbral bajo para identificar con precisión los nervios.
- Filtro hacia fuera de superficies pequeñas, no del nervio según tamaño.
Nota: Si es necesario, editar manualmente a superficies no-nerviosas adicionales dentro de la " edición " ficha por manteniendo pulsada la tecla CONTROL para seleccionar varios objetos y luego eliminarlos con la tecla Supr.
- Aislado del nervio específico señal mitocondrial fluorescente:
- Seleccione la ficha editar de la superficie del nervio para ver la " propiedades de máscara " característica. La superficie del nervio creada en pasos 3.3 se utiliza para aislar mitocondrias dentro de esos nervios de señales mitocondriales asociadas con los keratinocytes.
- Como la " máscara todos ' botón se abre un " canal de máscara " ventana, elija la señal fluorescente rojo deconvolved desde el menú desplegable " selección de canal " para la señal mitocondrial.
- Haga clic en el cuadro para poner una marca de verificación el " canal duplicado antes de aplicar la máscara de " opción. Botón
- clic en el radio en frente de la " constante interior/exterior " opción de la configuración de máscara y haga clic en el cuadro para poner una marca de verificación en la " Set voxel fuera de la superficie a " opción y tipo en 0.00 para el valor. Botón haga clic en Aceptar para crear el nuevo canal que representa señales mitocondriales dentro de la superficie del nervio.
- Crear superficies específicas de las mitocondrias:
- uso el " crear superficie " herramienta para hacer una superficie sólida de la mitocondria del recién creado canal fluorescente de las señales mitocondriales específicas del nervio de pasos 3.4.
- Desmarcar la " lisa " cuentan y seleccionar el " fondo resta " característica para establecer el umbral. Esta característica utiliza contraste local alrededor de la señal mitocondrial para identificar mitocondrias de fondo.
- Conjunto de valor lo suficientemente bajo como para identificar con precisión las mitocondrias. En este ejemplo el umbral inferior fue fijado en 2.000 para una escala de 16 bits (65.536).
- Filtro de superficie mitocondrial basado en el tamaño. En este ejemplo que el límite de voxel se estableció en 1,0 vóxeles, que es el más bajo límite posible. Si es necesario, editar de forma manual a las superficies no mitocondrias dentro de la " edición " ficha manteniendo la tecla CONTROL para seleccionar varios objetos y luego eliminarlos con la tecla Supr.
Nota: En ocasiones, el software creará las superficies que no están asociadas con una señal mitocondrial fluorescente distinguible. En estos casos, es posible quitar con la " editar " ficha
- Exportación y calcular los valores morfométricos para el análisis:
- exportar valores de nervio y superficies mitocondriales de la " estadísticas " ficha para su posterior análisis con el software de hoja de cálculo electrónica.
- Exportar los valores de volumen para el nervio y superficies mitocondriales.
- Cuenta el número de fibras nerviosas individuales presentes en cada imagen y registre el valor en la hoja de cálculo electrónica.
- Para cada imagen, calcular los siguientes valores posibles para el análisis en la hoja de cálculo electrónica:
- Resumen los volúmenes para todas las superficies del nervio.
- Filtro hacia fuera las superficies mitocondriales específica del nervio debajo de un volumen de menos de 0,02 μm 3 y bin las superficies por tamaño. Por ejemplo, utilizar recipientes como 0.02 - 0.04 0.04 - 0.08 0.08 - 0.16, 0.16 - 0.32, 0.32 - 0.64, 0.64 - 1.28, 1,28 2,56, superior a 2.56 μm 3.
Nota: El límite inferior de volumen mitocondrial se estableció en 0.02 μm 3 basado en volúmenes anteriormente publicados de mitonchodria 36 , 37 , 38. - Cuenta el número de superficies mitocondriales del nervio específico dentro de cada compartimiento y el número total de las superficies sobre las papeleras (0.02 - mayor de 2.56 μm 3).
- Calcular la proporción de superficies mitocondriales del nervio específico en cada compartimiento. Utilice la cuenta por dividido por el número total de las superficies de las mitocondrias de bin.
- Suma de los volúmenes de todas las superficies de nervio específico mitocondriales.
- Calcular la proporción del nervio con señal mitocondrial dividiendo el volumen superficial nervio total por la suma de los volúmenes de superficie mitocondriales.
- Calcular el número de mitocondrias por volumen del nervio dividiendo el volumen de superficie total del nervio por la cuenta de todas las superficies mitocondriales.
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Representative Results
Visualización y cuantificación de las mitocondrias dentro de IENFs humanos
Inmunohistoquímica de fluorescencia permite la rotulación simultánea de múltiples señales en las biopsias de la piel humana para visualizar los nervios, las mitocondrias y núcleos. Una placa de 96 pocillos es una manera conveniente de organizar los pasos en el procedimiento de inmunohistoquímica. La figura 1 muestra esta configuración es responsable hasta 8 secciones para ser procesadas a través de las 12 etapas de soluciones. El método flotante combinado con agitación suave con un rocker plano asegura que los anticuerpos tengan acceso suficiente para penetrar en las secciones de ambos lados. El protocolo tiene 3 días para completar, que es en gran parte debido a la noche incubaciones en anticuerpos primarios y secundarios a 4 ° C, que etiqueta constantemente de los nervios y las mitocondrias.
El resto del procedimiento incorpora la proyección de imagen, procesamiento y análisis de las señales fluorescentes. Microscopía confocal aprovecha las señales fluorescentes sección ópticamente señales discretas desde el plano focal mediante la eliminación de las señales fuera de enfoque. Adquisición de serie z a través de la sección de tejido proporciona una representación 3D de las señales fluorescentes para los nervios, las mitocondrias y núcleos. Se optimizan los parámetros de imagen 172 μm a lo largo de la longitud de la epidermis que incluya un promedio de 5 nervios. La figura 2 ilustra una típica imagen en 3D de las tres señales fluorescentes que se recogen de la epidermis. PGP9.5 tinción (figura 2B) proporciona una señal rica de los nervios cutáneos y epidérmicos que es de una intensidad más alta que la auto-fluorescencia del fondo del tejido. La tinción nuclear (figura 2) ayuda a identificar los límites de la epidermis donde inervan las fibras del nervio de intraepidermal. Es común que la capa externa de la epidermis que tiene una señal difusa que puede ser debido a ADN residual en los corneocytes que conforman el estrato córneo. Las mitocondrias están claramente marcadas por la PDH tinción (Figura 2D) donde la mayoría de la señal se asocia a células en la epidermis que son principalmente de queratinocitos.
Los parámetros de adquisición descritos en el presente Protocolo utilizan un 40 X objetivo de inmersión de aceite con una apertura numérica de 1.25 y un factor de zoom de 2.2. Esto resulta en un tamaño de imagen XYZ de 176.1 μm x 176.1 μm x 30 a 50 μm. Esta configuración captura suficiente de la epidermis con un promedio de 4 a 6 fibras nerviosas por la imagen (Figura 3A). Muestreo en mayor resolución reduciría el número de nervios en cada imagen. Figura 3B muestra un factor de zoom de 3.3, que reduce la zona XY a 114,8 μm x 114,8 μm, dando por resultado menos nervios por imagen. La densidad de muestreo ideal definido por Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) para un 40 x objetivo de inmersión de aceite con una apertura numérica 1.25 sugiere una resolución de escaneo XYZ de 54 nm x 54 nm x 205 nm. Esto requiere un factor de zoom del doblez 6.6 resolución de 1.024 x 1.024 y reducir la vista XY a 57,4 μm x 57,4 μm y sólo capturar un promedio de 1-2 nervios por imagen (figura 3).
La siguiente fase es realizar el procesamiento de imagen para eliminar no deseados de las regiones de la imagen y para mejorar las señales. En este protocolo la dermis y la capa córnea se eliminan para enfocar el análisis en la región de la epidermis donde inervan el IENFs. Software tridimensional permite aislar, mejorar y analizar las señales fluorescentes. Herramientas dentro del software son necesarias para aislar el nervio epidérmico y mitocondrias por cultivo a regiones por encima y por debajo de la epidermis (Figura 4A-C). Este proceso es simplificado por desplomarse las señales en una vista ampliada y luego trazar una región a mano alzada alrededor de la epidermis. La imagen recortada es más procesada por algoritmos de restauración de la imagen. Deconvolución se utiliza para optimizar la resolución de los nervios y señales mitocondriales (figura 4).
La fase final es detectar y extraer características morfométricas de las señales. Un aspecto importante de este protocolo es medir características de las mitocondrias del nervio específico. Software de análisis de imagen tiene características que utilizan superficies creadas para una señal (en este caso la superficie del nervio) como una herramienta de enmascaramiento para aislar otra señal fluorescente (en este caso las mitocondrias) dentro de esa superficie. El primer paso en el análisis de las mitocondrias del nervio específico es crear superficies 3D alrededor de los nervios (figura 5A-B). Las superficies del nervio se utilizan para cortar las señales mitocondriales fluorescentes específica del nervio (figura 5, 5D, 5E, 5 G). Por último, las superficies 3D se crean alrededor de las señales mitocondriales específicas del nervio para obtener las mediciones volumétricas (figura 5F, 5H). Tabla 3 muestra las medidas morfométricas que se exportan desde el software de análisis de imagen y datos de resumen. Los valores principales para exportar son los valores de volumen para el nervio y el nervio específico señales mitocondriales. Se clasifica los datos de volumen de las mitocondrias para generar datos de frecuencia de tamaño de las mitocondrias, que se utilizan para crear histogramas de frecuencia de tamaño (figura 6). Los datos de volumen también se utilizan para hacer medidas de resumen para el número de mitocondrias por volumen IENF y el porcentaje de volumen mitocondrial dentro de volúmenes IENF.
Los datos presentados en la tabla 3 y figura 6 demuestran que esta técnica permite cuantificar las mitocondrias dentro de IENFs humanas de biopsias de la piel. Los nervios de esta muestra tienen mitocondrias distribuidas a lo largo y la mayoría de las mitocondrias se encuentran entre 0.02 - 0.32 μm3. Estos tamaños están en un rango asociado con mitocondrias normales36,37,38,39. Las mitocondrias más pequeños han demostrado ser más móviles que mayor de mitocondrias39 lo que sugiere que las mitocondrias en estos nervios pueden ser más móviles. De hecho, estudios han implicado que las mitocondrias grandes, hinchadas no transportan así como de las mitocondrias pequeñas y pueden llevar a degeneración axonal39,40,41. Por lo tanto, caracterización de las mitocondrias del nervio específico es una técnica valiosa que sería aplicable a estudios de enfermedades neurodegenerativas, donde cambios en la morfología mitocondrial y el transporte han sido asociados con la degeneración axonal 15,25,26,27,42,43.
| Solución al bloqueo 5% BSA | |
| Componentes de BSA 5% solución de bloqueo | Cantidad necesaria |
| Albúmina de suero bovino (BSA) [concentración Final: 5%] | 0,625 g |
| 1.0% Tritón X-100 (TX-100) [concentración Final: 0,3%] | |
Tabla 1: 5% BSA bloqueo solución. La solución al bloqueo 5% BSA se utiliza en primeros pasos del Protocolo de inmunohistoquímica para bloquear la Unión inespecífica de los anticuerpos.
| Solución de lavado 1% BSA | |
| Componentes de BSA 1% solución de enjuague | Cantidad necesaria |
| Albúmina de suero bovino (BSA) [concentración Final: 1%] | 0,125 g |
| 1.0% TX-100 [concentración Final: 0,3%] | 3,75 mL |
| 1 x PBS | ~8.125 mL |
| TOTAL (USA 1 X PBS para hacer 12,5 mL volumen total) | 12,5 mL |
Tabla 2: 1% de BSA enjuague solución. La BSA 1% solución de enjuague es utilizada en el protocolo de inmunohistoquímica para bloquear la Unión inespecífica de los anticuerpos y utiliza para la dilución de los anticuerpos primarios y secundarios.
| Mediciones morfométricas para IENFs y mitocondrias del nervio específico | ||||||||
| Datos exportados y Resumen de Software de análisis de imagen | ||||||||
| TA tamaño frecuencia contenedores | Número de Mt en tamaño frecuencia Bin | Porcentaje de TA en Bin | Número total de Mt | Volumen de MT (μm3) | Volumen IENF (μm3) | Número de Mt por IENF volumen (número/100 μm3) | Porcentaje del volumen de TA IENF volumen | Número de IENFs |
| entre .02.04 μm3 |
20 | 24.4% | 82 | 13.41 | 518.88 | 15.8 | 2.58% | 4 |
| entre .04-.08 μm3 |
28 | 34,1% | ||||||
| entre .08.16 μm3 |
14 | 17.1% | ||||||
| entre .16.32 μm3 |
12 | 14.6% | ||||||
| entre .32-.64 μm3 |
4 | 4.9% | ||||||
| entre .64-1.28 μm3 |
3 | 3.7% | ||||||
| entre 1.28-2.56 μm3 |
1 | 1.2% | ||||||
| entre 2,56 + μm3 |
0 | 0.0% | ||||||
Tabla 3: Las mediciones morfométricas para IENFs y mitocondrias del nervio específico. La tabla representa valores morfométricos que se miden y se exportan desde software de análisis de imagen y datos de resumen. Abreviaturas: IENF, intraepidermal del nervio las fibras; TA, las mitocondrias.
Figura 1 : Esquema que representa la instalación de una placa de 96 pocillos para inmunohistoquímica de la biopsia de piel. Filas en la placa representan pasos en el protocolo para soluciones bloque, lavado e incubación y columnas individuales de tejido (de 1 a 8 secciones por placa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : 3D representante microscopia Confocal de la imagen de una sección de tejido de una biopsia epidérmica humana procesado para fluorescencia Immunohistochemistry. Imagen de proyección 3D sin procesar ilustra las señales fluorescentes (A) se fusionaron y señales individuales para (B) los nervios (nervio, verde), (C) núcleo (Nuc, azul) y (D) mitocondrias (Mt, rojo) en la epidermis y DermIS. Nota la falta de señales en la capa del estrato córneo de la epidermis. Barras de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Mejores resultados de resolución de imagen en menos nervios para posterior análisis. Todas las imágenes son capturadas con un objetivo de aceite de 40 X con una apertura numérica de 1.25 y las proyecciones 3D ilustran señales fluorescentes para los nervios (verde), mitocondrias (Mt, rojo) y núcleo (Nuc, azul). Una imagen tomada en un factor de zoom de 2.2 (A) contiene varios nervios dentro de la vista. Aumentando el factor de zoom 3.3 (B) o 6.6 (C), el muestreo de Nyquist ideal, reduce significativamente el número de nervios dentro de cada imagen. Barras de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Procesamiento de imágenes. Representante extendió vista de foco (proyección de máxima intensidad) de una imagen de microscopía confocal de una sección de tejido de una biopsia epidérmica humana. Imagen de proyección sin procesar ilustra (A) el fluorescente combinado señales de los nervios (verdes), núcleo (Nuc, azul) y mitocondrias (Mt, rojo). La dermis y la capa córnea son (B) recorta hacia fuera con una región de inteherramienta de selección a mano alzada de resto (ROI) (azul área resaltada, retorno de la inversión de los cultivos) aislar señales sólo en la epidermis. La epidermis (C) recortada es procesada para la deconvolución (D) con el punto calculado separó funciones para mejorar la resolución de los nervios (verde) y mitocondrial (Mt, rojo). Barras de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Análisis de imagen. Imagen de microscopía confocal 3D representativas ilustra (A) la señal fluorescente verde específico del nervio. (B) se crea una superficie 3D (cian) de la señal del nervio. La señal mitocondrial específica del nervio está aislada del resto de las señales mitocondriales epidérmicos (C) (Mt, rojo) por (D) con la superficie del nervio como una herramienta de enmascaramiento. La resultante (E, G) del nervio específico mitocondrial señal fluorescente roja se utiliza para crear (F, H) superficies (superficie de Mt, magenta) alrededor de las mitocondrias dentro de la superficie del nervio (cian). G y H son puntos de vista magnificadas de las cajas blancas en E y F. escala de barras = (A-F) de 20 μm, 5 μm (G-H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Histograma de frecuencia de tamaño mitocondrial. Mitochondrialsurface los datos se presentan como un histograma de frecuencia de tamaño para visualizar el porcentaje de mitocondrias que están presentes en cada uno de los diferentes contenedores según su volumen (μm3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo está diseñado para aislar, cuantificar y analizar el tamaño y la distribución de las mitocondrias del nervio específico dentro de IENFs en 3D de las biopsias de la piel humana. Hay varios pasos críticos en el protocolo. La inmunohistoquímica de fluorescencia flotante está diseñado para la mancha y analizar varias señales en cada muestra, proporcionando una metodología más versátil para la investigación exploratoria44,45. Este procedimiento permite la penetración de los anticuerpos en el tejido para maximizar la adquisición de imágenes a lo largo de la sección 50 del μm, que es necesario para la adquisición de imágenes de microscopia confocal y análisis en 3D. Otro paso fundamental es los parámetros de adquisición de imagen que están equilibrados entre capturar bastantes nervios por imagen manteniendo la resolución para la medición de las mitocondrias. Las secciones de tejido utilizan en este y los protocolos de biopsia de piel estándar son aproximadamente 3 mm largo45,46,47,48. Los parámetros de adquisición describen en esta captura de protocolo lo suficiente de la epidermis con un promedio de 4 a 6 fibras nerviosas por imagen. Muestreo en mayor resolución reduciría significativamente el número de nervios en cada imagen, especialmente en el muestreo de Nyquist. Un tercer paso crítico es usar algoritmos de deconvolución para mejorar la resolución y el contraste de las señales, especialmente para las mitocondrias. Deconvolución de las imágenes ayudaron a compensar la no toma de muestras a más alta resolución. El último paso crítico es utilizar software de análisis de imagen para aislar mitocondrias nervio-específica de las mitocondrias asociadas a células en la epidermis. Esto se logra mediante el uso de la superficie del nervio como una herramienta de enmascaramiento para recortar señal mitocondrial que localizar dentro del nervio.
Hay algunas posibles modificaciones de esta técnica a considerar. Una modificación posible sería acortar la duración de la inmunohistoquímica de fluorescencia. Las incubaciones durante la noche en las soluciones de anticuerpos primarios y secundarios a 4 ° C podrían acortarse a 3-4 horas a temperatura ambiente. Sin embargo, más cortas incubaciones a temperatura ambiente a menudo aumentan fluorescencia del fondo, por lo que debe tenerse cuidado para evitar mala señal a ruido. Otra modificación posible sería ajustar los parámetros de adquisición de imagen. Como se mencionó anteriormente, la adquisición de la imagen aquí descrita fueron sesgado hacia captura un número razonable de nervios por la imagen en alta resolución. Es posible utilizar un objetivo de aumento mayor, como un objetivo de inmersión de aceite 63 x con una apertura numérica 1.3. Si todos los parámetros siendo el mismo y se utilizó un objetivo X 63, el campo de la imagen XY se reduciría a 112 μm μm x 112 y por lo tanto reduce el número promedio de nervios por imagen. El punto principal es utilizar parámetros consistentes en la adquisición y posterior análisis.
La principal limitación de esta técnica es que es mucho tiempo. La inmunohistoquímica tiene 3 días para procesar tejidos, adquisición de la imagen toma alrededor de 30-50 minutos por imagen dependiendo cuantas optical z-medidas y procesamiento y análisis de imagen toma aproximadamente 20 minutos. Esto es un compromiso de tiempo significativo pero produce mediciones morfométricas importante al final. Otra limitación de esta técnica es la limitada zona de epidermis muestreados por imagen. Sin embargo, esto mejorará, sin duda, como se hacen los avances en las tasas de adquisición de imagen con resolución mejorada, combinada con procesadores más rápidos del equipo y software de análisis.
La importancia de este protocolo sobre otros métodos es en el poder de combinar immunohistochemistry de fluorescencia con microscopia confocal y análisis de imágenes 3D. Tradicionalmente, análisis de fibras nerviosas intraepidermal realiza con cromógeno en inmunohistoquímica y la microscopía de campo brillante, especialmente para el diagnóstico clínico de neuropatía45,47,49. El uso de immunohistochemistry de fluorescencia permite la mancha y analizar varias señales en cada muestra, proporcionando una metodología más versátil para la investigación exploratoria44,45. Esta técnica proporciona una estrategia para aislar una señal particular de interés, del nervio específico en este caso las mitocondrias, de una señal compleja, mitocondrias asociadas con las células epidérmicas.
El poder de esta técnica es su utilidad en futuras aplicaciones. La capacidad de aislar y medir las mitocondrias del nervio específico permite evaluar alteración inducida por la enfermedad en el tamaño y la distribución de las mitocondrias. Múltiples complicaciones neurológicas han implicado la disfunción mitocondrial como un mecanismo potencial de la enfermedad. En particular, una versión modificada de esta técnica se ha utilizado para demostrar que los pacientes con diabetes y neuropatía periférica diabética tienen cambios mensurables en el tamaño y la distribución de las mitocondrias del nervio específico comparado con pareados por edad controla50. Esta técnica sería útil para evaluar la efectividad de los tratamientos diseñados para mejorar o curar neuropathies sensoriales. Por último, la versatilidad de la técnica lo hace aplicable a una amplia gama de análisis que utilizan una señal fluorescente para aislar un subconjunto de datos de otras señales fluorescentes.
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Disclosures
No hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud subvenciones K08 NS061039-01A2, el programa de investigación de Neurología & descubrimiento y el Instituto A. Alfred Taubman Medical Research en la Universidad de Michigan. Este trabajo utiliza la morfología y la base de análisis de imagen del centro de investigación de la Diabetes de Michigan, financiado por los institutos nacionales de salud beca 5P 90 DK-20572 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón. Los autores desean agradecer a J. Robinson Singleton y Gordon A. Smith (Universidad de Utah) por su generosa donación de muestras de piel humana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1x PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
| Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
| Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
| Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
| 0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA |
MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
| Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
| Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
| Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
| CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
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