Abstract
Membranprotein transport på den ene proteinnivået fortsatt omgår detaljert analyse, hvis underlaget translokert er ikke-electrogenic. Store anstrengelser har blitt gjort på dette felt, men teknikker som muliggjør automatisert high-throughput transport analyse i kombinasjon med løsemiddelfrie lipid-dobbeltlag-teknikker som er nødvendige for analyse av membran transportører er sjeldne. Denne klassen av transportører er imidlertid avgjørende i celle homeostase og derfor et viktig mål i utvikling av legemidler og metoder for å få ny innsikt desperat behov.
De her presenterte manuskriptet beskriver etablering og gjennomføring av en ny biochip for analyse av membranprotein mediert transportprosesser ved én transportør oppløsning. Den biochip består av mikrohulrom omsluttet av nanopores som er svært parallell i sin utforming og kan produseres i industriell karakter og kvantitet. Protein-husing liposomer kan direkte brukes tilchip overflaten danner selv montert pore spennende lipidbilagene bruker SSM-teknikker (solid støttet lipid membraner). Pore-spenner deler av membranen er frittstående, noe som gir grensesnittet til substratet translokasjon inn i eller ut av hulrommet plass, noe som kan være etterfulgt av multispektral fluorescerende avlesning i sanntid. Etablering av standard operasjonsprosedyrer (SOP) tillater enkel etablering av protein-husing lipidbilagene på brikken overflaten av nesten alle membranprotein som kan bli rekonstituert funksjonelt. Den eneste forutsetningen er etablering av et fluorescerende lese-out system for non-electrogenic transport underlag.
Høye-innhold screening programmer er accomplishable ved bruk av automatiserte invertert fluorescerende mikroskop opptak flere chips i parallell. Store datasett kan analyseres ved hjelp av fritt tilgjengelig spesialdesignede analyse programvare. Tre-farge multi spektral fluorescerenderead-out videre åpner for objektiv data diskriminering i ulike hendelses klasser, eliminere falske positive resultater.
Brikken teknologien er i dag basert på SiO 2 flater, men ytterligere funksjon hjelp gullbelagt chip overflater er også mulig.
Introduction
Analysen av membran proteiner har blitt av økende interesse for grunnleggende og farmasøytisk forskning de siste 20 årene. Utvikling av nye legemidler avhenger av identifisering og detaljert karakterisering av nye mål, som for tiden er en av de begrensende faktorer. Det faktum at omtrent 60% av alle drug targets er membranproteiner 1, gjør utvikling av teknikker for å klargjøre deres funksjon viktigst.
I det siste har teknikker for studiet av electrogenic kanaler og transportører er utviklet i folkemengden 2-4. Non-electrogenic substrater i strid presentere en mer utfordrende oppgave. De er imidlertid av spesiell interesse som prim stoffet mål, som de kontrollerer strømmen av oppløste stoffer og næringsstoffer over cellemembranen og funksjon som sentrale reseptorer i signaleringskaskader 5.
Betydelig innsats har blitt satt inn i utviklingen av techniques for å studere funksjonen av membranen transportproteiner 6, 7. Systemer som bruker faste-støttet membraner har dukket opp som mest lovende verktøy i dette feltet 8-10, inkludert solide støttet lipidbilagene, forankrede bilag 11, 12, microblack lipid membraner 13, 14 og innfødte vesikkel arrays 15, 16 for å nevne noen. Noen av dem er også tilgjengelig som kommersielle oppsett 17, 18. Noen eksempler er publisert som kombinerer evnen til å studere enkeltmembranproteiner i et sterkt parallell måte 14, 19, er en forutsetning for screening anvendelser. Men disse metodene sjelden bro fra grunnforskning til industrielle miljøet. De vanskeligheter som ofte ligge i systemets evne til å være automat, kostnadskrevende produksjon og / eller arbeidskrevende fremstilling. En tilnærming overcoming alle de ovennevnte hindringer er det endelige målet.
Teknikken presenteres her ble utviklet for å studere membran kanaler og transportører for in vitro i et kontrollert miljø på den eneste proteinnivået 20-22. Tilberedning av renset membran proteiner i LUV er mye mer etablert enn sammenlignbare tilnærminger for GUVs 23 - 26 eller svart lipid membraner 27. De kan direkte brukes til chip overflaten, hvor bilagsdannelse finner sted via en selvmonteringsprosessen. Den glassbunn utformingen av nanoporøse brikke (fig. 1) gjør det mulig for luft mikroskopi, som tillater enkel automatisering av systemet. I kombinasjon med en motorisert scene flere brikker kan måles samtidig, med hver synsfelt som inneholder tusenvis av forseglede hulrom for analyse.
Figur 1. Utformingen av multipleksede nanopore biochips. A) en silisium-på-isolator (SOI) skive er strukturert ved reaktiv-ione-etsing. Omtrent 1150 individuelle chips er fabrikkert fra hver wafer med identiske egenskaper og kvalitet. B) Hver brikke består av 250.000 individuelle mikrohulrom med nano åpninger. Skala:. 200 mikrometer C) Hver hulrom er adresser via multispektrale fluorescens leses ut. En intransparent øverste laget blokker de fluorescerende signaler fra bufferreservoaret, noe som gjør det biochip forenlig med inverterte fluorescensmikroskoper. D) atomkraftmikroskopi (AFM) avbildning avslører jevnt anordnet poreåpninger og overflateruheten av de silisiumdioksidlag på 3,6 nm (n = 40) optimal for vesikkelfusjon. Skala:. 5 mikrometer E) Scanning elektron microscopy (SEM) bilde viser et tverrsnitt gjennom den nanopore gir tilgang til femtoliter hulrom inne i silisiumbrikke. Dette tallet ble brukt på nytt med tillatelse fra 21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
All dataanalyse er utført ved hjelp av freeware å garantere ubegrenset tilgang for sluttbrukere. Tidsserier er analysert ved hjelp av gratis bildebehandlingsprogram og en tilpasset bygge kurve analyse programvare muliggjør batch prosessering og grei korrelasjon av store datasett med flere fluorescerende kanaler og tusenvis av kurver.
Modellen protein som brukes i denne protokollen er den mechanosensitive kanal av stor ledningsevne (MsCl) kanal protein avledet fra E. coli. Det fungerer som en ventil for å frigjøre osmotisk sjokk i naturen, men ble modifisert på en slik måte at rasjonelt konstruert synthetic funksjonalitet kan kovalent festes til kanalene innsnevring side. Via kostnad-frastøting av kovalent bundet aktivator (MTSET) kanalen utløses for å åpne, og skaper en nano-ventil. Små molekyler som ioner, vann, små proteiner, men også små fluoroforer kan trenge gjennom kanalen. Her blir proteinet brukes som en modell for å demonstrere evnen av systemet for å påvise protein-mediert translokasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Stor unilamellære vesikler (LUV)
- Rens en rundbunnet kolbe (10 ml volum) med nitrogengass for å fjerne eventuelle støvpartikler. Skyll rundkolbe med etanol.
Merk: Restetanol kan tolereres og ikke forstyrrer etterfølgende trinn. - Vask en 1 ml glassprøyte 4x med kloroform, for å fjerne eventuell forurensning. Tilsett 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml i kloroform) til rundbunnet flaske og dope lipidoppløsningen med en ekstra DOPE Atto 390 til en sluttkonsentrasjon på 0,1 mol%.
Legg merke til: I stedet for DOPE Atto 390 andre fluoroforen-merkede lipider eller lipofile fargestoffer kan også brukes, avhengig av tilgjengelige kilder eksitasjon. - Koble rundkolbe til en rotasjonsfordamper. Tørk lipidfilmen i 40 min ved 300 mbar, 30 ° C vannbad temperatur og maksimal rotasjonshastighet, for å danne en homogen lipid film på glasset vegg av kolben.
- Overfer kolben til en høy vakuumpumpe og tørr lipidfilmen for ytterligere 30 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 5 ml buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0, sterilfiltrert) og 8 glassperler (2,7 mm diameter, etanol, vasket og tørket) til kolben. Koble kolben til en rotasjonsfordamper og rotere uten vakuum ved 50 ° C ved maksimal hastighet.
Merk: Glassperler mekanisk fortrenge lipidfilm fra glassveggen, noe som fører til (multilamellære) vesikkeldannelse. Etter 45 min rotasjon løsningen synes melkeaktig og ingen gjenværende lipid film skal være synlig på kolbeveggene. I stedet for glassperler andre fremgangsmåter som sonikering kolben i et vannbad sonifier, virvling av kolben eller den milde rehydrering fremgangsmåten er også anvendelig. - Overfør kolbe under inert gass (argon) til et ultrasonisk bad og sonikere i 4 minutter ved romtemperatur.
Merk: ultralydbølger forstyrre liposomer, noe som gjør dem unilamelære. - Splitte LUV løsningi 1 ml aliquoter.
- Utføre 5 fryse / tine sykluser av frysing av LUV oppløsning i flytende nitrogen, etterfulgt av tining ved 40 ° C i et vannbad.
Merk: Dette fører til brudd og spontan omleiring av individuelle liposomer med hverandre, noe som fører til økt størrelse. - I siste fryse trinnet butikken alle prøvene ved -80 ° C.
Merk: LUV vil være stabil i minst 6 måneder.
2. Protein Tilberedning
- Tine en ml LUV delmengde på is. Direkte før tilberedning, ekstrudere liposomer 17x gjennom et 400 nm polykarbonat filter membran ved hjelp av en mini ekstruder.
Merk: Lipid aggregater blir fjernet og den endelige homogen størrelsesfordelingen er nådd. - Destabilisere LUV ved tilsetning av 4% Triton X-100 (v / v) til en sluttkonsentrasjon på 0,25% (volum / volum) og inkuberes i 5 minutter ved 50 ° C.
Merk: Mengden av liposomer som brukes i dette trinn er avhengig av massen av den rensede MsCl G <sup> 22 C (se trinn 2.3). Rens MsCl G 22 C (avledet fra E. coli), som beskrevet i detalj i 28. - Bland renset MsCl G 22 C og vaske mettet liposomer på 1:20 (w / w) forhold og inkuberes i ytterligere 30 minutter ved 50 ° C.
- For fjerning av detergent legge til bio-perler i Tris-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0, sterilfiltrert) til protein / liposom-løsning, med 16 mg (våtvekt) bio-perler per mL vaskemiddel anvendes for å destabilisere liposomer i trinn 2.2.
- Utføre vaskemiddel fjernelse over natten (16 timer) ved 4 ° C på en roterende plate.
Merk: konstant blanding av løsningen sikrer optimal fjerning av detergent. - Etter fjerning vaskemiddel butikk proteoliposomes ved 4 ° C og bruke for eksperimenter på samme dag.
3. aktivitetsanalyse
- Under protein rekonstituering ta en 100 ul alikvot av vaskemiddel-destabilisert proteoliposome løsning etter endt trinn 2.3.
- Tilsett 1 volum av calcein (30 mM) til det protein liposom-løsning og inkuberes ytterligere 5 minutter ved 50 ° C.
- Fjern vaskemiddel fra oppløsningen som beskrevet i trinn 2.4 til 2.6.
- Etter fjerning av detergent i likevekt en størrelsesutelukkelseskolonne (20 ml sjiktvolum eller mer) med Tris-buffer (3 x sjiktvolum).
Merk: Proteoliposome separasjon kan utføres ved romtemperatur, men å holde prøven konstant ved 4 ° C anbefales å sikre beste proteinaktivitet etter fraksjonering. - Separate proteoliposomes fra fri calcein ved å påføre hele alikvot (200 pl) til den størrelseseksklusjonskolonne. Tillat blandingen å suge inn i kolonnen, etterfulgt av eluering av proteoliposomes fra kolonnen via kontinuerlig buffer applikasjon på toppen ved hjelp av tyngdekraftstrøm. Observer calcein inneholder proteoliposomes som en diskret oransje band i eluering front. Samle fraksjoner av 500 & #181; l hhv.
Merk: Gratis calcein fargestoff vil eluere etter proteoliposome fraksjonen med fullstendig separasjon. - Pipetter 80 mL av hver fraksjon mot en mikro-brønns plate for fluorescerende leses ut og identifisere fraksjon som inneholder det høyeste beløpet av Calcein inneholder proteoliposomes via fluorescens utslipp. Oppdage fluorescens ved 520 nm med eksitasjon ved 490 nm. Bruk proteoliposome fraksjonen med det høyeste signal for den følgende aktivitetsanalysen.
- Bland 20 ul av den proteoliposome holdige fraksjon med 980 ul Tris-buffer i en 1 ml kyvette fluorescens.
- Måle fluorescensemisjon ved 520 nm (eksitasjon 490 nm) ved bruk av et spektrofluorometer. Rekord for 1 min og deretter legge til 25 mL av MTSET ([2- (trimethylammonium) etyl] methanethiosulfonate) fra en stamløsning (160 mm) og bland godt. Hold på opptak under blanding. Alltid fremstille stamløsningen friskt umiddelbart før bruk.
Merk: Når løst i buffer MTSET hydrolysering,s i løpet av 30 min, og vil være ikke-reaktive. MTSET kan veies og holdes så tørt pulver alikvoter ved -20 ° C inntil bruk.
Merk: Når aktivert av MsCl G 22 C kanalen åpnes og frigjør den innesluttede calcein, som fører til en lokal konsentrasjon minskning av calcein når effluxing de proteoliposomes og påfølgende dequenching av fargestoffet, som resulterer i en økning i fluorescensemisjon. - Etter at fluorescensemisjonen har nådd et stabilt platå igjen, oppløse liposomene ved tilsetning av 50 ul Triton X-100 (4% v / v).
Merk: Ideelt sett ikke lenger fluorescens økning kan observeres, noe som tyder på aktiv protein i hvert liposom.
4. Størrelsesfordeling Måling av LUV Bruke Nano-partikkel sporing
- Merk at bare minimale prøver av liposomer eller proteoliposome løsning er nødvendig for størrelsesfordelingen analyse ved bruk av nanopartikler tracker. Fortynn en liposom løsning av 5 mg / ml lipid-konsentrasjon på 1: 5000 (v / v) i buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0, sterilfiltrert) for analyse i et sluttvolum på 1 ml. Filtrere alle buffere som benyttes for fortynning og tidligere LUV fremstilling og rekonstituering ved hjelp av en 0,2 um membran for å fjerne eventuelle suspenderte partikler som støv som ville forstyrre størrelsesfordelingsmålinger.
- Vask flow-kammer med ultra-rent vann.
- Bruk overflatemarkører til å fokusere på lysstrålen. Injiser ca. 300 pl av den fortynnede liposomet prøven og straks lukker utløpsventilen for å stoppe strømningen inne i strømningskammeret, uten å innføre luftbobler.
- Juster innstillingene for fokus og kameraet skodde / gevinst å sikre tilstrekkelig spredning signal av prøven for gjenkjenning.
Merk: 20 - 80 signalene skal være godt synlig i synsfeltet. Hindre overbefolkning (> 80 signaler) som programvaren ikke vil være i stand til å spore individuelle signaler når overlappende. - Gå til "Capture" screen. Juster temperaturkontroll til 25 ° C og fangst varigheten til 90 sekunder ved hjelp av programvareinnstillingene. Trykk på "Record" for å starte innspillingen en tidsserie.
Merk: Ved ferdigstillelse av tidsserier åpnes et nytt vindu. - Lagre tidsserien i den gitte format (* .avi). Av praktiske grunner under batch analyse lagre alle filer i en enkelt mappe.
- Åpne utgangsventilen og injisere en annen 300 mL inn i flyten kammeret. Steng ventilen og gjenta trinn 04.03 til 04.06 to ganger.
- Etter å ha fullført alle prøve løper vaske flyten kammer med 5 ml ultrarent vann. Gå til "Pre-Process" skjerm. Still kalibreringsparametrene temperatur = 25 ° C og viskositet = 0,91 for den Tris-buffer anvendt i denne protokollen.
- Åpne batch prosess vinduet og laste den registrerte tidsserier (Advanced / Batch Process / Set File 1-3). Trykk på "GO" for å starte størrelsesfordelingen analyse.
Merk: analytiske programvare autotisk sporer enkeltpartikler og beregner sin diameter basert på deres bevegelsesatferd ved hjelp av parametrene i trinn 4.8.
Merk: Den resulterende størrelsesfordelingen analyse lagrer automatisk til samme mappe som serien filer tid. - I tillegg oppretter en rapport fil for å oppsummere resultatene (Export / Opprett rapport PDF).
5. Chip Holder Forberedelse
- Vei opp 1,0 g MDX4 medisinsk kvalitet elastomer base og 0,1 g MDX4 herdemiddel inn i en 50 ml reaksjonsrøret. Bland begge grundig med et glass bar.
- Sette røret inn i en eksikator i 1 time for å avgasse limet. Etterpå bruker den innen 30 min for chip liming, som limet vil stivne og bli for vanskelig å jobbe med.
- Under elastomer avgassing (trinn 5.1) rengjør en objektiv glass slide grundig med kloroform for å fjerne eventuelle forurensninger før chip bonding. Skyll sleiden med 5 ml kloroform ved hjelp av en glassprøyte. samlekloroform i en under plassert beger. Etter vask la raset tørr.
Merk: Utfør dette trinnet under en avtrekkshette. Alternativ til kloroform, kan også andre organiske løsningsmidler som aceton, også anvendes. - Avsette en liten mengde av klebemiddelbindingsmateriale på dekkglasset ved hjelp av en pipettespiss (krystall tips for 10 pl pipetter). Husk at brikkene har til å passe inn i 8-kammer lysbildeholderen senere og må plasseres på objektglasset tilsvarende.
- Fjern forsiktig en brikke av gangen fra wafer bord med fin spiss pinsett og sette chip på slipp av lim på glasset. Pass på at den belagte siden av chip vender oppover.
- Skyv chip på glasset med baksiden av en stump PE pinsett. For å sikre at limet blir fordelt jevnt på undersiden av brikken, skyver forsiktig brikken frem og tilbake. KRITISK STEP: Sørg for at ingen luftbobler er fanget under chip, da det vil forstyrre optisk avbildningav chip hulrom senere. Sørg også for at ingen Lim forurenser chip overflaten.
- Desiccate det ferdige dekkglasset i 2 timer ved 65 ° C i et skap tørketrommel.
Note: Chips fremdeles belagt med et beskyttende lag som stammer fra deres fremstilling som må fjernes. - For å fjerne det beskyttende laget, utføre en sekvensiell løsemiddel vasketrinn. Under herding av chips, forvarme et vannbad til 54 ° C.
- Plasser 3 begerglass i vannbad, to av dem er fylt med isopropanol og en som er fylt med aceton.
- Sett dekslet glass til en lysbildeholder og senk den inn i første isopropanol fylt fatet i 10 min. Etterpå overføre den til aceton fylt fatet, inkuberes på nytt i 10 minutter før overføring av det til det siste vasketrinn til det andre isopropanol fatet og inkuberes ytterligere 10 min.
- Ta lysbildeholderen fra fatet og vaske den forsiktig mye med Ultrapure vann, etterfulgt av tørking av flisen med en forsiktig strøm av nitrogengass.
- Take-off lamineringsarket fra 8-brønnen klebrig-lysbilde og legg den bakover på benken. Nøye plukke opp dekselet lysbilde og trykk forsiktig på den klebrige-lysbilde med chips vender brønnene. La den ferdige brikke holderen hvile i et par minutter før anvendelse.
6. Analyse Forberedelse
Merk: nanopore chips limt til et dekkglass og adskilt med en 8-brønns klebrig-lysbilde har den fordel, at flere brikker tas opp i et enkelt forsøk, med brikker å være helt atskilt fra hverandre.
- Etter chip holder forberedelse, skyll hver brikke med ren etanol og føn med nitrogengass for å fjerne eventuelle forurensninger som støv.
- Rengjør chip overflaten med luft, oksygen eller nitrogen plasma. Avhengig av typen av plasma rengjøringstidsperioder variere: utføre oksygenplasma behandling i 1 minutt, luft og nitRogen plasma i 5 min ved 0,3 mbar ved 80% effektinnstillingen (RF power middels eller høy).
- Etter plasma rengjøring ruge chips i ren etanol for 10-15 min for å sikre hulrom tisse.
- Trinnvis utveksling etanol i buffer ved å tilsette 400 ul Tris-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0, sterilfiltrert), etterfulgt av blanding av oppløsningen uten å innføre luftbobler og påfølgende fjerning av 400 ul. Gjenta denne prosedyren 12 ganger, for å sikre etanol fjerning.
Merk: Etanol ville være skadelig for liposomer og suspendert lipidbilagene. - Dope Tris-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0, sterilfiltrert) med 5 mM CaCl2 og 1 mM Oy647 fargestoff. Fullstendig fjerne vaskebufferen fra brikken og straks legge den dopede buffer til brikken. Merk: Chips vil bli dekket med en tynn film buffer etter vaskebuffer fjernelse, slik at brikken er ikke i direkte kontakt med luft, noe som sikrer en konstant fukting av hulrommene og chip overflaten.
- Tilsett 1 mg / ml LUV eller Proteo-LUV i Tris-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0, sterilfiltrert) til hver brønn.
Merk: Sluttvolumet i hver brønn er 300 mikroliter. Betrakt etterfølgende tilsetninger av styre fargestoff og den kjemiske modifiser MTSET under dopet Tris-buffer tilsetning. - For pore-spenner lipid bilagsdannelse på brikken overflaten inkuber brikken i 1 time ved romtemperatur med liposomet løsning. Etterpå vask hver brikke med 4x 400 ul av Ca 2 + -fri Tris buffer.
- Tilsett kontroll fargestoff til hver brønn, med en endelig konsentrasjon på 5 uM. Brikkene er nå klar for den trans analysen.
7. Analyseoppsett
- Monter chip holderen til epifluorescence mikroskop (20X luft objektiv, lang arbeidsavstand). Fokus på kanten av nanopore chip til å enklere finne fokalplanet av mikro hulrom. Når hulrom er i fokus skanne nanopore array for en region thpå skjermer høyeste tetting ratio.
Merk: Alle invertert mikroskop epifluorescens kan brukes til å utføre analyser chip. Avhengig av objektiv forstørrelse (20x - 60x) antall analysert hulrom vil variere med opptil 9000 hulrom i en enkelt synsfelt ved hjelp 20X forstørrelse. Luft mål med lang arbeidsavstand er å foretrekke. Bruken av inverterte konfokale laserskanningsmikroskop (CLSM) er også mulig, men bildeoverføring kan være den begrensende faktor på grunn av den begrensede dybdefokus. - Optimalisere chip belysning.
Merk: Sørg for at begge fargekanaler ikke overstige den maksimale gråtoner verdi, da endringer ikke kan observeres. For eksport eksperimenter justere belysningen av translokert fargestoff til 90% av maksimal signalkapasitet. Justere kontroll fargestoff i åpne hulrom til 80-90% av maksimal signal kapasitet til å klart oppdage eventuelle utett membran forsegling. - Når alle kanaler blir justert starte tidsserien. Ta bilder hver 10-20 sec i 90 min.
Merk: Dette er tilstrekkelig til å også følge spesifikke og uspesifikke efflux hendelser. - Initial effluks av det fluorescerende substrat ved tilsetning av cystein-spesifikke, positivt ladet forbindelse MTSET til en sluttkonsentrasjon på 3 mM. La det være minst 5 min eksperiment driftstid før MTSET tillegg til å være i stand til senere å etablere et stabilt fluorescerende signal grunnlinjen før kanalåpning. Alltid forberede MTSET løsning frisk rett før bruk.
8. Data Analysis
- Åpne tidsserier bildestakk med en standard versjon av ImageJ (File / Import / Image Sequence).
- Hvis fluorescerende kanaler er stablet, splitte kanalene i individuelle stabler for hver kanal (Bilde / Stacks / Stack til Images).
- Duplisere det første bildet av den trans underlaget kanal for ROI (regioner av interesse) identifikasjon (Bilde / Duplicate).
- Konverter bildet til et binært bilde (Bilde / juster / terskel). Sørge forat algoritmen som brukes viser signaler for alle lukkede hulrom uten overlappende pixilation.
- definere områder av interesse med partikkel Analyzer automatisk (Analyze / Analyser Partikkel). Definere et minste partikkelstørrelse definert, for å unngå kornstøy. Sjekk alternativene "ekskluderer på kantene" og "inkludere hull". Sørg for at resulterende Rois reflektere microcavity rekke mønster. Mellomliggende ROIs er gjenstander, derfor fjerne dem. Lagre ROI-listen.
Merk: Måling parameter må være satt til "område" før partikkelanalyse (Analyser / Set Målinger / Area) - Åpne Time Series Analyzer plug-in (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), som endrer størrelsen alt Rois automatisk til samme størrelse. Re-size all eksisterende Rois til et bredde / høyde på 6x6 piksler og oval form (Timer Series Analyzer / AutoROIProperties). Merk av for alternativet "Endre størrelse eksisterende ROIS". Lagre den resulterende skaleres ROI-listen.
- Åpne ROI leder(Analyser / Verktøy / ROI Manager) og laste skaleres ROI liste for hver kanal av tidsseriene (ROI Manger / Mer / Open). ROIs vil bli overlagret. For å analysere signalendring for hver ROI starte Multi måleverktøyet (ROI leder / Mer / Multi Measure), velg "Mål alle skiver" og "En rad per skive" og start multi tiltaket.
Merk: Måling parameter må settes til "betyr grå verdi" for dette trinnet (Analyze / Set Målinger / Mean grå verdi) - Lagre den resulterende tabellen, noe som gir gjennomsnitts grå verdi for hver ROI i * .txt eller * .xls format.
- Importer ROI analyse av hvert bilde kanal inn NanoCalcFX via "Import File" alternativet. Sett "Bruk første linje for å navngi serien". Angi størrelsen trinnet mellom bilder i henhold til tidsserien bildetakings perioder og velge den tilsvarende kolonnen og desimaltegn.
- Bruk alternativet "flere ark" for å automatisk relatere grafene til den enkelte fluofluorescerende kanaler.
Merk: Hendelsene kan nå bli analysert og klassifisert ved hjelp av informasjonen gitt av tre-farge spektral informasjon. - Monter utvalgte kurver ved hjelp av den innebygde fit funksjon (fit alternativ).
Merk: Den implementerte utstrømming og tilstrømningen ligningen er egnet for alle monoeksponensiell diffusjon drevne arrangementer og passer grenser kan stilles inn. Dannede hastighetskonstanter kan plottes bruke histogrammet verktøy eller eksporteres for ytterligere data raffinement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pore-spenner membraner kan enkelt lages på nanostrukturerte chip overflaten i en selv-montert måte. Men det underliggende prosessen er likevel delikat og påvirkes av mange parametere som liposom-størrelse, monodispersitet av liposomet befolkningen, lamellarity, lipid og salt-konsentrasjon og kjemiske overflateegenskaper. De fleste av disse parametrene har blitt nøye preget og standardisert i ovennevnte protokoll. Andre parametre men bør sjekkes under hvert nye preparatet, for å sikre et vellykket eksperiment. Dette er den liposom-størrelsesfordeling og populasjonen dispersitet (fig. 2 A). For optimal pore-dekkende membrandannelsen og for å unngå inntrenging liposom inn i hulrommet plass liposomstørrelser godt over porediameteren er en nødvendighet. Videre er monodisperse liposompreparater vist seg å gi de beste resultater i membranen spredning og Fusipå. Et annet viktig skritt som må kontrolleres for hver forberedelse er protein aktivitet etter tilberedning. Ved hjelp av et fluorescens-dequenching assay for liposomer rekonstituert med MsCl G 22 C, kan kanalåpningen bli overvåket via fluorescens-spektroskopi, noe som gir et forhold av liposomer som bærer aktiv MsCl G 22 C-protein (fig. 2 B).
Når spres til chip overflaten, kan oppløsningsmaterialet translokasjon av et fluorescerende mål ved MsCl G 22 C ved ligandaktivering følges (fig. 3 B). Konstruert MsCl G 22 C-kanaler er stengt i sin standardtilstand, entrapping små fluorescerende molekyler inne i hulrommet plass. Ved tilsetningen av kjemikaliet modulatoren MTSET positive ladninger blir introdusert til innsnevring regionenden MsCl G 22 C pore, skyve det åpent via elektro frastøting. Den tidligere innesluttede fluorophore omgår hulrommet plass for å oppnå spredning likevekt. Den etterfølgende reduksjon av fluorescens inne i hulrommet plass kan overvåkes. Denne fremgangsmåte er meget reproduserbar, noe som resulterer i en homogen populasjon av hendelser efflux (fig. 3 C). De resulterende effluks kurvene klynge i to distinkte populasjoner, som viser evnen til analysen for å diskriminere mellom en- og flerkanals trans arrangement (fig. 3 D). Videre systemet er i stand til å følge opp tre spektralt godt atskilt fargestoffer parallelt og i sanntid, noe som gjør det mulig å ta høy-innhold screenings og diskriminere presist og objektivt mellom positive, falske positive og negative resultater. I denne studien 9.046 forseglede hulrom ble analysert, hvorav 8% viste efflux oppførsel. Implementering av de forskjellige fluorescerende avlesnings kanaler, kan hendelser bli diskriminert i monoeksponensiell efflux hendelser, komplekse kinetikk, lipid inntrenging og membran brudd (Fig. 3 E). Bare hendelser som viser jevn signaler for kontroll oppløsningsmaterialet og membranen fargestoff anses for endelig analyse. Komplekse kinetikk representerer efflux hendelser med ustø styresignaler og er derfor utelatt. Lipid inntrenging og membran brudd er gjenstand hendelser egentlig forekommer ved bruk av pore-spenner lipidbilag systemer. De kan kastes ved hjelp av kontrollfargesignalene som er nevnt ovenfor (fig. 4).
Figur 2. Størrelse fordeling av proteoliposomes og MsCl funksjon. A) Vesikler ble analyz ed av nano-partikkel sporing analyse. LUV prøver ble undersøkt før (svart kurve) og etter oppløsning av MsCl G 22 C (rød kurve). Etter LUV preparat, er en midlere partikkelstørrelse på 214 ± 70 nm oppnådd. Størrelsen er redusert under tilberedning, noe som resulterer i proteoliposomes av 158 ± 60 nm i størrelse. B) MsCl aktivitet ble validert etter tilberedning av en utstrømning analyse. 28 Selv slukket calcein frigjøres fra proteoliposomes gjennom MTSET-mediert åpningen av MsCl kanal, fører til dequenching av fluoroforen (rød) og en hurtig økning av fluorescens-intensitet. Liposomer uten protein viser ingen slik utstrømming, selv etter gjentatte MTSET tillegg (svart). Påfølgende vaskemiddel-introdusert løselighet (TX-100) av liposomer utgivelser alle tidligere innkapslet fargestoff. Dette tallet ble brukt på nytt med tillatelse fra 21.et = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Ligand-gated oppløst stoff trans av MsCl på enkelt-molekyl nivå. A) Engineered MsCl G 22 C-kanaler er stengt i standardtilstanden. Små oppløste stoffer slik som en fluorofor er i stand til å passere hverken gjennom kanalen eller det ytterste lipid bilaget. Ved tilsetning av MTSET, en konstruert enkelt cystein i hver MsCl G 22 C protomer blir modifisert, å innføre multiple positive ladninger i innsnevringen siden av pentamer kanalkomplekset. Den MsCl G 22 C kanalen skyves åpen av ladning frastøtning og den innesluttede fargestoff kan diffundere ut av hulrommet, noe som fører til en nedgang i fluorescens-intensitet. B) Timeg spor av MsCl G 22 C åpning ved tilsetning av MTSET. Proteoliposomes inneholdende funksjonelt rekonstituert MsCl G 22 C ble spredd på brikken overflaten. Oy647 (rød) ble innesluttet inne i hulrommene som trans substrat. OregonGreen Dextran (70 kDa, grønn) ble tilsatt som kanal ugjennomtrengelig kontroll substrat for å overvåke substratspesifisitet av transport arrangementet i tillegg til membranintegritet under forsøket. LUV ble supplert med DOPE ATTO 390 (0,1 mol%, lilla) for å se etter lipid forurensning inne hulrom. Tilsetting av MTSET 3 mm (endelig) ved t = 0 sek åpner kanalen, som fører til Oy647 utstrømming fra hulrommene, innspilt via fluorescens lese-out. C) Tilfeldig plukket MsCl G 22 C efflux kurver viser typiske efflux hendelser. D) Rate konstanter for trans hendelser (n = 242) klynge i to Gaussian befolkningens, som viser at en- og flerkanals transport hendelsene kan bli diskriminert. E) High-innhold screening og statistisk analyse av 9,046 forseglet chip hulrom med trippel-farge sanntid avlesning. 8% av alle analyserte chip hulrom viser eksponensiell efflux hendelser. På grunn av spektral dekoding (red: translocated oppløst stoff, grønn: kontroll oppløst stoff, fiolett: lipid), efflux hendelser, komplekse kinetikk, lipid inntrenging, og membran brudd kan bli diskriminert, og dermed eliminere falske positiver. Dette tallet ble brukt på nytt med tillatelse fra 21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Arrangement klasser preget av tre-fargegjenkjenning. Translocated oppløst stoff (rød), control oppløst stoff (grønn) og et lipid fargestoff (fiolett) kan spektralt diskriminert slik at for objektive data valg A.) forseglet hulrom som bærer noen membran-proteinet viser ingen flux hendelser under de eksperimentelle betingelser som er beskrevet for den MsCl kanalen opptaket (se fig. 3A) . Den fluoriserende avlesning er stabil for alle kanaler. B) Ill-definerte suspendert lipidbilag er i stand til å bryte inn i hulrommet. C) Membranbrudd medfører diskontinuerlig lipidbilag som spenner over de nanopore sprekker. Derved blir det plass hulrommet ikke lenger skilles fra bufferrommet. Innesperrede fargestoffer (rød) unndra hulrommet ned konsentrasjonsgradient. Kontrollen oppløste stoff (grønn), på forhånd ute av stand til å passere over membranen, går D) Eksempel for en lipid inntrenging arrangement hulrom.. Mens det fluorescente signalet for lipid fargestoff (fiolett) øker på grunn av membranen invaderende hulrommet plass, er den trans oppløste substans støterend ut av hulrommet (red), som fører til en reduksjon i fluorescerende signal. Den nanopore er blokkert av lipid bilaget, hindrer passasje av styre substratet (grønn). E) Under membranen brudd, den lukkede transportoppløsningsmaterialet hurtig omgår fra hulrommet (rød), mens kontrollgruppen oppløste substans diffunderer inn (grønn). Dette tallet ble brukt på nytt med tillatelse fra 21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikken som presenteres her gir en svært parallell analyse av membranprotein transport. Rekonstituerte membranproteinsystemer kan direkte brukes til biochip, slik at tilpasning av teoretisk hver membrantransportøren eller kanal mulig. Transport analyse er bare begrenset av etableringen av et fluorescerende lese-out system, enten via direkte fluorescens endring (translokasjon av fluorophores eller fluorescensmerkede underlag) eller indirekte fluorescens endring (pH-følsomme fargestoffer, sekundære enzymatiske reaksjoner). Det siste er imidlertid ennå ikke er fastslått.
Funksjonell karakterisering av membran kanaler eller transportører på enkelt protein nivået er hovedfokus for denne teknikken. I kombinasjon med en automatisert mikroskop, etablering av screeningsprogrammer for protein effektorer er også mulig. Analysen oppsettet gjør at den parallelle opptak av opptil 8 chips, med flere analysepunktene i hver brikke. På grunn av fullstendig separasjon av chips, er det virkelig parallelt, noe som åpner for flere eksperimentelle gjentar inkludert kontroller i et enkelt forsøk, når forholdene er etablert.
Kritiske trinn under setter opp et eksperiment er fremstilling av virkelig unilamellære vesikler, det aktive rekonstitusjon av proteinet av valget, spredning effektivitet av proteoliposomes på chip overflaten og retensjon av evnen det suspenderte ytterste lipid bilaget mot det underlag som brukes i analysen.
Mens fremstilling av unilamellære vesikler er av grunnleggende viktighet for denne analysen for å unngå etablering av multilamellære membraner på brikken overflaten under suspendert lipid bilagsdannelse, er det ganske lett å sikre unilamellarity av vesiklene via sonikering i liposomene i løpet av fremstillingen.
Den direkte anvendelse av proteoliposomes er den store forbedring av fremgangsmåten ented. I motsetning til tidligere tilnærminger mer komplekse og medisinsk relevante proteiner kan nå bli målrettet, krever selvfølgelig forutgående etablering av en rekonstituering protokoll givende funksjonelt protein av valg i LUV. I tillegg membran proteiner besitter store ekstra-membran domener redusere dannelsen av riktig SSMer. Dette må optimaliseres for hver nye protein, for eksempel ved å variere CaCl2-konsentrasjonen.
Den rekonstituering forholdet av proteinet av interesse må velges nøye. Analysen av enkeltprotein hendelser er ønsket og accomplishable bruker her presenteres teknikk. Mengden av rekonstituert protein bør derfor ikke overstige 1-2 funksjonelle protein enheter per pore-dekkende membran lapp antar en ideell tilberedning og at membranprotein er stokastisk fordelt over bilaget. I tillegg retningen av proteinet etter rekonstituering bør også tas i betraktning, da det har not til å være lik mellom begge directionalities.
Til slutt når alle disse spørsmålene er nøye kontrollert og optimalisert, kan ingen av de benyttede substrater vise noen uspesifikke membran permeabilitet av pore spennende membran. Positivt ladede fluoroforer, som de fleste rhodamin-basert fargestoffer i den røde spektral regimet har en tendens til raskt å overvinne membranbarrieren. Sterke hydrofobe interaksjoner kan også føre til en uspesifikk feste til det ytre lipid bilaget. Begge eiendommene er ikke ønskelig.
Studiet av ionekanaler i en kvalitativ måte er også tenkelig. Screening for kanal effektorer ved en binær Ja / Nei avlesning kan bli tenkt på å bruke ion-sensitive fargestoffer. Den største hindringen her ville være å etablere et i det minste delvis ione-beholder lipidbilag. Dette kan bare være oppnåelig via overflatemodifisering av nanopore chip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array. Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).
- Carrillo, L., et al. High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast. Traffic. , (2015).
- Giacomini, K. M., et al. Membrane transporters in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).
- Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).
- Zollmann, T., et al. Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).
- Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys. J. 47, 105-113 (1985).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).
- Naumann, C. A., et al. The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization. Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).
- Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility. Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat. Commun. 5, (2014).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).
- Lohr, C., et al. Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters. Biophysical Journal. 106, 229a (2014).
- Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).
- Milligan, C. J., et al. Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).
- Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters. Sci. Rep. 5, (2015).
- Kleefen, A., et al. Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays. Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).
- Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).
- Urban, M., et al. Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution. Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).
- Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion. ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).
- Heinemann, F., Schwille, P. Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes. ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).
- Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers. ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).
- Winterhalter, M. Black lipid membranes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).
- Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL. Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).
