単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス
Summary
The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.
Abstract
転位した基板は、非起電性である場合、単一のタンパク質レベルでの膜タンパク質の輸送はまだ、詳細な分析を忌避します。かなりの努力がこの分野で行われているが、膜トランスポーターの解析に必要な溶媒を含まない脂質二重層の技術と組み合わせて、自動化ハイスループットトランスポート分析を可能にする技術はまれです。トランスポーターのこのクラスは、しかし、細胞の恒常性において非常に重要なので、薬剤開発や新たな洞察を得るための方法論における重要な目標は必死に必要です。
ここで紹介する原稿は、単一のトランスポーター解像度で膜タンパク質媒介輸送プロセスの分析のための新規バイオチップの確立と取り扱いについて説明します。バイオチップは、その設計において非常に平行であり、工業用グレードおよび量で製造することができるナノポアで囲まれたマイクロキャビティから構成されています。プロテイン保有するリポソームは、直接に適用することができますSSM-技術（固体担持脂質膜）を用いた自己組織化細孔スパニング脂質二重層を形成するチップ表面。膜のポア貫通部分は、中またはリアルタイムでマルチスペクトル蛍光読み出しを続けることができ、キャビティ空間のうち基板転位のためのインターフェースを提供し、自立しています。標準作業手順書（SOP）の設立は、機能的に再構成することができる事実上すべての膜タンパク質のチップ表面上のタンパク質-保有脂質二重層の簡単な設置を可能にします。唯一の前提条件は、非起電輸送基質用の蛍光読み出しシステムの確立です。
ハイコンテンツスクリーニング用途は、並行して複数のチップを記録し、自動化倒立蛍光顕微鏡を使用することによって達成できるです。大きなデータセットを自由に利用できるカスタム設計解析ソフトウェアを用いて分析することができます。三色のマルチスペクトル蛍光読み出し、さらに、偽陽性の結果を排除し、別のイベントクラスに公平なデータ判別を可能にします。
チップ技術は、現在のSiO 2表面に基づいているが、金でコーティングされたチップ表面を使用してさらに官能化することも可能です。
Introduction
膜タンパク質の分析は、過去20年間で基礎および医薬品の研究のための関心が高まっになっています。新規薬剤の開発は、現在、制限要因の一つである、新たな標的の同定および詳細な特性に依存します。すべての薬物標的の約60％が膜タンパク質1であるという事実は、最も重要なその機能を解明するための技術の開発を行います。
4 –過去には、起電チャンネルおよびトランスポーターの研究のための技術は、多数の2で開発されてきました。逆における非起電性基板は、より多くの困難な課題を提示します。彼らはカスケード5のシグナル伝達に重要な受容体などの細胞膜と機能を横切る溶質および栄養素のフラックスを制御するように、彼らは、しかしプライム薬物標的としての特別な関心のです。
かなりの努力がトンの開発に置かれていますechniques膜輸送タンパク質6、7の機能を研究します。いくつか例を挙げると固体担持脂質二重層、繋留二重層11、12、microblackの脂質膜13、14およびネイティブベシクルアレイ15、16を含む10、 –固体支持膜を用いたシステムでは、このフィールド8として最も有望なツールを浮上しています。それらのいくつかは、市販のセットアップ17、18のようにしてもご利用いただけます。いくつかの実施例は、高度に並列に14、19、スクリーニング用途のための前提条件で単一の膜タンパク質を研究する能力を組み合わせること公開されています。しかし、これらの方法はほとんどの産業環境への基礎研究から橋渡しません。困難は、多くの場合、自動化するシステムの能力は、コストのかかる生産および/または面倒な準備にあります。アプローチoを上記の全ての障害をvercomingすることは、最終的な目標です。
22 –ここで紹介する手法は、単一のタンパク質レベル20に制御された環境で、in vitroで膜チャネルおよびトランスポーターを研究するために開発されました。 26または黒色脂質膜27 – LUVをに精製された膜タンパク質の再構成は、はるかにGUVs 23で同等のアプローチよりも確立されています。二重層の形成は自己集合プロセスを介して行われている場合、それらは直接チップ表面に適用することができます。ナノ多孔性チップ（ 図 1）のガラスボトム設計により、システムの簡単な自動化を可能にする空気顕微鏡を可能にします。電動ステージとの組み合わせで複数のチップを、分析のために密封された空洞の数千人を含むビューの各フィールドで、同時に測定することができます。
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図 1。多重化されたナノ細孔のバイオチップの設計 A）は、シリコン・オン・インシュレータ（SOI）ウエハを反応性イオンエッチングにより構成されています。約1150個々のチップは、同一の特性と品質。B）各チップは、ナノ開口を備え25万個々のマイクロキャビティを備えるとともに、各ウェハから製造されます。スケールバー：200μmのC）各キャビティは、マルチスペクトル蛍光読み出しを経由してアドレス可能です。 intransparent上層倒立蛍光顕微鏡とバイオチップの互換性行うブロックバッファリザーバからの蛍光シグナルを、D）原子間力顕微鏡（AFM）イメージングが均一に配置された孔の開口部および3.6ナノメートルの二酸化ケイ素層の表面粗さを（明らかに、N = 40）小胞の融合のために最適。スケールバー：5μmのE）走査型電子マイクroscopy（SEM）画像は、シリコンチップ内のフェムトリットルの空洞へのアクセスを可能にするナノ細孔の断面を示しています。この数字は21から許可を得て再利用した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
すべてのデータ分析は、エンドユーザのための無制限のアクセスを保証するためにフリーウェアを使用して実行されます。時系列は、フリーの画像処理ソフトウェアとバッチ処理と曲線の複数の蛍光チャネルおよび何千も大きなデータセットの単純な相関関係を可能にするカスタムビルド曲線分析ソフトウェアを用いて分析します。
このプロトコルで使用されるモデルタンパク質は、E由来大コンダクタンス（MSCL）チャネルタンパク質の機械受容チャネルであります大腸菌 。それは、本質的に浸透圧ショックを放出する弁として機能するが、合理的にSYNT設計ように変更されましたhetic機能は、共有チャネルの収縮側に取り付けることができます。共有結合した活性化剤（MTSET）の電荷反発を経由してチャンネルがナノバルブを作成、開くようにトリガされます。イオン、水、小さなタンパク質だけでなく、小型の蛍光団のような小分子は、チャネルを介して透過することができます。ここでは、タンパク質は、タンパク質媒介転座を検出するシステムの能力を実証するためのモデルとして使用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する手法は、膜タンパク質輸送の高度な並列分析を可能にします。再構成された膜タンパク質系は、直接、理論的にすべての膜輸送体またはチャネル可能の適応を行う、バイオチップに適用することができます。輸送解析は、唯一の直接蛍光変化（蛍光体の転座または蛍光標識された基質）または間接的な蛍光変化（pH感受性色素、二次酵素反応）のいずれかを介して、蛍光読み?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Barbara Windschiegl for her help in establishing SOPs; Dennis Remme for his work on the NanoCalcFX software and Alina Kollmannsperger, Markus Braner and Milan Gerovac for helpful suggestions on the manuscript. The German-Israeli Project Cooperation (DIP) provided by the DFG and the Federal Ministry of Education and Research to R.T., as well as the Federal Ministry of Economics and Technology (ZIM R&D Project) to R.T. and Nanospot GmbH supported this work.
Materials
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array. Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).
- Carrillo, L., et al. High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast. Traffic. , (2015).
- Giacomini, K. M., et al. Membrane transporters in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).
- Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).
- Zollmann, T., et al. Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).
- Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys. J. 47, 105-113 (1985).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).
- Naumann, C. A., et al. The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization. Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).
- Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility. Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat. Commun. 5, (2014).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).
- Lohr, C., et al. Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters. Biophysical Journal. 106, 229a (2014).
- Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).
- Milligan, C. J., et al. Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).
- Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters. Sci. Rep. 5, (2015).
- Kleefen, A., et al. Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays. Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).
- Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).
- Urban, M., et al. Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution. Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).
- Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion. ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).
- Heinemann, F., Schwille, P. Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes. ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).
- Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers. ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).
- Winterhalter, M. Black lipid membranes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).
- Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL. Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).
