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Neuroscience

तीन आयामी इमेजिंग और मानव Intraepidermal तंत्रिका तंतुओं के भीतर Mitochondria का विश्लेषण

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/53369
Automatic Translation
1, 2, 2, 3
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

Summary

यह प्रोटोकॉल त्रि-आयामी (3d) इमेजिंग और विश्लेषण तकनीकों का उपयोग करता है जो कि तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria को विज़ुअलाइज़ और बढ़ाता है । तकनीक अन्य स्थितियों जहां एक फ्लोरोसेंट संकेत एक और फ्लोरोसेंट संकेत से डेटा का एक सबसेट को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए लागू कर रहे हैं ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य intraepidermal तंत्रिका तंतुओं के भीतर mitochondria अध्ययन करने के लिए है । इसलिए, 3d इमेजिंग और विश्लेषण तकनीकों तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria को अलग करने और संवेदी नसों के बाहर की नोक में mitochondria के रोग प्रेरित परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया था । प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति immunohistochemistry, फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी छवि विश्लेषण तकनीक को जोड़ती है और कल्पना को तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria यों तो । विस्तृत मापदंडों प्रक्रियाओं भर में परिभाषित कर रहे हैं क्रम में कैसे इन तकनीकों का उपयोग करने के लिए तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria को अलग करने का एक ठोस उदाहरण प्रदान करने के लिए. एंटीबॉडी को लेबल तंत्रिका और त्वचा पंच बायोप्सी, जो अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बाद किया गया था के ऊतक वर्गों के भीतर mitochondrial संकेतों को क्रमशः एक हरे और लाल फ्लोरोसेंट संकेत के साथ नसों और mitochondria कल्पना किया गया । Z-श्रृंखला छवियों को फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहीत किया गया था प्रक्रिया और संकेतों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल । यह आवश्यक नहीं है सटीक मापदंडों का पालन करने के भीतर वर्णित है, लेकिन यह धुंधला, अधिग्रहण और विश्लेषण कदम भर में चुना लोगों के साथ संगत होना जरूरी है । इस प्रोटोकॉल की ताकत यह है कि यह परिस्थितियों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है, जहां एक फ्लोरोसेंट संकेत अंय संकेतों है कि अंयथा अकेले अध्ययन असंभव होगा अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Introduction

Mitochondria महत्वपूर्ण सेलुलर कार्य करता है कि सेल ऊर्जा का उत्पादन शामिल है, कैल्शियम बफर, और गल और अपोप्तोटिक कोशिका मृत्यु1,2,3विनियमन । तंत्रिका तंत्र शरीर की तुलना में एक उच्च चयापचय दर है4 सुझाव है कि न्यूरॉन्स mitochondrial श्वसन के माध्यम से adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के रूप में सेलुलर ऊर्जा के एक उच्च डिग्री उत्पन्न. सबूत के दस्तावेजों का एक बहुत है कि ंयूरॉंस कार्य5, विशेष रूप से synapses6पर पर निर्भर हैं । इसलिए, न्यूरॉन्स के भीतर mitochondria का वितरण महत्वपूर्ण है.

पिछले 10 वर्षों में बहुत सी जानकारियों से पता चला है कि न्यूरॉन mitochondria की तस्करी और डॉकिंग अत्यधिक विनियमित है । मोटर प्रोटीन ंयूरॉन भर में विशिष्ट सेलुलर डिब्बों को mitochondria वितरण में शामिल हैं । mitochondria के नलए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि न्यूरॉन्स परियोजना axons और dendrites सोमा से दूर है । Kinesin मोटर प्रोटीन मुख्यतः प्रत्यक्ष anterograde (सोमा से दूर) के नलए mitochondria के साथ microtubules जबकि dynein मोटर प्रोटीन प्रत्यक्ष प्रतिगामी (सोमा की ओर) गतिशीलता7,8,9 , 10. वहां सेलुलर संकेत कर रहे है ऐसी mitochondrial झिल्ली क्षमता और आवेग आचरण कि उपस्थिति और mitochondrial के नलए11,12,13की दिशा को प्रभावित करते हैं ।

mitochondria परिवहन के अलावा, वहां विशेष प्रोटीन Ranvier और synapses8,14के नोड्स के रूप में उच्च ऊर्जा मांग है कि विशिष्ट सेलुलर डिब्बों के लिए mitochondria स्थानीयकृत कर रहे हैं, 17. वास्तव में, axons के भीतर mitochondria के बहुमत गैर-gram9,13,18हैं । syntaphilin लंगर mitochondria की तरह विशेष प्रोटीन axons साथ microtubules के लिए जबकि अंय प्रोटीन लंगर mitochondria actin के लिए cytoskeleton19-21। विकास कारकों और कैल्शियम जैसे आयनों mitochondria आंदोलन की समाप्ति का समर्थन करने के लिए उन्हें क्षेत्रों जहां वे21,22,23की जरूरत है स्थानीयकृत करने के लिए सूचित किया गया है ।

एक साथ ले लिया, तस्करी और mitochondria के डॉकिंग ंयूरॉंस के समुचित कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस के समर्थन में, mitochondrial तस्करी में व्यवधान अल्जाइमर रोग, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, Charcot-Marie-टूथ रोग, हटिंगटन रोग, वंशानुगत स्पास्टिक सहित कई स्नायविक स्थितियों के साथ जुड़ा हुआ है paraparesis, और ऑप्टिक शोष15,24,25,26,27। हाल के अध्ययनों से मधुमेही न्यूरोपैथी के लिए एक संभावित तंत्र के रूप में mitochondrial शिथिलता और विकृति पर ध्यान केंद्रित किया है, संवेदी हानि मधुमेह के साथ जुड़े28,29,30,31 ,३२,३३. परिकल्पना यह है कि मधुमेह चमड़े के नीचे तंत्रिका के संवेदी अनुमानों के भीतर mitochondria के वितरण में परिवर्तन समाप्त । इसलिए, एक तकनीक कल्पना और intraepidermal तंत्रिका तंतुओं (IENFs), पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि संवेदी afferents के बाहर युक्तियों के भीतर mitochondria यों तो विकसित किया गया था । तकनीक विशेष mitochondrial और फोकल माइक्रोस्कोपी जेड के साथ तंत्रिका फाइबर लेबल के प्रतिदीप्ति immunohistochemistry को जोड़ती है-शक्तिशाली 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संकेतों की श्रृंखला अधिग्रहण तंत्रिका-विशिष्ट के वितरण को मापने के लिए इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए मानव चर्म पंच बायोप्सी से mitochondria ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > त्वचा पंच बायोप्सी विषयों है कि एक बड़े समुदाय से भर्ती किया गया था से प्राप्त किया गया प्राथमिक देखभाल नेटवर्क आधारित यूटा के विश्वविद्यालय में मधुमेह केंद्र (साल्ट लेक सिटी, केंद्र शासित प्रदेशों). यह अध्ययन मिशिगन विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और हेलसिंकी की घोषणा के सिद्धांतों का अनुपालन । लिखित सूचित सहमति परीक्षण से पूर्व प्रत्येक विषय से प्राप्त किया गया था ।

< p class = "jove_title" > 1. प्रतिदीप्ति Immunohistochemistry

  1. बायोप्सी तंत्रिका फाइबर intraepidermal के लिए पंच Immunohistochemistry तैयार करें:
    1. चिकित्सा स्टाफ द्वारा 3 मिमी त्वचा बायोप्सी प्रदर्शन और १.५ में पूरी बायोप्सी जगह एमएल Zamboni & #39; एस निर्धारण समाधान (2% paraformaldehyde, ०.३% फास्फेट में संतृप्त picric एसिड buffered खारा (पंजाब), पीएच ७.४) पर 4 & #176; सी रात भर.
      2. पंजाब में 30% सुक्रोज के समाधान के साथ
    2. कुल्ला नमूने 4 & #176; ग के लिए 16-24 ज या जब तक नमूना डूब.
    3. इष्टतम काटने तापमान यौगिक में एंबेड नमूनों (OCT) एक cryomold का उपयोग कर । एपिडर्मिस के साथ पूरे 3 मिमी बायोप्सी प्लेस मोल्ड में नीचे का सामना करना पड़ रहा है और के साथ मोल्ड को भरने अक्टूबर के लगभग 2 मिलीलीटर कुचल सूखी बर्फ पर मोल्ड फ्रीज । Store at-८० & #176; C जब तक उपयोग करने के लिए तैयार है ।
    4. कट ५० & #181; मी थिक क्रॉस अनुभागों का उपयोग कर एक cryostat और एक ९६-well प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्टोर का उपयोग १८० & #181; L एंटीफ्रीज़र भंडारण समाधान प्रति खैर (30% ईथीलीन ग्लाइकोल, पंजाब में 30% ग्लिसरॉल). निंनलिखित दिशाओं एक ९६ अच्छी तरह से थाली के 8 कुओं के लिए कर रहे हैं । प्रत्येक बायोप्सी साइट से दाग वर्गों है कि २००-३०० & #181; मी एक दूसरे से दूर है ।
< प वर्ग = "jove_content" > DAY 1:

< राजभाषा प्रारंभ = "2" >
  • बुझाना गैर-विशिष्ट लेबलिंग की परत corneum:
    1. लेबल ९६-well थाली के रूप में दिखाया < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 .
    2. प्लास्टिक १५० & #181; शेयर संकेत बढ़ाने के एल माध्यमिक एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए समाधान < सुप वर्ग = "xref" > ३४ , < सुप वर्ग = "xref" > ३५ प्रत्येक वेल. एक inoculating लूप का उपयोग कर संकेत बढ़ाने समाधान में वर्गों स्थानांतरण.
      नोट: ऊतक के हानिकारक या ऊतक वर्गों फाड़ से बचने के लिए के साथ काम करते समय ध्यान रखना । एक फ्लैट घुमाव पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए संकेत बढ़ाने समाधान में रखें.
    3. 2 पंक्तियां और 3 में कुल्ला कुओं तैयार १५० & #181 जोड़कर ९६-अच्छी तरह से थाली, एक अच्छी तरह से 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) के एल ।
    4. ध्यान से पंक्ति 2 में वर्गों हस्तांतरण और 10 मिनट के लिए 1x पंजाब में कुल्ला कमरे के तापमान पर ।
    5. के कमरे के तापमान (पंक्ति 3) में 10 मिनट के लिए 1x पंजाब में एक दूसरी बार कुल्ला ।
  • तैयार 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) समाधान अवरुद्ध:
    1. 5% BSA और ०.३% ट्राइटन X १०० (TX-१००) में ०.१ एम पंजाबियों है (देखें तालिका 1 ), जबकि वर्गों में मशीन कर रहे हैं तैयार संकेत बढ़ाने समाधान । BSA आसानी से समाधान में नहीं जाता है । भंवर समाधान जब तक BSA पूरी तरह से घुल.
    2. ९६-खैर प्लेट की पंक्ति 4 में ब्लॉकिंग कुओं को तैयार १५० & #181 जोड़कर; 5% के एल एक अच्छी तरह से समाधान अवरुद्ध BSA ।
    3. 5% के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरण वर्गों BSA समाधान और एक फ्लैट घुमाव पर कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए समाधान अवरुद्ध 5% BSA में मशीन वर्गों को अवरुद्ध.
  • तैयार 1% BSA कुल्ला समाधान और प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने:
    1. 1% कुल्ला समाधान तैयार करें जिसमें 1% BSA और ०.३% TX-१०० में ०.१ M पंजाब (देखें Table 2 ) जबकि सेक्शन हैं 5% BSA अवरुद्ध समाधान में मशीन । BSA आसानी से समाधान में नहीं जाता है । भंवर समाधान जब तक BSA पूरी तरह से घुल.
    2. 1% BSA धोने समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला जबकि वर्गों 5% BSA अवरुद्ध समाधान में मशीन कर रहे हैं ।
      1. Make १,५०० & #181; प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के एल और पंक्ति में प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें 5.
      2. प्राथमिक एंटीबॉडी पतला: तंत्रिका-विशिष्ट लेबल का उपयोग करें, खरगोश polyclonal विरोधी प्रोटीन जीन उत्पाद ९.५ () 1:1000 पर mitochondria-विशिष्ट लेबल का उपयोग करें, माउस मोनोक्लोनल anti-पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज E2/E3bp एंटीबॉडी (PDH) 1:100 पर 1% BSA कुल्ला समाधान.
  • तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी:
    1. प्लास्टिक १५० & #181; प्राथमिक एंटीबॉडी के एल ९६-वेल प्लेट की पंक्ति 5 में प्रत्येक कुआं में.
    2. लूप उपकरण का उपयोग करते हुए, ब्लॉकिंग समाधान (पंक्ति 4) से वर्गों को प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त पंक्ति 5 में स्थानांतरित करें ।
    3. प्लेट को कसकर parafilm के साथ लपेट कर बाहर सूखने से रख दें.
      4. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर फ्लैट झूली कुरसी पर
    4. जगह नमूने, और फिर एक फ्लैट झूली कुरसी पर रात भर 4 & #186; C पर नमूने की मशीन ।
    • < प वर्ग = "jove_content" > DAY 2:

    < राजभाषा प्रारंभ = "6" >
  • कुल्ला नमूने:
    1. की पंक्तियों में कुल्ला कुओं को तैयार 6, 7 और 8 ९६-अच्छी तरह से प्लेट जोड़कर १५० & #181; एल 1% BSA एक अच्छी तरह से समाधान में कुल्ला ।
    2. पहले 1% BSA धोने समाधान (पंक्ति 6) और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन में स्थानांतरण वर्गों । दोहराने 1% में वर्गों की मशीन द्वारा और अधिक दो बार कुल्ला BSA 7 पंक्तियों में समाधान धोने और कमरे के तापमान पर 1 एच प्रत्येक के लिए 8 ।
  • पतला माध्यमिक एंटीबॉडी 1% BSA में कुल्ला समाधान:
    1. Make १,५०० & #181; माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के एल जबकि वर्गों 1% BSA कुल्ला समाधान (पंक्ति 8) के अंतिम धोने में मशीन हैं ।
    2. पतला माध्यमिक एंटीबॉडी: के लिए 9.5 (ग्रीन-फ्लोरोसेंट संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी, 1:1000), PDH के लिए (लाल-फ्लोरोसेंट संयुग्मित बकरी विरोधी माउस, 1:1000) 1% BSA में कुल्ला समाधान ।
  • तैयार सेकेंडरी एंटीबॉडी:
    1. प्लास्टिक १५० & #181; एल ऑफ सेकंडरी एंटीबॉडी की पंक्ति 9 में ९६-वेल प्लेट.
    2. धीरे से वर्गों 1% BSA कुल्ला समाधान (पंक्ति 8) माध्यमिक एंटीबॉडी वेल्स (पंक्ति 9) में स्थानांतरित.
    3. का प्रयोग parafilm, प्लेट को कसकर लपेट कर बाहर सूखने से रख दें । एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर । 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर फ्लैट घुमाव पर नमूनों प्लेस, और फिर रात भर एक फ्लैट झूली कुरसी पर 4 & #730; C पर नमूने की मशीन ।
    • < प वर्ग = "jove_content" > DAY 3:

    < राजभाषा प्रारंभ = "9" >
  • एक ०.२२ & #181 के माध्यम से फ़िल्टर करके क्लीन 1x पंजाबन तैयार करें; मी फिल्टर:
    1. प्लास्टिक १५० & #181; पंक्ति 10, 11, और 12 में फ़िल्टर 1x पंजाबियों के एल ।
    2. स्थानांतरण नमूने पंक्ति 10 और 1 ज के लिए 1x पंजाब में कुल्ला कमरे के तापमान पर । आवरण के दौरान एल्यूमीनियम पंनी और जगह के साथ एक फ्लैट झूली कुरसी पर ९६-अच्छी तरह से थाली को कवर । दोहराना फ़िल्टर 1x पंजाबियों के लिए दो बार कुल्ला 1 h प्रत्येक पंक्ति में कमरे के तापमान पर 11 और 12.
  • बढ़ते ऊतक वर्गों के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार:
    1. प्लेस ५० & #181; एक स्लाइड पर फ़िल्टर 1x पंजाबियों के एल.
      2. 1x पंजाब (पंक्ति 12) से
    2. अंतरण खंड ५० & #181; L ड्रॉप । ध्यान से इस ऊतक का खुलासा और धीरे से कांच स्लाइड पर समतल द्वारा पंजाबियों की बूंद में खंड की स्थिति । बढ़ते रिएजेंट कमजोर से बचने के लिए एक ग्लास पिपेट के साथ अतिरिक्त पंजाबियों को हटा दें । कांच बल्ब के साथ वर्गों को छूने मत करो ।
    3. प्लास्टिक 1-2 की बूंदों बढ़ते रिएजेंट के ऊपर सीधे खंड के शीर्ष पर माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करने के लिए अनुभाग के उन्मुखीकरण परेशान नहीं करने के लिए DAPI युक्त. धीरे अनुभाग पर एक ५० मिमी x 24 मिमी #1 .5 माइक्रोस्कोप ग्लास coverslip जगह.
      4. coverslip रखने और coverslip के किनारों से अधिक तरल पोंछने के दौरान गठन किया है कि किसी भी हवा बुलबुले स्पष्ट
    4. । एक नई स्लाइड तैयार करें और बढ़ते पीआर दोहरानेप्रत्येक अनुभाग के लिए ocess.
    5. इलाज/बढ़ते मीडिया को कमरे के तापमान पर रात भर अंधेरे में रखकर स्लाइडें बनाकर सुखाएं । स्लाइड् स को 4 & #176 पर स्थानांतरित करें; c अल्पकालिक (1-2 सप्ताह) के लिए या-20 & #176 के लिए लंबी अवधि के भंडारण (2 सप्ताह से अधिक) के लिए सी.
      नोट: नकारात्मक नियंत्रण 1.4.2.2 चरण में 9.5 या PDH के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी लोप और एपिडर्मिस में नसों या mitochondria का कोई अलग लेबलिंग प्रदर्शित । सकारात्मक नियंत्रण PDH एंटीबॉडी के लिए प्रदर्शन किया गया यह साबित करने के लिए सभी mitochondria लेबल (डेटा नहीं दिखाया गया है) । सकारात्मक नियंत्रण पर प्रदर्शन किया गया था संस्कृति प्राथमिक माउस पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि न्यूरॉन्स कि एक baculovirus के साथ transduced थे लेबल करने के लिए एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ mitochondria (GFP) संकेत और फिर स्थिर और PDH एंटीबॉडी और लाल फ्लोरोसेंट के साथ दाग माध्यमिक एंटीबॉडी. GFP व्यक्त कर रहे थे कि सभी mitochondria PDH immunohistochemistry के लिए लाल लेबल के साथ सह-लेबल थे (डेटा नहीं दिखाया गया).
    • < p class = "jove_title" > 2. फोकल इमेजिंग

    1. प्रदर्शन फोकल इमेजिंग:
      1. एक औंधा माइक्रोस्कोप पर एक 40X तेल-विसर्जन (१.२५ संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ फोकल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग का उपयोग कर छवियों को इकट्ठा ।
        1. प्रत्येक फोकल विमान में क्रमिक रूप से फ्लोरोसेंट संकेतों का अधिग्रहण:
          नाभिक: उत्तेजना & #955; = ४०५ एनएम, वर्णक्रमीय उत्सर्जन फ़िल्टर & #955; = ४२०-४८० एनएम
          तंत्रिका तंतु: उत्तेजना & #955; = ४८८ एनएम, वर्णक्रमीय उत्सर्जन फ़िल्टर & #955; = ५०५-५६० एनएम
          Mitoch ondria: उत्तेजना & #955; = ५४३ एनएम, वर्णक्रमीय उत्सर्जन फ़िल्टर & #955; = ६०६-६७० एनएम
      2. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में निम्नलिखित स्कैन मापदंडों दर्ज करें: 2 फ्रेम औसत और २.२ के ज़ूम के साथ ६०० हर्ट्ज की दर स्कैन; 12-bit तीव्रता संकल्प (४०९६ ग्रे स्तर) ।
        1. अनुकूलित पार्श्व संकल्प के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर सेट (स्कैन संकल्प = १,०२४ x १,०२४) और अक्षीय संकल्प/ऑप्टिकल खोदी (फोकल एपर्चर = 1 हवादार इकाई (AU) z-चरण आकार के साथ २१० एनएम).
          नोट: परिणामी XYZ रिज़ॉल्यूशन है १७२.२ एनएम x १७२.२ एनएम x २१० एनएम के साथ एक छवि आकार १७६.१ & #181; m x १७६.१ & #181; म x 30-50 & #181; m.
      3. तंत्रिका संकेत (ग्रीन-प्रतिदीप्ति) के लिए एक जीवित स्कैन को सक्रिय करने और खोजने के लिए और ऊतक अनुभाग के भीतर तंत्रिका संकेत शामिल है कि माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में ऊपरी और निचले फोकल विमानों को स्थापित करने के लिए जेड फोकस नियंत्रण को समायोजित करें । कुल z-सीमा सामान्यतया 30-50 & #181; m के लिए ५० & #181; m टिशू सेक्शन.
      4. एपिडर्मिस क्षैतिज या खड़ी छवि में तैनात है ताकि एक लाइव स्कैन के दौरान माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ स्कैन क्षेत्र घुमाएँ.
      5. प्रत्येक सिग्नल को अलग से स्कैन करें और डिटेक्टर को समायोजित करें (photomultiplier ट्यूब, PMT) वोल्टेज और ऑफ़सेट को कम करने के लिए और संतृप्त पिक्सेल के अंतर्गत किसी भी पर निकालें.
        नोट: ऊपर मापदंडों के साथ स्कैन बार z स्लाइस की संख्या के आधार पर लगभग 20-40 मिनट ले लो ।
    < p class = "jove_title" > 3.3 डी दृश्य और मानव Mitochondria तंत्रिका तंतुओं के भीतर Intraepidermal का विश्लेषण

    1. 3d एपिडर्मिस को अलग करें:
      1. मूल छवि डुप्लिकेट और अधिकतम तीव्रता का उपयोग प्रोजेक्शन (एपिडर्मिस.
        2. को पहचानने और अलग करने के लिए छवि का विस्तारित फ़ोकस दृश्य)
      2. ब्याज उपकरण के एक क्षेत्र का उपयोग करने के लिए एपिडर्मिस के ऊपरी और निचले किनारों के साथ पता लगाने के लिए ऐसी परत corneum और dermis कि intraepidermal तंत्रिका तंतुओं के अनुपस्थित के रूप में अवांछित क्षेत्रों को हटा दें । इस चयन के लिए क्रॉप करें.
    2. तंत्रिका और deconvolution फ्लोरोसेंट संकेतों पर mitochondrial का उपयोग करें:
      नोट: deconvolution फ्लोरोसेंट संकेतों की अखंडता को बहाल करने में मदद करता है । बहाली इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अंधा deconvolution कहा जाता है क्योंकि यह छवियों में फ्लोरोसेंट संकेतों का उपयोग करता है निर्धारित करने के लिए कितना अपने मूल स्रोत से फैल संकेतों (बिंदु प्रसार समारोह) । इस प्रक्रिया में संकेत समाधान वापस अपने मूल स्थान में फैले संकेत को सुधारता है ।
      1. ग्रीन फ्लोरोसेंट तंत्रिका संकेत के लिए एक बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) की गणना (ग्रीन-प्रतिदीप्ति) निम्नलिखित मापदंडों के साथ:
        1. सेट की गणना पीएसएफ के लिए फोकल । मध्यम अपवर्तन सूचकांक को १.५१५ और संख्यात्मक एपर्चर को १.२५ पर सेट करें । 1 हवादार इकाई (A.U.) को डिटेक्टर pinhole सेट करें । सेट लेजर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए ४८८ एनएम और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य ५१५ एनएम के लिए ।
      2. लाल फ्लोरोसेंट mitochondrial संकेत के लिए एक पीएसएफ की गणना (लाल-प्रतिदीप्ति) निंनलिखित मापदंडों के साथ:
        1. सेट की गणना पीएसएफ को फोकल । मध्यम अपवर्तन सूचकांक को १.५१५ और संख्यात्मक एपर्चर को १.२५ पर सेट करें । 1 AU को डिटेक्टर pinhole सेट करें । सेट लेजर उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए ५४३ एनएम और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य ६१७ एनएम के लिए ।
      3. deconvolution द्वारा तंत्रिका और mitochondria फ्लोरोसेंट संकेतों का अनुकूलन इसी PSFs ऊपर सूचीबद्ध और चलने बहाली १००% आत्मविश्वास और 10 चक्र के एक पुनरावृत्ति सीमा पर सेट सुविधा का उपयोग कर ।
    3. तंत्रिका-विशिष्ट सतहों को बनाएं:
      1. का प्रयोग & #34; बनाएं भूतल & #34; उपकरण से नसों की एक ठोस सतह बनाने के लिए deconvolved ग्रीन-फ्लोरोसेंट माध्यमिक के लेबलिंग के लिए
      2. अचयनित द & #34; स्मूथ & #34; सुविधा और तंत्रिका संकेत के लिए सीमा निर्धारित करने के लिए निरपेक्ष तीव्रता सुविधा का उपयोग के बाद से यह काफी उज्ज्वल पृष्ठभूमि से प्रतिदीप्ति.
      3. निरपेक्ष तीव्रता सुविधा का उपयोग तंत्रिका संकेत के लिए सीमा निर्धारित करने के बाद से यह काफी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से उज्जवल है । सेट थ्रेशोल्ड मान सही नसों की पहचान करने के लिए काफी कम है ।
      4. आकार के आधार पर छोटे, गैर-तंत्रिका सतहों को फ़िल्टर करें ।
        नोट: यदि आवश्यक हो, तो मैन्युअल रूप से अतिरिक्त गैर-तंत्रिका सतहों के भीतर संपादित करें & #34; संपादित करें & #34; टैब नियंत्रण कुंजी एकाधिक ऑब्जेक्ट्स को हाइलाइट करें और तब उन्हें हटाएँ कुंजी के साथ हटाने के लिए पकड़ कर ।
    4. अलग तंत्रिका-विशिष्ट फ्लोरोसेंट mitochondrial संकेत:
      1. का चयन करें तंत्रिका सतह के संपादन टैब को देखने के लिए & #34; मास्क गुण & #34; सुविधा । ३.३ चरणों में बनाई गई तंत्रिका सतह keratinocytes.
        2. के साथ जुड़े mitochondrial संकेतों से दूर उन नसों के भीतर mitochondria को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है
      2. के रूप में & #34; मास्क All & #39; बटन खोलता है a & #34; मास्क चैनल & #34; विंडो, के अंतर्गत पुल डाउन मेनू से deconvolved लाल-फ्लोरोसेंट संकेत चुनें & #34; चैनल चयन & #34; mitochondrial संकेत के लिए.
      3. को मास्क & #34 लागू करने से पहले & #34;d uplicate चैनल में चेक मार्क लगाने के लिए बॉक्स में क्लिक करें; विकल्प.
      4. के सामने रेडियो बटन पर क्लिक करें & #34; स्थिरांक अंदर/बाहर & #34; मास्क सेटिंग का ऑप्शन और चेक मार्क लगाने के लिए बॉक्स में क्लिक करें & #34; voxel बाहर की सतह पर सेट & #34; विकल्प और मान के लिए ०.०० में लिखें । तंत्रिका की सतह के भीतर mitochondrial संकेतों का प्रतिनिधित्व करता है कि नया चैनल बनाने के लिए ठीक बटन पर क्लिक करें.
    5. बनाएं mitochondria-विशिष्ट सतहों:
      1. का उपयोग करें & #34; बनाएं भूतल & #34; उपकरण से तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria संकेतों के नव निर्मित फ्लोरोसेंट चैनल से mitochondrial की एक ठोस सतह बनाने के लिए कदम ३.४.
      2. अचयनित द & #34; स्मूथ & #34; फीचर और चुनें & #34; पृष्ठभूमि घटाव & #34; सुविधा थ्रेशोल्ड सेट करने के लिए । यह सुविधा पृष्ठभूमि से mitochondria की पहचान करने के लिए mitochondrial संकेत के आस-पास स्थानीय कंट्रास्ट का उपयोग करती है ।
      3. सेट थ्रेशोल्ड मान सही mitochondria की पहचान करने के लिए काफी कम है । इस उदाहरण में कम थ्रेशोल्ड २,००० पर एक 16-बिट (६५,५३६) स्केल के लिए सेट किया गया था ।
        4. आकार के आधार पर
      4. फ़िल्टर mitochondrial सतहों । इस उदाहरण में voxel सीमा १.० voxels के लिए निर्धारित की गई थी, जो सबसे कम संभव सीमा । यदि आवश्यक हो, तो गैर-mitochondria सतहों को मैंयुअल रूप से संपादित करें & #34; edit & #34; टैब नियंत्रण कुंजी को दबाकर एकाधिक ऑब्जेक्ट्स का चयन करें और तब उंहें Delete कुंजी के साथ हटाने के लिए ।
        नोट: कभी-कभार, सॉफ्टवेयर सतहों कि एक विशिष्ठ फ्लोरोसेंट mitochondrial संकेत के साथ जुड़े नहीं है पैदा करेगा । इन मामलों में, यह संभव है कि उन्हें & #34 के साथ हटा दें; Edit & #34; tab.
    6. विश्लेषण के लिए morphometric मानों का निर्यात और परिकलन करें:
      1. से तंत्रिका और mitochondrial सतहों के लिए मानों का निर्यात & #34; सांख्यिकी & #34; इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर के साथ और अधिक विश्लेषण के लिए टैब ।
      2. दोनों तंत्रिका और mitochondrial सतहों के लिए वॉल्यूम मान निर्यात करें ।
      3. प्रत्येक छवि में व्यक्तिगत तंत्रिका फाइबर मौजूद है और इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट में मूल्य रिकॉर्ड की संख्या गिनती ।
        4. प्रत्येक छवि के लिए
      4. , इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट में विश्लेषण के लिए निम्न संभावित मानों की गणना:
        1. सभी तंत्रिका सतहों के लिए मात्रा का योग.
        2. से कम ०.०२ & #181 की मात्रा के नीचे तंत्रिका-विशिष्ट mitochondrial सतहों बाहर फिल्टर; m 3 और बिन आकार के द्वारा सतहों । उदाहरण के लिए, ०.०२-०.०४, ०.०४-०.०८, ०.०८-०.१६, ०.१६-०.३२, ०.३२-०.६४, ०.६४-१.२८, १.२८-२.५६, से अधिक २.५६ & #181; m 3 .
          के रूप में डिब्बे का उपयोग करें नोट: mitochondrial वॉल्यूम की निचली सीमा ०.०२ & #181 पर सेट थी; m 3 के पहले प्रकाशित संस्करणों के आधार पर mitonchodria < सुप class = "xref" > 36 , < सुप class = "xref" > 37 , < सुप class = "xref" > 38 .
        3. प्रत्येक बिन के भीतर तंत्रिका-विशिष्ट mitochondrial सतहों की संख्या और डिब्बे पर सतहों की कुल संख्या गिनती (०.०२-से अधिक २.५६ & #181; m 3 ).
        4. प्रत्येक बिन में तंत्रिका-विशिष्ट mitochondrial सतहों के अनुपात की गणना । mitochondria सतहों की कुल संख्या से विभाजित प्रति बिन गिनती का उपयोग करें ।
        5. सभी तंत्रिका-विशिष्ट mitochondrial सतहों के लिए वॉल्यूम का योग ।
        6. सभी mitochondrial सतह मात्रा का योग द्वारा कुल तंत्रिका सतह की मात्रा को विभाजित करके mitochondrial संकेत के साथ तंत्रिका के अनुपात की गणना.
        7. सभी mitochondrial सतहों की गिनती के द्वारा कुल तंत्रिका सतह मात्रा विभाजित करके तंत्रिका मात्रा प्रति mitochondria की संख्या की गणना.

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    Representative Results

    मानव IENFs के भीतर mitochondria का विज़ुअलाइज़ेशन और ठहराव

    प्रतिदीप्ति immunohistochemistry मानव त्वचा बायोप्सी के भीतर कई संकेतों के एक साथ लेबलिंग के लिए नसों, mitochondria, और नाभिक कल्पना की अनुमति देता है । एक ९६-अच्छी तरह से थाली immunohistochemistry प्रक्रिया में चरणों को व्यवस्थित करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है । चित्र 1 दिखाता है कि इस कॉंफ़िगरेशन खातों को 8 अनुभागों के लिए समाधान के 12 चरणों के माध्यम से संसाधित किया जा करने के लिए । मुक्त फ्लोटिंग विधि एक फ्लैट घुमाव के साथ कोमल आंदोलन के साथ संयुक्त सुनिश्चित करता है कि एंटीबॉडी दोनों पक्षों से वर्गों घुसना करने के लिए पर्याप्त उपयोग किया है । प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए 3 दिन लगते हैं, जो मुख्यतः 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी में रातोंरात गर्मी के कारण है, जो लगातार नसों और mitochondria लेबल ।

    प्रक्रिया के शेष इमेजिंग, प्रसंस्करण और फ्लोरोसेंट संकेतों का विश्लेषण शामिल है । फोकल माइक्रोस्कोपी से बाहर की-फोकस संकेतों को नष्ट करने के द्वारा फोकल विमान से ऑप्टिकली अनुभाग असतत संकेतों के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों का लाभ लेता है । जेड के अधिग्रहण-श्रृंखला ऊतक अनुभाग के माध्यम से नसों, mitochondria, और नाभिक के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों के एक 3 डी प्रतिनिधित्व प्रदान करता है । पैरामीटर एपिडर्मिस कि 5 नसों की एक औसत शामिल होगा की लंबाई के साथ छवि १७२ µm के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । चित्रा 2 तीन फ्लोरोसेंट संकेतों है कि एपिडर्मिस से एकत्र कर रहे है की एक ठेठ 3 डी छवि दिखाता है । इस (चित्रा बी) धुंधला के रूप में एपिडर्मल और चमड़े की नसों कि एक उच्च तीव्रता की पृष्ठभूमि ऑटो ऊतक के प्रतिदीप्ति से है की एक अमीर संकेत प्रदान करता है । परमाणु दाग (चित्रा 2c) एपिडर्मिस जहां intraepidermal तंत्रिका तंतुओं आना की सीमाओं की पहचान करने में मदद करता है । यह एपिडर्मिस की बाहरी परत के लिए आम है कि corneocytes में अवशिष्ट डीएनए के कारण हो सकता है कि एक फैलाना संकेत है कि परत corneum बनाते हैं । mitochondria स्पष्ट रूप से PDH धुंधला (चित्रा 2d) जहां संकेत के बहुमत एपिडर्मिस है कि मुख्य रूप से keratinocytes है में कोशिकाओं के साथ जुड़ा हुआ है द्वारा लेबल हैं ।

    अधिग्रहण इस प्रोटोकॉल में वर्णित मापदंडों एक १.२५ संख्यात्मक एपर्चर और २.२ के एक ज़ूम कारक के साथ एक 40X तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें । १७६.१ µm x १७६.१ µm x 30-50 µm की एक XYZ छवि आकार में यह परिणाम है । ये सेटिंग्स एपिडर्मिस के पर्याप्त कैप्चर छवि (चित्र 3ए) के अनुसार 4-6 तंत्रिका तंतुओं के एक औसत शामिल करने के लिए । उच्च संकल्प पर नमूना प्रत्येक छवि में नसों की संख्या कम हो जाएगा । चित्र बी ३.३ की एक ज़ूम कारक दिखाता है, जो XY क्षेत्र को ११४.८ µm x ११४.८ µm से कम करता है, जो छवि के प्रति कम नसों में परिणाम देता है । एक १.२५ संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 40x तेल विसर्जन उद्देश्य के लिए Nyquist (http://www.svi.nl/NyquistCalculator) द्वारा परिभाषित के रूप में आदर्श नमूना घनत्व ५४ एनएम x ५४ एनएम x २०५ एनएम के एक XYZ स्कैन संकल्प का सुझाव है । यह एक ज़ूम फैक्टर की आवश्यकता होगी ६.६ गुना १,०२४ x १,०२४ रिज़ॉल्यूशन पर और XY दृश्य को कम करने के लिए ५७.४ µm x ५७.४ µm और केवल प्रति छवि (चित्र 3 c) की एक औसत 1-2 तंत्रिका पर कब्जा ।

    छवि के अवांछित क्षेत्रों को हटाने के लिए और संकेतों को बढ़ाने के लिए छवि प्रसंस्करण प्रदर्शन करने के लिए अगले चरण है । इस प्रोटोकॉल में dermis और परत corneum हटा रहे है ताकि एपिडर्मिस के क्षेत्र पर विश्लेषण ध्यान केंद्रित करने के लिए जहां IENFs आना । तीन आयामी सॉफ्टवेयर यह संभव अलग, बढ़ाने और फ्लोरोसेंट संकेतों का विश्लेषण करने के लिए बनाता है । सॉफ्टवेयर के भीतर उपकरण के ऊपर और एपिडर्मिस (चित्र 4a-सी) के नीचे और नीचे के क्षेत्रों में फसल द्वारा एपिडर्मल तंत्रिका और mitochondria को अलग करने की जरूरत है । यह प्रक्रिया एक विस्तारित दृश्य में संकेतों को संक्षिप्त और फिर एपिडर्मिस के आसपास एक मुक्तहस्त क्षेत्र अनुरेखण द्वारा सरलीकृत है । क्रॉप की गई छवि को आगे छवि पुनर्स्थापना एल्गोरिदम द्वारा संसाधित किया जाता है. Deconvolution नसों और mitochondrial संकेतों (चित्रा 4d) के संकल्प का अनुकूलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

    अंतिम चरण का पता लगाने और संकेतों से morphometric सुविधाओं को निकालने के लिए है । इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria की सुविधाओं को मापने के लिए है । छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर विशेषताएं है कि उपयोग सतहों एक संकेत के लिए बनाया (इस मामले में तंत्रिका की सतह) एक मास्किंग उपकरण के रूप में एक और फ्लोरोसेंट संकेत अलग है कि सतह के भीतर (इस मामले में mitochondria) । तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria के विश्लेषण में पहला कदम नसों के आसपास 3d सतहों (चित्रा 5 ए-बी) बनाने के लिए है । तंत्रिका सतहों तो तंत्रिका-विशिष्ट फ्लोरोसेंट mitochondrial संकेतों की फसल के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं (चित्रा 5C, 5डी, 5E, ५-4). अंत में, 3 डी सतहों तंत्रिका-विशिष्ट mitochondrial संकेतों के आसपास बनाया volumetric माप (चित्रा 5F, 5एच) प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं । तालिका 3 morphometric माप दिखाता है जो छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर और सारांश डेटा से निर्यात किया जाता है । निर्यात करने के लिए मुख्य मान तंत्रिका और तंत्रिका-विशिष्ट mitochondrial संकेतों के लिए वॉल्यूम मान रहे हैं । mitochondria से वॉल्यूम डेटा mitochondria आकार आवृत्ति डेटा उत्पन्न करने के लिए, जो तब आकार आवृत्ति हिस्टोग्राम (चित्रा 6) बनाने के लिए उपयोग किया जाता है बिन्नी रहे हैं । मात्रा डेटा भी IENF मात्रा और IENF संस्करणों के भीतर mitochondrial मात्रा का प्रतिशत mitochondria की संख्या के लिए सारांश उपाय करने के लिए उपयोग किया जाता है ।

    तालिका 3 और चित्रा 6 में प्रस्तुत डेटा प्रदर्शित करता है कि इस तकनीक को एक साधन के लिए त्वचा बायोप्सी से मानव IENFs के भीतर mitochondria यों तो देता है । इस नमूने से नसों भर में वितरित mitochondria है और mitochondria के बहुमत ०.०२-०.३२ µm3के बीच हैं । ये आकार सामांय mitochondria३६,३७,३८,३९से संबद्ध श्रेणी में हैं । छोटे mitochondria को अधिक बड़ा mitochondria से अधिक गतिशील होना दिखाया गया है३९ सुझाव है कि इन नसों में mitochondria अधिक गतिशील हो सकता है । दरअसल, अध्ययनों से यह है कि बड़े, सूजन mitochondria परिवहन के रूप में अच्छी तरह के रूप में छोटे mitochondria और axonal अध: पतन३९,४०,४१के लिए नेतृत्व कर सकते है फंसा है । इसलिए, तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria का लक्षण वर्णन एक मूल्यवान तकनीक है कि neurodegenerative रोगों जहां mitochondrial आकृति विज्ञान और परिवहन में परिवर्तन axonal अध... के साथ संबद्ध किया गया है के अध्ययन के लिए लागू होगा है 15,25,26,27,४२,४३.

    5% BSA समाधान अवरुद्ध
    5% BSA समाधान अवरुद्ध के घटक राशि की जरूरत
    गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) [अंतिम एकाग्रता: 5%] ०.६२५ छ
    १.०% ट्राइटन X-१०० (TX-१००) [अंतिम एकाग्रता: ०.३%]
    ३.७५ एमएल 1x पंजाब ~ ८.१२५ एमएल कुल (1x पंजाबियों का उपयोग करने के लिए १२.५ मिलीलीटर कुल मात्रा लाने के लिए) १२.५ एमएल

    तालिका 1: 5% BSA समाधान अवरुद्ध कर रहा है. 5% BSA अवरुद्ध समाधान immunohistochemistry प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरणों में एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

    1% BSA कुल्ला समाधान
    1% BSA कुल्ला समाधान के अवयव राशि की जरूरत
    गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) [अंतिम एकाग्रता: 1%] ०.१२५ छ
    १.०% TX-१०० [अंतिम एकाग्रता: ०.३%] ३.७५ एमएल
    1x पंजाब ~ ८.१२५ एमएल
    कुल (1x पंजाबियों का उपयोग करने के लिए १२.५ मिलीलीटर कुल मात्रा लाने के लिए) १२.५ एमएल

    तालिका 2: 1% BSA कुल्ला समाधान । 1% BSA धोने समाधान immunohistochemistry प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बाध्यकारी ब्लॉक और कमजोर प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया ।

    IENFs और तंत्रिका-विशिष्ट Mitochondria के लिए Morphometric मापन
    छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर से निर्यात और सारांश डेटा
    मीट्रिक टन आकार आवृत्ति डिब्बे आकार आवृत्ति बिन में मीट्रिक टन की संख्या बिन में मीट्रिक टन का प्रतिशत मीट्रिक टन की कुल संख्या मीट्रिक टन वॉल्यूम (µm3) IENF वॉल्यूम (µm3) IENF वॉल्यूम प्रति मीट्रिक टन की संख्या (संख्या/100 µm3) IENF वॉल्यूम में एमटी वॉल्यूम का प्रतिशत IENFs की संख्या
    बीच
    .02-.04 µm3    		 20 २४.४% ८२ १३.४१ ५१८.८८ १५.८ २.५८% 4
    बीच
    . ०४-.08 µm३    		 28 ३४.१%
    बीच
    .08-.16 µm3    		 14 १७.१%
    बीच
    .16-.32 µm3    		 12 १४.६%
    बीच
    . ३२-.64 µm3    		 4 ४.९%
    बीच
    .64-1.28 µm3    		 3 ३.७%
    बीच
    1.28-2.56 µm3    		 1 १.२%
    बीच
    2.56 + µm3    		 0 ०.०%

    तालिका 3: IENFs और तंत्रिका-विशिष्ट Mitochondria के लिए Morphometric माप । तालिका morphometric मानों को मापा और छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर और सारांश डेटा से निर्यात किया जाता है का प्रतिनिधित्व करता है । संक्षिप्त नाम: IENF, intraepidermal तंत्रिका तंतुओं; एमटी, mitochondria ।

    Figure 1
    चित्र 1 : योजनाबद्ध एक ९६ के लिए सेटअप का प्रतिनिधित्व आरेख-त्वचा बायोप्सी Immunohistochemistry के लिए अच्छी तरह से थाली। प्लेट में पंक्तियां ब्लॉक के लिए प्रोटोकॉल में कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं, धोने और मशीन समाधान और कॉलम व्यक्तिगत ऊतक वर्गों (थाली प्रति 1 से 8 वर्गों) का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2 : एक मानव एपिडर्मल बायोप्सी से एक ऊतक अनुभाग के प्रतिनिधि 3 डी फोकल माइक्रोस्कोपी छवि प्रतिदीप्ति Immunohistochemistry के लिए कार्रवाई की । अनप्रोसेस्ड 3 डी प्रोजेक्शन छवि दिखाता है (क) फ्लोरोसेंट संकेतों और व्यक्तिगत संकेतों के लिए (ख) नसों (तंत्रिका, हरे), (ग) नाभिक (Nuc, नीला) और (घ) mitochondria (मीट्रिक टन, लाल) एपिडर्मिस में और dermis. एपिडर्मिस की परत corneum लेयर में संकेतों की कमी को ध्यान में रखें । स्केल बार्स = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 3
    चित्र 3 : बेहतर छवि संकल्प परिणाम बाद में विश्लेषण के लिए कम नसों में । सभी छवियों को एक १.२५ संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 40X तेल उद्देश्य के साथ कब्जा कर रहे है और 3 डी अनुमानों नसों (हरा), mitochondria (मीट्रिक टन, लाल) और नाभिक (Nuc, नीला) के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों को वर्णन । एक छवि २.२ के ज़ूम कारक में लिया गया (a) दृश्य के भीतर कई नसों शामिल हैं । ज़ूम फैक्टर बढ़ाने के लिए ३.३ (ख) या ६.६ (ग), आदर्श Nyquist नमूना, काफी प्रत्येक छवि के भीतर नसों की संख्या कम कर देता है. स्केल बार्स = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 4
    चित्र 4 : छवि प्रसंस्करण. प्रतिनिधि विस्तारित ध्यान (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण) एक मानव एपिडर्मल बायोप्सी से एक ऊतक अनुभाग के फोकल माइक्रोस्कोपी से एक छवि का दृश्य । अनप्रोसेस्ड प्रोजेक्शन छवि (क) नसों (हरा), नाभिक (Nuc, नीला) और mitochondria (मीट्रिक टन, लाल) के लिए मर्ज किए गए फ्लोरोसेंट संकेतों को दिखाता है । dermis और परत corneum है (ख) इंटे के एक क्षेत्र के साथ बाहर फसलीआराम (ROI) मुक्तहस्त चयन उपकरण (नीला हाइलाइटेड क्षेत्र, फसल ROI) एपिडर्मिस में केवल संकेतों को अलग कर रहा है. (ग) फसली एपिडर्मिस फिर तंत्रिकाओं (हरा) और mitochondrial (मीट्रिक टन, लाल) संकेतों के समाधान में सुधार करने के लिए परिकलित बिंदु प्रसार कार्यों के साथ (D) deconvolution के लिए संसाधित किया जाता है । स्केल बार्स = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 5
    चित्र 5 : छवि विश्लेषण. प्रतिनिधि 3 डी फोकल माइक्रोस्कोपी छवि (क) तंत्रिका-विशिष्ट हरी फ्लोरोसेंट संकेत दिखाता है । (ख) तंत्रिका संकेत के लिए एक 3d सतह (सियान) बनाया जाता है । तंत्रिका-विशिष्ट mitochondrial संकेत के आराम से अलग है ( ग) एपिडर्मल mitochondrial संकेतों (मीट्रिक टन, लाल) द्वारा (D) एक मास्किंग उपकरण के रूप में तंत्रिका की सतह का उपयोग कर । जिसके परिणामस्वरूप (ई, जी) तंत्रिका-विशिष्ट mitochondrial लाल फ्लोरोसेंट संकेत (एफ, एच) सतहों (माउंट सतह, रानी) तंत्रिका सतह (सियान) के भीतर mitochondria के आसपास बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । जी और एच सफेद बक्से के ई और एफ में बढ़ाया विचार कर रहे हैं । स्केल बार्स = 20 µm (A-f), 5 µm (G-h) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 6
    चित्र 6 : Mitochondrial आकार आवृत्ति हिस्टोग्राम. Mitochondrialsurface डेटा एक आकार आवृत्ति हिस्टोग्राम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है mitochondria है कि उनके खंड (µm3) के अनुसार विभिंन डिब्बे में से प्रत्येक में मौजूद है की प्रतिशत कल्पना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    इस प्रोटोकॉल को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, मात्रा और मानव त्वचा बायोप्सी से 3 डी में IENFs के भीतर तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria के आकार और वितरण का विश्लेषण । प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं । मुक्त-फ़्लोटिंग प्रतिदीप्ति immunohistochemistry दाग और प्रत्येक नमूने में कई संकेतों का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, explorative अनुसंधान के लिए एक अधिक बहुमुखी पद्धति प्रदान४४,४५. इस प्रक्रिया के ऊतकों में एंटीबॉडी के प्रवेश के लिए अनुमति देता है के लिए ५० µm अनुभाग, जो फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों और 3 डी विश्लेषण प्राप्त करने के लिए आवश्यक है भर में छवियों के अधिग्रहण को अधिकतम करने के लिए । एक और महत्वपूर्ण कदम छवि अधिग्रहण पैरामीटर है कि छवि प्रति पर्याप्त नसों पर कब्जा करने के लिए mitochondria को मापने के लिए संकल्प को बनाए रखने के बीच संतुलित कर रहे हैं । इस और मानक त्वचा बायोप्सी प्रोटोकॉल में प्रयुक्त ऊतक वर्गों लगभग 3 मिमी लंबे४५,४६,४७,४८हैं । इस प्रोटोकॉल में वर्णित अधिग्रहण मापदंडों एपिडर्मिस के काफी कैप्चर करने के लिए छवि प्रति 4-6 तंत्रिका तंतुओं के एक औसत शामिल हैं । उच्च संकल्प पर नमूना काफी प्रत्येक छवि में नसों की संख्या को कम करने, विशेष रूप से Nyquist नमूना पर होगा । एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम के लिए deconvolution एल्गोरिदम का उपयोग करने के लिए संकल्प और संकेतों के विपरीत में सुधार, विशेष रूप से mitochondria के लिए है । छवियों के Deconvolution उच्च संकल्प पर नमूना नहीं करने के लिए क्षतिपूर्ति करने में मदद की । एपिडर्मिस में कक्षों के साथ संबद्ध mitochondria से तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria को अलग करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने के लिए अंतिम महत्वपूर्ण चरण है । यह तंत्रिका के भीतर स्थानीयकरण mitochondrial संकेत है कि बाहर फसल के लिए एक मास्किंग उपकरण के रूप में तंत्रिका की सतह का उपयोग करके पूरा किया है ।

    इस तकनीक के कुछ संभावित संशोधनों पर विचार कर रहे हैं । एक संभव संशोधन प्रतिदीप्ति immunohistochemistry की अवधि को छोटा करने के लिए किया जाएगा । 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में रातोंरात मशीन कमरे के तापमान पर 3-4 घंटे के लिए छोटा किया जा सकता है । हालांकि, कमरे के तापमान पर कम गर्मी अक्सर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति वृद्धि, तो सावधानी शोर करने के लिए गरीब संकेत से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । एक अंय संभव संशोधन के लिए छवि अधिग्रहण मापदंडों को समायोजित किया जाएगा । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, छवि अधिग्रहण यहां वर्णित उच्च छवि संकल्प पर छवि प्रति नसों की एक उचित संख्या पर कब्जा करने की ओर पक्षपाती थे । यह एक १.३ संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 63x तेल विसर्जन उद्देश्य के रूप में एक उच्च आवर्धन उद्देश्य, का उपयोग करने के लिए संभव है । सभी पैरामीटर्स एक ही रहे और एक 63X उद्देश्य का उपयोग किया गया था, तो XY छवि फ़ील्ड ११२ µm x ११२ µm करने के लिए कम हो जाएगा और इसलिए छवि प्रति नसों की औसत संख्या को कम । मुख्य बिंदु अधिग्रहण और बाद में विश्लेषण भर में सुसंगत मापदंडों का उपयोग करने के लिए है ।

    इस तकनीक की मुख्य सीमा है कि यह समय लगता है । immunohistochemistry 3 दिनों के लिए ऊतक प्रक्रिया लेता है, छवि अधिग्रहण के बारे में 30-50 मिनट लेता है छवि के अनुसार कितने ऑप्टिकल जेड कदम उठाए हैं, और छवि प्रसंस्करण/ यह एक महत्वपूर्ण समय प्रतिबद्धता है, लेकिन पैदावार महत्वपूर्ण morphometric माप अंत में । इस तकनीक की एक और सीमा एपिडर्मिस के सीमित क्षेत्र छवि प्रति नमूना है । हालांकि, यह निस्संदेह प्रगति के रूप में सुधार होगा बेहतर संकल्प के साथ छवि अधिग्रहण दरों में किया जाता है तेजी से कंप्यूटर प्रोसेसर और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संयुक्त ।

    अंय तरीकों से अधिक इस प्रोटोकॉल का महत्व फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी छवि विश्लेषण के साथ प्रतिदीप्ति immunohistochemistry के संयोजन की शक्ति में है । परंपरागत रूप से, intraepidermal तंत्रिका फाइबर विश्लेषण chromogen आधारित immunohistochemistry और चमकीले क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ किया जाता है, विशेष रूप से न्यूरोपैथी के नैदानिक निदान के लिए४५,४७,४९. प्रतिदीप्ति immunohistochemistry का उपयोग यह दाग और प्रत्येक नमूने में कई संकेतों का विश्लेषण करने के लिए संभव बनाता है, explorative अनुसंधान के लिए एक अधिक बहुमुखी पद्धति प्रदान४४,४५. इस तकनीक के हित के एक विशेष संकेत अलग करने के लिए एक रणनीति प्रदान करता है, इस मामले में तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria, एक जटिल संकेत से, एपिडर्मल कोशिकाओं के साथ जुड़े mitochondria.

    इस तकनीक की शक्ति भविष्य अनुप्रयोगों में अपनी उपयोगिता है । अलग करने और तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria को मापने की क्षमता यह mitochondria के आकार और वितरण में रोग प्रेरित परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए संभव बनाता है । कई स्नायविक जटिलताओं रोग के एक संभावित तंत्र के रूप में mitochondrial शिथिलता फंसाया है । विशेष रूप से, इस तकनीक का एक संशोधित संस्करण को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि मधुमेह और मधुमेह परिधीय न्यूरोपैथी के साथ रोगियों के आकार और आयु-मिलान की तुलना में तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria के वितरण में माप परिवर्तन है ५०नियंत्रित करता है । इस तकनीक को बेहतर बनाने या संवेदी न्यूरोपैथी इलाज डिजाइन चिकित्सा के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी होगा । अंत में, तकनीक की बहुमुखी प्रतिभा यह विश्लेषण की एक विस्तृत श्रृंखला है कि एक फ्लोरोसेंट संकेत का उपयोग करने के लिए अंय फ्लोरोसेंट संकेतों से डेटा का एक सबसेट अलग लागू करता है ।

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    Disclosures

    ब्याज की घोषणा करने के लिए कोई संघर्ष ।

    Acknowledgments

    यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान K08 NS061039-01A2, न्यूरोलॉजी अनुसंधान के लिए कार्यक्रम & #38; डिस्कवरी, और मिशिगन विश्वविद्यालय में अल्फ्रेड Taubman चिकित्सा अनुसंधान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । इस काम में मिशिगन मधुमेह अनुसंधान केंद्र के आकृति विज्ञान और छवि विश्लेषण कोर का इस्तेमाल किया, मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के राष्ट्रीय संस्थान से स्वास्थ्य अनुदान 5P90 DK-२०५७२ के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित. लेखक जे रॉबिंसन सिंगलटन और ए गॉर्डन स्मिथ (यूटा के विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा मानव त्वचा के नमूनों की उनकी उदार दान के लिए ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
    10x Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1x PBS
    Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
    Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
    Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
    Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
    Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
    Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
    Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
    0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
    MA    		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
    Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
    Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
    96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
    Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
    Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
    Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
    Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
    Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
    Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
    Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
    Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
    Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
    CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal

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    References

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    तंत्रिका अंक १२७ mitochondria intraepidermal तंत्रिका तंतुओं मानव त्वचा बायोप्सी तीन आयामी इमेजिंग और विश्लेषण छोटे फाइबर न्यूरोपैथी
    तीन आयामी इमेजिंग और मानव Intraepidermal तंत्रिका तंतुओं के भीतर Mitochondria का विश्लेषण
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    Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, … More

    Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).

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