Summary
Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.
Abstract
Bu iletişim kuralının amacı mitokondri içinde intraepidermal sinir lifleri incelemektir. Bu nedenle, 3D görüntüleme ve analiz teknikleri sinir özgü mitokondri yalıtmak ve duyusal sinir distal ucu mitokondri hastalığı kaynaklı değişikliklere değerlendirmek için geliştirilmiştir. Protokol Floresans immünhistokimya, confocal mikroskobu ve görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için 3D görüntü analiz teknikleri birleştirir. Detaylı parametreleri yordamlarda sinir özgü mitokondri yalıtmak için bu teknikleri kullanmayı gösteren somut bir örnek vermek için tanımlanır. Hangi sinirler ve mitokondri yeşil ve kırmızı floresan sinyali ile sırasıyla görselleştirmek için dolaylı ayirt tarafından izledi biyopsi, deri doku bölümleri içinde mitokondrial sinyalleri yumruk ve antikorlar sinir etiketlemek için kullanıldı. Z-serisi görüntüleri confocal mikroskobu ile satın alınan ve 3D analiz yazılımı işlemek ve sinyalleri analiz etmek için kullanıldı. İçinde açıklanan tam parametreleri takip için gerekli değildir, ancak boyama boyunca, toplama ve analizi adımları seçilmiş olanlar ile tutarlı olması önemlidir. Bu iletişim kuralı bir floresan sinyal aksi Yalnız çalışmak imkansız diğer sinyalleri yalıtmak için kullanıldığı çok çeşitli koşullar uygulanabilir olduğunu gücüdür.
Introduction
Mitokondri hücre enerji, kalsiyum ve nekrotik düzenleyen ve apoptotik hücre ölüm1,2,3tampon üreten dahil önemli hücresel işlevler hizmet. Sinir sistemi nöronlar hücresel enerji yüksek derecede adenozin trifosfat (ATP) formunda oluşturmak düşündüren vücut4 mitokondrial solunum ile karşılaştırıldığında yüksek bir metabolizma hızı vardır. Bir sürü kanıt belgeleri nöronal işlevleri ATP5, özellikle de sinapslarda6bağlıdır. Bu nedenle, mitokondri nöronlar içinde dağılımı önemlidir.
Bir sürü bilgi bu trafiği ve nöronal mitokondri rıhtım göstermiştir son 10 yıl içinde son derece düzenlenmiştir. Motor proteinler mitokondri nöron boyunca belirli hücresel kompartmanlarda için dağıtma katılmaktadırlar. Nöronlar proje akson ve dendrites uzakta soma mitokondri kaçakçılığı özellikle önemlidir. Kinesin motor proteinler öncelikle anterograd (soma) uzak mitokondri mikrotübüller dinein motor proteinler doğrudan (soma doğru) retrograd hareketliliği7,8,9 süre boyunca, kaçakçılığı doğrudan , 10. böyle bir mitokondri zar potansiyeli ve varlığı ve mitokondrial kaçakçılığı11,12,13yönünü etkileyen impuls iletim hücresel sinyalleri vardır.
Mitokondri taşıma yanı sıra, mitokondri ve Ranvier düğümleri ve sinapslarda8,14, gibi yüksek enerji talepleri belirli hücresel kompartmanlarda için yerelleştirmek için özel proteinler vardır 17. aslında, mitokondri içinde aksonlar hareketli9,13,18çoğu. Özel proteinler gibi syntaphilin çapa mitokondri mikrotübüller diğer proteinler çapa mitokondri aktin sitoiskeleti19-21ise akson boyunca için. Büyüme faktörleri ve kalsiyum gibi iyonları mitokondri hareket onları gerekli21,22,23nerede olduklarını bölgelerine yerelleştirmek için kesilmesi desteklemek için rapor edilmiştir.
Birlikte ele alındığında, ticareti ve mitokondri yerleştirme nöronlar için düzgün bakımından çok önemlidir. Bu destek, Alzheimer hastalığı, amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı, Huntington hastalığı, herediter Spastik dahil olmak üzere çeşitli nörolojik koşullar ile ilişkili mitokondrial kaçakçılığı bozulma olmuştur paraparesis ve optik Atrofi15,24,25,26,27. Son yıllarda yapılan çalışmalarda diyabetik nöropati, diyabet28,29,30ile,31 ilişkili duyu kaybı için potansiyel bir mekanizma olarak mitokondrial disfonksiyon ve patoloji üzerinde odaklanmıştır ,32,33. Diyabet mitokondri Kutanöz sinir biten duyusal projeksiyonlar içinde dağıtım değiştirir hipotezdir. Bu nedenle, bir teknik görselleştirmek ve mitokondri içinde intraepidermal sinir lifleri (IENFs), dorsal kök gangliyon duyusal afferents distal ipuçları ölçmek için geliştirilmiştir. Teknik Floresans immünhistokimya özel mitokondrial ve sinir lifi etiket sinir özgü dağılımını ölçmek için sinyalleri güçlü 3D görüntü analiz yazılımı ile confocal mikroskobu z serisi satın alma ile birleştirir. Bu hedefe ulaşmak için insan Kutanöz punch biyopsi üzerinden mitokondri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
(Salt Lake City, UT) Utah Üniversitesi diyabet Merkezi'nde büyük topluluk tabanlı birinci basamak sağlık ağdan işe konulardan elde edilen deri punch biyopsi. Bu çalışma Michigan Üniversitesi Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış ve Helsinki Deklarasyonu ilkelerinin ile uyulması. Aydınlatılmış onam test önce her konudan elde edilen yazılı.
1. Floresans immünhistokimya
- hazırla punch biyopsi intraepidermal Sinir lifi immünhistokimya için:
- gerçekleştir 3 mm cilt biyopsileri tıp tarafından personel ve bütün biyopsi 1,5 yer mL Zamboni ' s sabitleştirici çözüm (%2 paraformaldehyde, doymuş % 0,3 Pikrik asit fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7,4) gecede 4 ° C'de.
- Durulama örnekleri % 30 Sükroz bir çözüm ile PBS içinde 4 ° C'de 16-24 h ya kadar örnek lavabolar.
- En uygun kesme sıcaklık Embed örnekleri bileşik (OCT) kullanarak bir cryomold. Kalıp içinde aşağı bakacak şekilde epidermis ile tüm 3 mm biyopsi koyun ve kalıp yaklaşık 2 mL Ekim Freeze kalıp ezilmiş kuru buz ile doldurun. Mağaza-80 ° c kadar kullanıma hazır.
- Kesim 50 µm kalınlığında bir cryostat kullanma bölümlerine geçmek ve iyi (% 30 etilen glikol, PBS % 30 gliserol) başına 180 µL antifriz depolama çözümü kullanarak bir 96-şey plaka bireysel Wells saklayın. Aşağıdaki yönergeler 96 iyi plaka 8 kuyular için vardır. 200-300 µm birbirlerinden uzağa bölümler her biyopsi sitesinden leke.
1. gün:
- belirsiz stratum korneum etiketleme gidermek:
- olarak şekil 1 ' de gösterilen etiket 96-şey plaka.
- Damlalıklı 150 µL ikincil antikorlar 34 , 35 nonspesifik bağlama her kuyuya azaltmak için hisse senedi sinyal arttırıcı çözüm. Bölümler inoculating bir döngü kullanarak sinyal arttırıcı çözüm transfer.
Not: zarar veya doku bölümleri yırtılma önlemek için doku ile çalışırken dikkat et. Düz bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika sinyal arttırıcı çözümde tutun. - Hazırlama durulama her kuyuya 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 150 µL ekleyerek satır 2 ve 3 / 96-şey plaka kuyuları.
- Dikkatli bir şekilde satır 2 ve 1 x PBS için oda sıcaklığında 10 dakika durulama içine bölümler transfer.
- Durulama, oda sıcaklığında (satır 3) 10 dk 1 x PBS içinde ikinci kez.
- % 5 sığır serum çözüm engelleme albumin (BSA) hazırlamak:
- % %5 5 BSA içeren çözüm engelleme ve %0,3 Triton X hazırlamak (bkz. Tablo 1) 0.1 M PBS bölümler ise (TX-100) 100 kuluçka sinyal arttırıcı çözüm. BSA çözüm kolayca gitmez. BSA tamamen eriyene kadar girdap çözüm.
- Çözüm her kuyuya engelleme %5 BSA 150 µL ekleyerek satır 4 96-şey plaka engelleme wells hazırlayın.
- Bölümleri çözüm engelleme %5 BSA bireysel kuyu aktarmak ve çözüm için 1-2 h düz bir rocker üzerinde oda sıcaklığında engelleme %5 BSA bölümlerde kuluçkaya.
- %1 BSA çözüm ve seyreltme birincil antikorların durulama hazırlamak:
- TX-100 (bkz. tablo 2) 0.1 M PBS içinde içeren % 1 BSA ve % 0.3 hazırla % 1 yıkama çözüm bölümleri vardır %5 BSA engelleme çözümde kuluçka. BSA çözüm kolayca gitmez. BSA tamamen eriyene kadar girdap çözüm. Bölüm %5 BSA engelleme çözümde kuluçka iken
- % 1 BSA durulama çözümde birincil antikorlar oranında seyreltin.
- Birincil antikor çözüm 1.500 µL yapıp her ekleyin su kuyusu içinde satır 5.
- Seyreltik birincil antikorlar: sinir özel etiket, tavşan poliklonal Anti-protein gen ürünü 9.5 (PGP9.5) 1:1, 000 kullanın. Mitokondri özgü etiket kullanın, fare monoklonal Anti-pyruvate dehidrogenaz E2/E3bp antikor (PDH), 1: %100 1 BSA çözüm durulama içinde.
- Hazırla birincil antikor:
- her birincil antikor damlalıklı 150 µL iyi kürek 96-şey plaka 5.
- Döngü aracını kullanarak bölümleri engelleme çözümden (satır 4) satır birincil antikor içeren 5 transfer.
- Plaka kurumasını önlemek için sıkı bir şekilde parafilm ile sarın.
- Örnekleri, oda sıcaklığında 1 h için düz rocker üzerinde yerleştirin ve örnekleri 4 ° C'nin üzerinde düz bir rock'çı, gecede kuluçkaya.
2. gün:
- durulama örnekler:
- satır 6, 7 ve 8 150 µL % 1 BSA çözüm her kuyuya durulama ekleyerek 96-şey plaka hazırla durulama wells.
- Bölümleri ilk % 1 BSA durulama çözüm (satır 6) aktarmak ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Durular, oda sıcaklığında 7 ve 8 için 1 h satırlardaki çözüm durulama % 1 BSA bölümlerde kuluçka tarafından iki kez daha tekrarlayın.
- Seyreltik çözüm durulama % 1 BSA ikincil antikor:
- yapmak 1.500 µL iken bölümler %1 BSA çözüm (satır 8) durulama son durulama kuluçka ikincil antikor çözüm.
- Seyreltik ikincil antikorlar: PGP9.5 (yeşil-floresan konjuge keçi Anti-tavşan antikor, 1: 1000) PDH (kırmızı-floresan konjuge keçi Anti-fare, 1:1, 000) % 1 BSA çözüm durulama için.
- Hazırla ikincil antikor:
- satır 9 96-şey plaka içine ikincil antikor damlalıklı 150 µL.
- Yavaşça çözüm (satır 8) ikincil antikor wells (satır 9) durulama % 1 BSA bölümleri transfer.
- Kullanma parafilm, sıkı bir şekilde bu kurumasını engellemek için plaka sarın. Alüminyum folyo ile kapatın. 1s için oda sıcaklığında düz rocker üzerinde örnekleri yerleştirin ve örnekleri düz bir rocker üzerinde 4 ˚C adlı gecede kuluçkaya.
3. gün:
- hazırla temiz 1 x PBS 0,22 µm filtreden süzerek:
- , damlalıklı 150 µL filtre 1 x PBS satır 10, 11 ve 12.
- Örnekleri 10 satır transfer ve oda sıcaklığında 1 h için 1 x PBS durulayın. 96-şey plaka alüminyum folyo ile kapak ve durulama sırasında düz bir rocker üzerinde yerleştirin. Tekrar filtre 1 x PBS durulama iki kez daha 1s için her oda sıcaklığında satırlar 11 ve 12.
- Doku bölümleri montaj için mikroskop slaytlar hazırlayın:
- yer 50 µL, filtre uygulanmış bir slayt üzerinde 1 x PBS.
- Transfer bölümünden 1 x PBS (satır 12) içine 50 µL bırak. Dikkatle PBS bölümünü içinde belgili tanımlık damla doku unfolding ve yavaşça cam slayt düzleştirme konumlayın. Cam pipet ile aşırı PBS montaj reaktif sulandrarak önlemek için kaldırın. Cam ampul bölümlerle dokunmayın.
- Damlalıklı 1 - 2 damla DAPI üstünde tepe-in mikroskop slayt kullanarak doğrudan bölüm içeren montaj reaktif bakım bölümü yönünü rahatsız değil. Yavaşça bir 50 mm x 24 mm #1.5 mikroskop cam coverslip bölümünün üzerine yerleştirin.
- Coverslip yerleştirerek süre oluşan herhangi bir hava kabarcıkları temizleyin ve aşırı sıvı coverslip kenarlarını Sil. Yeni bir slayt hazırlamak ve montaj pr tekrarlayıngönderilen her bölüm için.
- Tedavi/kuru oda sıcaklığında karanlık gecede slaytları yerleştirerek montaj medya. 4 ° C-20 ° C için uzun süreli depolama (2 haftadan daha fazla) veya kısa vadeli (1-2 hafta) için slaytları transfer.
Not: Birincil antikorlar PGP9.5 veya PDH için adım 1.4.2.2 ihmal ve hiçbir ayırt sinirler veya mitokondri içinde epidermis etiketlerine göre görüntülenen negatif kontrol eder. Pozitif denetimler gerçekleştirilmiştir için PDH bunu kanıtlamak için antikor tüm mitokondri (veri gösterilmez) Etiketler. Pozitif denetimler için etiket mitokondri yeşil flüoresan Protein (GFP) sinyali ile baculovirus ile transduced ve daha sonra sabit ve PDH antikor ve kırmızı floresan ile lekeli kültürlü birincil fare dorsal kök gangliyon nöronlar üzerinde gerçekleştirilen ikincil antikor. GFP ifade tüm mitokondri PDH immünhistokimya (veri gösterilmez) için kırmızı etiketle birlikte etiketli.
2. Confocal görüntüleme
- confocal görüntüleme gerçekleştirmek:
- toplamak görüntüleri ters bir mikroskop amaçta petrol-daldırma (1,25 sayısal diyafram (N.A.)) X 40 confocal mikroskobu tarama bir lazer kullanarak.
- Her odak düzlemi sırayla floresan sinyallerini almak:
çekirdeği: uyarma λ 405 = nm, spektral emisyon filtre λ 420-480 nm =
sinir lifleri: uyarma λ = 488 nm, spektral emisyon filtre λ 505-560 nm =
Mitoch ondria: uyarma λ = 543 nm, spektral emisyon filtre λ 606-670 nm =
- Her odak düzlemi sırayla floresan sinyallerini almak:
- belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı aşağıdaki tarama parametreleri girin: 600 Hz tarama hızı 2 çerçeve ortalama ve 2.2; zoom 12-bit yoğunluğu çözünürlük (4096 gri düzeyleri).
- Mikroskop bilgisayar yazılımı için en iyi duruma getirilmiş yanal çözünürlük ayarla (tarama çözünürlüğü 1024 x 1024 =) ve Aksiyel çözünürlük/optik kesit (confocal diyafram = 1 havadar adet (AU) ile z-adım boyu 210 nm).
Not: Elde edilen XYZ 172.2 çözümlemesidir 172.2 nm x 210 nm ile bir resim büyüklük-in 30-50 µm x 176.1 µm x 176.1 µm x nm.
- Mikroskop bilgisayar yazılımı için en iyi duruma getirilmiş yanal çözünürlük ayarla (tarama çözünürlüğü 1024 x 1024 =) ve Aksiyel çözünürlük/optik kesit (confocal diyafram = 1 havadar adet (AU) ile z-adım boyu 210 nm).
- Sinir sinyal (yeşil-floresan) için canlı bir tarama etkinleştirmek ve bulun ve üst set z-odak denetimi değiştirmek ve alt doku bölümünde sinir sinyal kapsayacak odak uçak içinde mikroskop bilgisayar yazılımı. Toplam z-genellikle 30-50 µm 50 µm doku bölümün aralıktır.
- Epidermis görüntüde yatay veya dikey olarak konumlandırılmış bir canlı tarama sırasında belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı inceden inceye gözden geçirmek alanıyla döndürme.
- Her sinyal ayrı ayrı inceden inceye gözden geçirmek ve Dedektör (photomultiplier tüp, devresel_ödeme) ayarlamak gerilim ve en aza indirmek/herhangi üzerinde ve doymuş piksel altında kaldırmak için mahsup hesabı.
: Dikkat yukarıdaki parametreler ile inceden inceye gözden geçirmek kere z dilimleri sayısına bağlı olarak yaklaşık 20-40 dak.
- toplamak görüntüleri ters bir mikroskop amaçta petrol-daldırma (1,25 sayısal diyafram (N.A.)) X 40 confocal mikroskobu tarama bir lazer kullanarak.
3. 3D görselleştirme ve analiz mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri
- 3D epidermis izole:
- orijinal görüntüyü çoğaltın ve maksimum yoğunluk kullanın (odak görünümü genişletilmiş) projeksiyon tanımlanmasını ve yalıtılmasını epidermis görüntünün.
- Bulunmadığına stratum korneum ve DermIS gibi istenmeyen alanları kaldırmak için izleme epidermisin üst ve alt kenarları boyunca faiz aracına bir bölgenin kullanmak intraepidermal sinir liflerinin. Bu seçim için kırpma.
- Sinir ve mitokondrial floresan sinyallerini kullanım deconvolution:
Not: Deconvolution floresan sinyallerini bütünlüğünü geri yüklemek için yardımcı olur. Bu floresan sinyallerini görüntülerde ne kadar sinyalleri kendi özgün kaynaktan yayılan belirlemek için kullandığı için bu protokol için kullanılan restorasyon kör deconvolution denir (noktası yayıldı fonksiyonu). İşlem başlangıç konumuna geri yaymak sinyal atayarak sinyal çözünürlüğünü artırır.- Hesapla bir noktası yayıldı fonksiyonu (PSF) yeşil flüoresan sinir sinyal (yeşil-floresan) için aşağıdaki parametrelerle:
- Ayarla hesaplanmış PSF confocal. Orta Kırılma indisi 1.515 ve sayısal diyafram 1,25 için ayarlayın. Dedektör iğne deliği 1 havadar birimine (yapıyordum) ayarlayın. Set uyarma dalga boyunda 515 için 488 nm ve emisyon dalga boyu için nm.
- Bir PSF kırmızı floresan mitokondrial sinyal (kırmızı-floresan) için aşağıdaki parametrelerle hesaplamak:
- küme hesaplanan PSF için confocal. Orta Kırılma indisi 1.515 ve sayısal diyafram 1,25 için ayarlayın. Set dedektörü iğne deliği 1 AU. Set uyarma dalga boyunda 617 için 543 nm ve emisyon dalga boyu için nm.
- Sinir ve mitokondri floresan sinyallerini karşılık gelen PSFs kullanarak deconvolution tarafından yukarıda listelenen En İyileştir ve yinelemeli restorasyon özellik ayarla % 100 güven ve bir yineleme sınırına 10 döngüleri.
- Hesapla bir noktası yayıldı fonksiyonu (PSF) yeşil flüoresan sinir sinyal (yeşil-floresan) için aşağıdaki parametrelerle:
- Sinir özel yüzeyler oluşturma:
- Kullanım " yüzey oluşturmak " bir katı yüzey sinirleri deconvolved yeşil-floresan ikincil PGP9.5 etiketleme üzerinden yapmak için aracı tespit sinir.
- Uncheck " düzgün " özelliği ve arka plan Floresans önemli ölçüde daha parlak olduğundan sinir sinyal için eşik ayarlamak için mutlak yoğunluğu özelliğini kullanın.
- Arka plan Floresans önemli ölçüde daha parlak olduğundan sinir sinyal için eşik belirtmek için mutlak yoğunluğu özelliğini kullanabilirsiniz. Doğru bir şekilde sinirler tanımlamak için düşük eşik değerini ayarlamanız.
- Filtre küçük, sinir olmayan yüzeyleri dışarı dayalı boyutuna.
Not: gerekirse, el ile ek sinir olmayan yüzeyleri içinde dışarı düzenlemek " düzenleme " sekme birden fazla nesneyi vurgulamak için CTRL tuşunu basılı tutup ardından Delete tuşunu kullanarak silme ile.
- Ayrı tut moduyla sinir özgü floresan mitokondrial sinyal:
- Düzen sekmesini görüntülemek için sinir yüzey seçin " maskesi özellikleri " özellik. 3.3 adımlarda oluşturduğunuz sinir yüzey mitokondri içinde bu sinirler mitokondrial sinyalleri lenfositi ile ilişkili uzak izole etmek için kullanılır.
- Olarak " maskesi tüm ' düğmesi açılır bir " maske kanal " pencere, deconvolved kırmızı-floresan sinyal altında menüyü aşağı doğru seçim " Kanal seçimi " mitokondrial sinyal için.
- Kutusuna onay işareti koymak için tıklatın " maske uygulamadan önce yinelenen kanal " seçenek.
- Tıklayın radyo düğmesini önünde " sürekli iç/dış " için maske ayarları ve tıkırtı belgili tanımlık kutu içinde onay işareti koymak için seçeneğini " ayarla Voksel yüzeye dışında " seçeneği ve 0,00 değeri yazın. Mitokondrial sinyaller sinir yüzey içinde temsil eden yeni kanal oluşturmak için Tamam'ı tıklatın düğmesini.
- Mitokondri özel yüzeyler oluşturma:
- Kullanım " yüzey oluşturmak " mitokondri bir katı yüzey sinir özgü mitokondrial sinyal--dan yeni oluşturulan floresan kanal üzerinden yapmak için araç 3.4 adım.
- Uncheck " düzgün " özelliği ve seçin " arka plan çıkarma " eşik ayarlamak için özellik. Bu özellik yerel kontrast mitokondrial sinyal çevresinde mitokondri arka plan tanımlamak için kullanır.
- Küme eşik değeri doğru bir şekilde mitokondri tanımlamak için düşük. Bu örnekte daha düşük eşik 2.000 bir 16-bit (65,536) ölçek ayarlamak.
- Mitokondrial yüzeyler boyutuna göre filtre. Voksel sınır için 1.0 voxels kuruldu bu örnekte en düşük hangisi mümkün sınırlayın. Gerekiyorsa, mitokondri yüzeyler içinde dışarı el ile düzenleyin " düzenleme " sekme birden fazla nesne seçmek için CTRL tuşunu basılı tutup ardından Delete tuşunu kullanarak silme ile.
Not: Bazen, yazılım ayırt floresan mitokondrial sinyal ile ilişkili olmayan yüzeyleri oluşturur. Bu gibi durumlarda, onlarla kaldırmak mümkündür " düzenleme " sekmesini
- Verme ve analiz xarakteristikaları değerlerini hesaplamak:
- verme sinir ve mitokondrial yüzeyler için değerler " istatistik " sekmesini elektronik tablo yazılımı ile daha fazla çözümleme için.
- Sinir ve mitokondrial yüzeyler için birim değerleri vermek.
- Bireysel sinir lifleri her görüntüde mevcut saymak ve elektronik tablo değeri kaydedin.
- Her resim için elektronik tablo analizi için aşağıdaki olası değerleri hesaplamak:
- Bu birim için tüm sinir yüzeyleri toplamak.
- Filtre hacmi az 0,02 µm 3 ve depo gözü aşağıda sinir özgü mitokondrial yüzeyleri dışarı yüzeyler tarafından boyutu. Örneğin, 0.02 gibi-depo gözlerini kullanacak 0,04 0,04 - 0.08 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1,28, 1,28 2.56, 2.56 µm 3 büyük.
Not: Mitokondrial birimin alt sınır mitonchodria 36 , 37 , 38 daha önce yayımlanmış birimlerde dayalı 0,02 µm 3 kuruldu. - Depo (0.02 - 2.56 µm 3 büyük) üzerinde sinir özgü mitokondrial yüzeyler her depo gözü içinde sayısı ve yüzeyler toplam sayısını saymak.
- Sinir özgü mitokondrial yüzeyler her depo gözündeki oranı hesaplar. Mitokondri yüzeyler toplam numarasına göre bölünmüş depo gözü başına Kont kullanın.
- Bu birim için tüm sinir özgü mitokondrial yüzeyleri toplamak.
- Toplam sinir yüzey birimin tüm mitokondrial yüzey birimleri toplamına bölünmesi ile sinir mitokondrial sinyali ile oranı hesaplamak.
- Sinir birim başına mitokondri sayısı toplam sinir yüzey hacim mitokondrial yüzeylerin sayısına göre bölerek hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Görselleştirme ve mitokondri içinde insan IENFs miktar
Floresans immünhistokimya sinirler, mitokondri ve çekirdekleri görselleştirmek için Çoklu sinyaller insan cilt biyopsileri içinde eşzamanlı etiketleme için sağlar. 96-şey plaka immünhistokimya yordamdaki adımları düzenlemek için kullanışlı bir yol var. Şekil 1 bu kadar çözümler 12 aşamalarında işlenmek üzere 8 bölüm için bu yapılandırma hesapları gösterir. Düz bir rocker ile nazik ajitasyon ile birlikte serbest dalgalanma yöntemi antikorlar bölümleri her iki yönden nüfuz için yeterli erişim elde etmenizi sağlar. Protokol tamamlamak için 3 gün gece incubations 4 ° C'de hangi tutarlı bir şekilde etiket sinirler ve mitokondri birincil ve ikincil antikorlar nedeniyle büyük ölçüde alır.
Yordamın anımsatıcısını görüntüleme, işleme ve floresan sinyallerini analizini içerir. Confocal mikroskobu, floresan sinyallerini optik bölümüne ayrı sinyalleri odak düzlem odak sinyalleri ortadan kaldırarak yararlanır. Z-serisi doku bölümüne edinimi floresan sinyallerini sinirler, mitokondri ve çekirdekler için 3D bir gösterimini sağlar. Parametreler ortalama 5 sinir yer alacağını epidermis uzunluğu boyunca resim 172 µm için optimize edilmiştir. Şekil 2 epidermis toplanan üç floresan sinyalleri tipik bir 3D görüntüsünü gösterir. (Şekil 2B) Boyama PGP9.5 arka plan otomatik-floresan dokusunun daha yüksek bir yoğunluk olduğunu epidermal ve dermal sinirler zengin bir sinyal sağlar. Nükleer leke (şekil 2C) nerede intraepidermal sinir lifleri innervate epidermisin sınırları belirlemeye yardımcı olur. Dış tabakası epidermis kalan DNA stratum korneum olun corneocytes'nedeniyle olabilir yaygın bir sinyal var yaygındır. Mitokondri açıkça nerede sinyal çoğunluğu öncelikle lenfositi vardır epidermis hücreleri ile ilişkilidir (şekil 2B) Boyama PDH tarafından etiketlenir.
Bu protokol için açıklanan satın alma parametrelerini bir 40 X yağı daldırma amacı 1,25 sayısal diyafram ve 2.2 bir büyütme faktörü ile kullanın. 30-50 µm x 176.1 µm x 176.1 µm XYZ görüntü boyutunu sonuçlanır. Bu ayarlar yeterli ortalama 4-6 sinir lifleri resim (şekil 3A) başına içerecek şekilde epidermisin yakalamak. Örnekleme daha yüksek çözünürlükte sinirler her görüntü sayısını azaltacaktır. Şekil 3B görüntü başına daha az sinirler sonuçlanan 114.8 µm x 114.8 µm için XY alan azaltan bir büyütme faktörü 3.3'de yapamıyorsanız, gösterir. Yağı daldırma amacı 1,25 sayısal diyafram ile x 40 Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) tarafından tanımlandığı gibi ideal örnekleme yoğunluğu 54 nm x 54 nm x 205 nm XYZ tarama çözünürlüğü öneriyor. Bu 1024 x 1024 çözünürlükte 6.6 kat büyütme faktörü gerektiren ve XY görünümü 57.4 µm x 57.4 µm azaltmak ve yalnızca 1-2 sinir resim (şekil 3 c) başına ortalama yakalamak.
Sonraki aşama görüntü işleme görüntünün istenmeyen bölgeleri kaldırmak için ve sinyalleri geliştirmek için gerçekleştirmektir. Bu protokol için dermis ve stratum korneum analiz nerede IENFs innervate bölgesindeki epidermis odaklanabilmek için kaldırılır. Üç boyutlu yazılım izole etmek, geliştirmek ve floresan sinyallerini analiz olanak sağlar. Araçları Yazılım içinde epidermal sinir ve mitokondri bölgeleri üstündeki ve altındaki epidermis (şekil 4A-C) dışarı kırpma tarafından izole etmek için ihtiyaç vardır. Bu işlem sinyalleri genişletilmiş bir görünümü daraltma ve serbest bölgenin epidermis çevresinde izleme tarafından kolaylaştırılmıştır. Kırpılmış görüntü daha fazla görüntü restorasyon algoritmaları tarafından işlenir. Deconvolution sinir ve mitokondrial sinyalleri (şekil 4 d) çözünürlüğü en iyi duruma getirmek için kullanılır.
Son aşamada tespit ve xarakteristikaları özellikleri sinyal--dan hulâsa etmektir. Bu protokol önemli bir yönü sinir özgü mitokondri özelliklerini ölçmek etmektir. Görüntü analiz yazılımı başka bir floresan sinyal (Bu durumda mitokondri) bu yüzey içinde izole etmek için maskeleme aracı olarak bir sinyal (Bu durumda sinir yüzey) için oluşturulan yüzeyler kullanan özellikler var. Sinir özgü mitokondri analizinde ilk adım 3B yüzeyler çevresinde sinirler (şekil 5A-B) oluşturmaktır. Sinir yüzeyler daha sonra sinir özgü floresan mitokondrial sinyalleri (şekil 5C, 5D, 5E, 5 G) kırpmak için kullanılır. Son olarak, 3B yüzeyler sinir özgü mitokondrial sinyalleri hacimsel ölçümleri (şekil 5F, 5H) elde etmek için oluşturulur. Tablo 3 görüntü analiz yazılımı ve Özet verileri dışa xarakteristikaları ölçüleri gösterir. Vermek için ana sinir ve sinir özgü mitokondrial sinyalleri için birim değerleri değerlerdir. Mitokondri birim verilerden sonra boyutu frekans çubuk grafikler (şekil 6) oluşturmak için kullanılan mitokondri boyutu frekans verileri oluşturmak için binned. Toplu veri IENF birim başına mitokondri sayısı ve mitokondrial birim içinde IENF birimleri yüzdesi için Özet tedbirler yapmak için de kullanılır.
Tablo 3 ve şekil 6 ' da sunulan veriler bu teknik mitokondri içinde cilt biyopsileri gelen insan IENFs ölçmek için bir yöntem sunan göstermektedir. Bu örnekten sinirler boyunca dağıtılan mitokondri ve mitokondri çoğunluğu 0,02 - 0,32 µm3. Bu boyutları normal mitokondri36,37,38,39ile ilişkilendirilmiş bir aralığı vardır. Daha küçük mitokondri mitokondri içinde bu sinirler daha hareketli olabileceğini düşündüren büyük mitokondri39 daha fazla hareketli olduğu gösterilmiştir. Nitekim, çalışmalar daha büyük, şişmiş mitokondri yanı sıra daha küçük mitokondri taşıma değil ve aksonal dejenerasyon39,40,41olarak neden olabilir karıştığı. Bu nedenle, sinir özgü mitokondri nörodejeneratif hastalıklar nerede mitokondrial morfoloji ve taşıma değişiklikler aksonal dejenerasyon ile ilişkili olan çalışmaları için geçerli olacaktır değerli bir teknik karakterizasyonudur 15,25,26,27,42,43.
| %5 BSA çözüm engelleme | |
| Çözüm engelleme %5 BSA bileşenleri | Gerekli miktar |
| Sığır Serum Albumin (BSA) [son konsantrasyonu: %5] | 0.625 g |
| %1.0 Triton X-100 (TX-100) [son konsantrasyonu: %0,3] | |
Tablo 1: Çözüm engelleme %5 BSA. %5 BSA engelleme çözüm immünhistokimya protokolü ilk adımda non-spesifik bağlama antikorların engellemek için kullanılır.
| % 1 BSA durulama çözüm | |
| Çözüm durulama % 1 BSA bileşenleri | Gerekli miktar |
| Sığır Serum Albumin (BSA) [son konsantrasyonu: % 1. | 0,125 g |
| %1.0 TX-100 [son konsantrasyonu: %0,3] | 3.75 mL |
| 1 x PBS | ~8.125 mL |
| Toplam (1 X PBS Toplam hacim için 12,5 mL getirmek için kullanabilirsiniz) | 12,5 mL |
Tablo 2: % 1 BSA çözüm durulama. Çözüm durulama % 1 BSA immünhistokimya protokolünde non-spesifik bağlama antikorların engellemek için kullanılır ve birincil ve ikincil antikorları seyreltmek için kullanılır.
| IENFs ve sinir özgü mitokondri xarakteristikaları ölçülerini | ||||||||
| Dışa aktarılan ve Özet verileri görüntü analiz yazılımı | ||||||||
| MT boyutu frekans depo gözleri | Mt boyutu frekans bin sayısı | Mt kutusu içindeki yüzdesi | Mt toplam sayısı | MT cilt (µm3) | IENF cilt (µm3) | Mt IENF cilt (sayı/100 µm3) başına sayısı | IENF birim hacmindeki Mt yüzdesi | IENFs sayısı |
| arasında .02.04 µm3 |
20 | %24,4 | 82 | 13.41 | 518.88 | 15,8 | %2,58 | 4 |
| arasında .04.08 µm3 |
28 | %34.1 | ||||||
| arasında .08.16 µm3 |
14 | %17,1 | ||||||
| arasında .16.32 µm3 |
12 | % 14,6 | ||||||
| arasında .32-.64 µm3 |
4 | % 4.9 | ||||||
| arasında .64-1,28 µm3 |
3 | % 3.7 | ||||||
| arasında 1,28-2.56 µm3 |
1 | %1.2 | ||||||
| arasında 2.56 + µm3 |
0 | % 0,0 | ||||||
Tablo 3: IENFs ve sinir özgü mitokondri xarakteristikaları ölçülerini. Tablo ölçülen ve görüntü analiz yazılımı ve Özet verileri dışa xarakteristikaları değerlerini temsil eder. Kısaltmalar: IENF, intraepidermal sinir lifleri; MT, mitokondri.
Resim 1 : Şematik diyagramı bir 96-şey plaka için kurulum için cilt biyopsisi immünhistokimya temsil eden. Blok, yıkama ve kuluçka çözümler için protokol adımda plaka satırları temsil ve sütunlar bireysel doku bölümler (1'den 8 bölüm plaka başına) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Temsilcisi 3D insan Epidermal biyopsi doku bölümünden Confocal mikroskobu görüntü işlenen Floresans immünhistokimya için. İşlenmemiş 3D projeksiyon görüntü gösterir (A) birleştirilmiş floresan sinyallerini ve (B) sinirler (sinir, yeşil), (C) çekirdeği (Nuc, mavi) ve (D) mitokondri (Mt, kırmızı) epidermisin içinde bireysel sinyalleri ve DermIS. Epidermis stratum korneum tabakası sinyalleri eksikliği dikkat edin. Ölçek çubukları 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Daha sonraki analiz için görüntü çözünürlüğü daha az sinirler sonuçlarında geliştirilmiş. Tüm görüntüleri ile 40 X Petrol amacı 1,25 sayısal diyafram ile yakalanır ve 3D projeksiyonları sinirler (yeşil), mitokondri (Mt, kırmızı) ve çekirdek (Nuc, mavi) floresan sinyallerini göstermektedir. 2.2 (A) bir büyütme faktörü alınan bir görüntü görünümü içinde çeşitli sinirler içerir. Yakınlaştırma faktörü 3.3 (B) veya 6,6 (C)artan, ideal Nyquist örnekleme, her görüntü içinde sinirler sayısı önemli ölçüde azaltır. Ölçek çubukları 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Resim işleme. Temsilcisi confocal mikroskobu insan epidermal biyopsi doku bölümünden gelen görüntünün odak (maksimum yoğunluk projeksiyon) genişletilmiş. İşlenmemiş projeksiyon görüntü (A) birleştirilmiş floresan sinirler için (yeşil), çekirdek (Nuc, mavi) ve mitokondri (Mt, kırmızı) sinyalleri gösterilmektedir. Dermis ve stratum korneum Inte bir bölge ile (B) kırpılmış vardırgeri kalan (ROI) serbest seçim aracını (mavi vurgulanan alanı, yatırım Getirisi kırpma) sadece epidermis sinyalleri yalıtma. (D) deconvolution hesaplanan noktasıyla sinirler (yeşil) çözünürlüğünü artırmak için işlevler yaymak için kırpılmış (C) epidermis sonra işlenir ve mitokondriyal (Mt, kırmızı) sinyalleri. Ölçek çubukları 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Görüntü analizi. Temsilcisi 3D confocal mikroskobu görüntüsü gösterilmektedir (A) sinir özel yeşil flüoresan sinyal. (B) 3B yüzey (mavi) sinir sinyal için oluşturulur. Sinir özgü mitokondrial sinyal sinir yüzey bir maskeleme aracını kullanarak (D) tarafından (C) epidermal mitokondrial sinyalleri (Mt, kırmızı) geri kalanından ayrı tutulur. Sinir özgü mitokondrial kırmızı floresan sinyal oluşturmak için kullanılan elde edilen (E, G) (F, H) yüzeyler (Mt yüzey, macenta) çevresinde mitokondri içinde sinir yüzey (mavi). G ve H E beyaz kutularına büyütülmüş görünümlerini ve F. ölçek barlar = 20 µm (A-F), 5 mikron (G-H). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Mitokondrial boyutu frekans Histogram. Mitochondrialsurface veri kendi cilt (µm3) göre çeşitli depo gözlerinizin her biri mevcut mitokondri yüzdesi görselleştirmek için boyutu frekans çubuk grafik olarak sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı izole etmek, ölçmek ve boyutu ve sinir özgü mitokondri içinde IENFs 3D insan cilt biyopsileri üzerinden dağıtımını çözümlemek için tasarlanmıştır. Protokolünde çeşitli kritik adımlar vardır. Serbest dalgalanma Floresans immünhistokimya leke ve her örneğinde, Araştırma araştırma44,45için daha çok yönlü bir metodoloji sağlayan Çoklu sinyaller çözümlemek için tasarlanmıştır. Bu yordamı confocal mikroskobu görüntüleri ve 3D analiz kazanılması için gerekli olan 50 µm bölüm boyunca görüntüler edinimi en üst düzeye çıkarmak için doku içine antikorların penetrasyon için izin verir. Diğer kritik adım mitokondri ölçmek için çözünürlük koruyarak yeterli sinirler resim başına yakalayan arasında dengeli görüntü edinme parametreleri olduğunu. Bu doku bölümleri kullanılan ve standart deri biyopsi yaklaşık 3 mm uzun45,46,47,48iletişim kurallarıdır. Edinme parametreleri bu protokolü yakalamada yeterli ortalama 4-6 sinir lifleri resim başına içerecek şekilde epidermisin nitelendirdi. Örnekleme daha yüksek çözünürlükte sinirler her görüntü, özellikle Nyquist örnekleme sayısı önemli ölçüde azaltacaktır. Üçüncü önemli bir adım çözünürlük ve kontrast özellikle mitokondri için sinyallerin geliştirmek için deconvolution algoritmaları kullanmaktır. Deconvolution daha yüksek çözünürlükte değil örnekleme telafi etmek için yardım görüntüler. Son önemli adım sinir özgü mitokondri epidermis hücreleri ile ilişkili mitokondri üzerinden yalıtmak için görüntü analiz yazılımı kullanmaktır. Bu sinir içinde Yerelleştir mitokondrial sinyal dışarı kırpmak için bir maskeleme aracı olarak sinir yüzeyi kullanarak gerçekleştirilir.
Bu tekniğin dikkate almak olası bazı değişiklikler vardır. Bir olası değişiklik Floresans immünhistokimya süresini kısaltmak için olurdu. Gecede incubations birincil ve ikincil antikor çözümleri 4 ° C'de 3-4 saat oda sıcaklığında kısaltılmış. Dikkat yoksul sinyal-gürültü önlemek için alınması gereken ancak, oda sıcaklığında daha kısa incubations kez arka plan Floresan, artış çok. Başka bir olası değişiklik görüntü alma parametrelerini ayarlamak için olurdu. Yukarıda belirtildiği gibi burada açıklanan resim alma önyargılı yüksek görüntü çözünürlüğü görüntü başına sinirler makul sayıda yakalama doğru. 63 x yağı daldırma amacı ile 1.3 sayısal diyafram gibi daha yüksek bir büyütme objektif kullanmak mümkündür. Tüm parametreleri aynı kaldı ve 63 X amaç kullanıldı, XY resim alanı için 112 µm x 112 µm azaltılacak ve bu nedenle sinirler resim başına ortalama sayısını azaltın. Esas nokta edinme ve daha sonraki analiz boyunca tutarlı parametrelerini kullanmaktır.
Bu teknik ana sınırlandırılması zaman alıcı olmasıdır. İmmünhistokimya doku işlemek için 3 gün sürer, resim alma kaç optik z-adımlar alınır bağlı olarak resim başına yaklaşık 30-50 dakika sürer ve görüntü işleme/analizi yaklaşık 20 dakika sürer. Bu önemli süre taahhüdü ama sonunda önemli xarakteristikaları ölçümler verir. Bu tekniğin bir başka sınırlama başına görüntü örneklenmiş epidermisin sınırlı alandır. Ancak, bu gelişmeler daha hızlı bilgisayar işlemcileri ve analiz yazılımı ile birlikte geliştirilmiş çözünürlük ile görüntü Alım fiyatlarına yapıldıkça şüphesiz artıracaktır.
Bu iletişim kuralı diğer yöntemler üzerinde önemi confocal mikroskobu ve 3D görüntü analizi ile floresan immünhistokimya birleştiren güç mevcuttur. Geleneksel olarak, intraepidermal Sinir lifi analizi dayalı Kromojen immünhistokimya ve nöropati45,47,49klinik tanı için özellikle parlak alan mikroskobu ile yapılır. Floresans immünhistokimya kullanımı, leke ve her örneğinde, Araştırma araştırma44,45için daha çok yönlü bir metodoloji sağlayan Çoklu sinyaller analiz olanak verir. Bu tekniğin ilgi, bu durumda sinir özgü mitokondri, karmaşık sinyalinden mitokondri epidermal hücrelerle ilişkili belirli bir sinyal izole etmek için bir strateji sağlar.
Bu teknik kullanışlılığı gelecekteki uygulamalarda güçtür. Yeteneği yalıtmak ve sinir özgü mitokondri ölçmek değişiklik hastalığı kaynaklı boyutu ve mitokondri dağılımını değerlendirmek sağlar. Birden çok nörolojik komplikasyonlar mitokondrial disfonksiyon hastalık potansiyel bir mekanizma olarak karıştığı. Özellikle, bu teknik değiştirilmiş bir sürümü diyabet ve diyabetik periferik nöropati hastaları sinir özgü mitokondri yaş eşlemeli için göre dağılımı ve boyutu ölçülebilir değişimler var göstermek için kullanılan 50denetler. Bu tekniği geliştirmek ya da duyusal neuropathies tedavi için tasarlanmış tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için yararlı olacaktır. Son olarak, bu teknik çok yönlülük floresan diğer sinyalleri verilerin bir alt kümesini yalıtmak için bir floresan sinyal kullanın analizleri geniş bir yelpazesi için geçerli yapar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir bildirmek için çıkar çatışması.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal kurumları sağlık hibe K08 NS061039-01A2, Nöroloji araştırma için Program tarafından desteklenen & keşif ve A. Alfred Taubman Tıbbi Araştırma Enstitüsü Michigan Üniversitesi'nde. Bu eser morfoloji ve görüntü analiz çekirdek Michigan diyabet araştırma merkezinin Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 5 P 90 DK-20572 diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları tarafından finanse edilen kullanılır. Yazarlar insan deri örnekleri onların cömert bağış için J. Robinson Singleton ve A. Gordon Smith (Utah Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | To make up 1x PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding |
| Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody |
| Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abbreviated as PDH |
| Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | red-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | green-fluorescent conjugated secondaryantibody |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abbreviated as BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abbreviated as TX-100 |
| 0.22 µm Filter | EMD Millipore, Billerica MA |
MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µm Millipore filter |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Non-calibrated Loop | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-well Assay Plate | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-well flat bottom plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI staining of nuclei |
| Microscope Cover Glass 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Confocal Microscope |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | version 4.4.0 | Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing |
| Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software | Bitplane, Concord, MA | version 7.7.1 | Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | version Office 2013 | Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features |
| Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abbreviated as OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Cryostat for cutting 50 µm sections |
| CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal |
References
- Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
- Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
- Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
- Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
- Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
- Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
- Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
- Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
- Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
- Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
- Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
- Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
- Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
- Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
- Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
- Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
- Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
- Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
- Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
- Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
- Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
- Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
- Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
- Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
- Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
- Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
- Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
- Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
- Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
- Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
- Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
- Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
- Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
- Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
- Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
- Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
- Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
- Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).
