Abstract
transporte de proteínas de membrana no nível de proteína único ainda escapa análise detalhada, se o substrato translocado é não-electrogenic. Esforços consideráveis têm sido feitas neste campo, mas as técnicas que permitem a análise automatizada de transporte de alto rendimento, em combinação com técnicas de bicamada lipídica livre de solvente necessária para a análise dos transportadores de membrana são raras. Esta classe de transportadores, porém, é crucial na homeostase celular e, portanto, um alvo chave no desenvolvimento de medicamentos e metodologias para ganhar novos conhecimentos precisava desesperadamente.
O manuscrito apresentado aqui descreve a criação e gestão de um romance biochip para a análise dos processos de transporte de proteínas mediada membrana em resolução transporter única. O biochip é composto de microcavidades fechados por nanoporos, que é altamente paralelo na sua concepção e pode ser produzido em quantidade e de qualidade industrial. lipossomas proteína-abrigando pode ser directamente aplicada aa superfície do chip formar bicamadas lipídicas-medindo poros auto-montadas usando SSM-técnicas (sólido suportado membranas lipídicas). Pore-abrangendo partes da membrana são independentes, proporcionando a interface para a translocação de substrato para dentro ou para fora do espaço da cavidade, o que pode ser seguido por leitura fluorescente multi-espectral em tempo real. O estabelecimento de procedimentos operacionais padronizados (POPs) permite a criação simples de bicamadas lipídicas-abrigando proteína na superfície do chip de proteína de membrana praticamente todos os que podem ser reconstituídos funcionalmente. O único pré-requisito é o estabelecimento de um sistema de leitura de fluorescência para substratos de transporte não eletrogênica.
aplicações de alto teor de triagem são realizáveis pelo uso de automatizados microscópios fluorescentes invertidos gravação múltiplos chips em paralelo. Grandes conjuntos de dados podem ser analisados usando o software de análise de design personalizado disponível gratuitamente. Três cores de multi espectral fluorescenteleia-out, além disso, permite a discriminação de dados imparcial em diferentes classes de eventos, eliminando falsos resultados positivos.
A tecnologia de chip é atualmente baseado em SiO2 superfícies, mas ainda funcionalização usando superfícies de fichas revestidas de ouro também é possível.
Introduction
A análise das proteínas da membrana tornou-se de crescente interesse para a pesquisa básica e farmacêutica nos últimos 20 anos. O desenvolvimento de novos medicamentos depende da identificação e caracterização de novos alvos detalhada, actualmente ser um dos factores limitantes. O facto de que cerca de 60% de todos os alvos de drogas são proteínas de membrana 1, faz com que o desenvolvimento de técnicas para elucidar a sua função mais importante.
No passado, as técnicas para o estudo de canais electrogénico e transportadores têm sido desenvolvidos na multiplicidade 2-4. substratos não eletrogênica em contrário apresentar uma tarefa mais desafiadora. Eles são no entanto, de especial interesse como alvos de drogas de primeira linha, uma vez que controlam o fluxo de solutos e nutrientes através da membrana celular e como função de receptores principais em cascatas de sinalização 5.
Um esforço considerável foi colocado no desenvolvimento de techniques para estudar a função das proteínas transportadoras de membrana 6, 7. Os sistemas que utilizam membranas sólidas apoiado surgiram como ferramentas mais promissoras neste campo 8-10, incluindo bicamadas lipídicas suportados sólidos, bicamadas tethered 11, 12, membranas lipídicas microblack 13, 14 e nativas vesícula matrizes 15, 16 para citar alguns. Alguns deles estão ainda disponíveis como instalações comerciais 17, 18. Alguns exemplos foram publicados combinando a capacidade de estudar as proteínas de membrana individuais de uma maneira altamente paralela 14, 19, um pré-requisito para as aplicações de rastreio. No entanto, estes métodos raramente ponte de pesquisa básica ao ambiente industrial. As dificuldades muitas vezes encontram-se na capacidade do sistema para ser automatizável, a produção de custo elevado e / ou preparação laboriosa. Uma abordagem overcoming todos os obstáculos acima mencionados é o objetivo final.
A técnica aqui apresentada foi desenvolvido para o estudo de canais de membrana e transportadores in vitro num ambiente controlado no nível de proteína única 20-22. Reconstituição de proteínas de membrana purificadas em LUV é muito mais estabelecida do que as abordagens comparáveis para GUVs 23 - 26 ou lipídios preto membranas 27. Eles podem ser directamente aplicadas à superfície do chip, em que a formação de duas camadas tem lugar através de um processo de auto-montagem. O desenho com fundo de vidro nanoporoso do chip (Fig. 1) permite a microscopia de ar, que permite a automatização simples do sistema. Em combinação com uma platina motorizada múltiplos chips podem ser medidos ao mesmo tempo, com cada campo de visão contendo milhares de cavidades seladas para análise.
Figura 1. Projeto de biochips nanopore multiplexados. A) A silício sobre isolante (SOI) wafer é estruturado por ataque reativa-ion. Cerca de 1.150 fichas individuais são fabricados a partir de cada wafer com propriedades idênticas e qualidade. B) Cada chip inclui 250.000 microcavidades individuais com aberturas nano. Barra de escala:. 200 mm C) Cada cavidade é endereçável através de fluorescência multi-espectral de leitura. Um não transparentes superiores blocos da camada os sinais fluorescentes a partir do reservatório tampão, tornando o biochip compatível com microscópios de fluorescência invertido. D) microscopia de força atómica (AFM), imagiologia revela uniformemente dispostas aberturas dos poros e a rugosidade da superfície da camada de dióxido de silício de 3,6 nm (n = 40) ideal para a fusão das vesículas. Barra de escala:. 5 m E) mic eletrônica de varreduraroscopy imagem (SEM) mostra uma secção transversal através da nano-poros que permite o acesso às cavidades femtoliter dentro do chip de silício. Este valor foi reutilizado com permissão de 21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Toda a análise dos dados é feita usando freeware para garantir o acesso irrestrito para os usuários finais. séries temporais são analisados utilizando software de processamento de imagem gratuito e um processamento em lote que permite o software de análise personalizada curva de construção e correlação direta de grandes conjuntos de dados com múltiplos canais fluorescentes e milhares de curvas.
A proteína modelo utilizado neste protocolo é o canal mechanosensitive de proteína grande condutância (MsCl) canal derivado de E. coli. Ele funciona como uma válvula para libertar choque osmótico na natureza, mas foi modificado de tal maneira que racionalmente concebidos Synthetic funcionalidades pode ser covalentemente ligado ao lado de canais de constrição. Via-carga de repulsão do activador ligado covalentemente (MTSET) do canal é accionado para abrir, a criação de um nano-válvula. Pequenas moléculas como os íons, água, pequenas proteínas, mas também pequenas fluoróforos pode permear através do canal. Aqui, a proteína é utilizada como um modelo para demonstrar a capacidade do sistema para detectar a translocação mediada pela proteína.
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Protocol
1. Preparação de vesículas Unilamelares Grandes (LUV)
- Limpar um balão de fundo redondo (10 ml de volume) com azoto gasoso para remover quaisquer partículas de pó. Lavar o balão de fundo redondo com etanol.
Nota: o etanol residual pode ser tolerada e não perturbe os passos subsequentes. - Lava-se 1 mL de 4x seringa de vidro com clorofórmio, para remover qualquer contaminação. Adicionar 4 ml SoyPC20 (25 mg / ml em clorofórmio) para o balão de fundo redondo e DOPE a solução de lípido com um ATTO 390 DOPE adicional para uma concentração final de 0,1% molar.
Nota: Em vez de DOPE ATTO 390 outros lípidos marcados com fluoróforo ou corantes lipofílicos também pode ser utilizado, dependendo das fontes de excitação disponíveis. - Ligue o balão de fundo redondo de um evaporador rotativo. Seca-se a película de lípido durante 40 minutos a 300 mbar, 30 ° C temperatura do banho de água e a velocidade de rotação máxima, para formar uma película de lípido homogéneo na parede de vidro do frasco.
- Transfer o frasco para uma bomba de vácuo elevado e seca a película de lípido durante 30 minutos adicionais à temperatura ambiente.
- Adicionar 5 ml de tampão (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; esterilizada por filtração) e 8 esferas de vidro (2,7 mm de diâmetro, etanol lavado e seco) ao balão. Ligue o balão no evaporador rotativo e rodar sem vácuo a 50 ° C à velocidade máxima.
Nota: Os grânulos de vidro mecanicamente deslocar o filme lipídico da parede do vidro, levando a (multilamelares) formação de vesículas. Após 45 minutos de rotação a solução aparência leitosa e nenhum filme lipídico residual deve ser visível nas paredes do frasco. Em vez de esferas de vidro de outros métodos, como sonicando o frasco num sonicador de banho de água, o frasco vortex ou o método de re-hidratação suave também são aplicáveis. - Transferir o frasco em condições de gás inerte (árgon) a um banho de ultra-sons e sonicado durante 4 minutos à temperatura ambiente.
Nota: As ondas de choque ultra-som perturbar os lipossomas, tornando-os unilamelar. - Dividir a solução LUVem aliquotas de 1 mL.
- Realizar ciclos de 5 de congelamento / descongelamento por congelamento a solução LUV em azoto líquido, seguido por degelo a 40 ° C num banho de água.
Nota: Isto leva à ruptura e rearranjo espontânea de lipossomas individuais uns com os outros, levando ao aumento de tamanho. - Na última etapa loja congelamento todas as amostras a -80 ° C.
Nota: As LUV será estável durante pelo menos 6 meses.
Reconstituição 2. Proteína
- Descongelar uma aliquota LUV ml em gelo. Directamente antes da reconstituição, a extrusão de lipossomas através de uma membrana de 17x filtro de policarbonato de 400 nm, utilizando um mini-extrusor.
Nota: Os agregados lipídicos serão removidos e a distribuição de tamanho homogénea final seja alcançada. - Desestabilizar LUV por adição de 4% de Triton X-100 (v / v) para uma concentração final de 0,25% (v / v) e incuba-se durante 5 min a 50 ° C.
Nota: A quantidade de lipossomas utilizada neste passo depende da massa do purificada MsCl L <sup> 22 C usado (veja o passo 2.3). Purifica-se MsCl L 22 C (derivado de E. coli), como descrito em detalhe em 28. - Misturar purificado MsCl L 22 C e lipossomas saturada de detergente a 1:20 (w / w) proporção e incubar durante mais 30 minutos a 50 ° C.
- Para a remoção de detergente adicionar bio-grânulos em tampão Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; esterilizada por filtração) para a solução de proteína / lipossoma, com 16 mg (peso húmido) de bio-grânulos por ul detergente utilizado para desestabilizar lipossomas em passo 2.2.
- Executa a remoção de detergente durante a noite (16 horas) a 4 ° C sobre uma placa rotativa.
Nota: A mistura constante da solução de remoção de detergente assegura óptima. - Após a remoção de detergente de loja proteolipossomas a 4 ° C e usado para experiências no mesmo dia.
Ensaio 3. Atividade
- Durante a reconstituição proteína tomar uma alíquota de 100 ul de detergent-solução proteolipossomos desestabilizado depois de terminar o passo 2.3.
- Adicionar 1 volume de calceína (30 mM) à solução de proteína no lipossoma e incubar 5 minutos adicionais a 50 ° C.
- Remover detergente a partir da solução, tal como descrito no passo 2,4-2,6.
- Após a remoção do detergente equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho (20 ml de volume de leito ou mais) com tampão Tris (3x o volume do leito).
Nota: proteolipossoma separação pode ser realizada à temperatura ambiente, no entanto mantendo constantemente a amostra a 4 ° C, é aconselhável para assegurar melhor a actividade da proteína após fraccionamento. - proteolipossomas separados da calceina livre por aplicação de toda a alíquota (200 ul) para a coluna de exclusão de tamanho. Permitir que a mistura de molho na coluna, seguido de eluição dos proteolipossomas a partir da coluna através da aplicação de tampão contínuo em cima utilizando fluxo por gravidade. Observe a calceína contendo proteolipossomos como uma banda de laranja discreta em frente a eluição. Recolha fracções de 500 & #181; l, respectivamente.
Nota: corante calceína gratuito eluir� após a fração proteolipossomos com a separação completa. - Pipetar 80 ul de cada fracção para uma placa de micro-poços, durante fluorescente de leitura e identificar a fracção que contém a maior quantidade de calceína proteolipossomas contendo através de emissão de fluorescência. Detectar a fluorescência a 520 nm com excitação a 490 nm. Utilizar a fracção proteolipossoma com o sinal mais elevado para o ensaio de actividade a seguir.
- Misturar 20 uL de uma fracção contendo proteolipossoma com 980 ul de tampão Tris numa cuvete de 1 ml de fluorescência.
- Medir emissão de fluorescência a 520 nm (excitação 490 nm) utilizando um espectrofluorómetro. Ficha durante 1 min e, em seguida, adicionar 25 ul de MTSET ([2- (trimetilamónio) etilo] metanotiosulfonato) a partir de uma solução-mãe (160 mM) e misture bem. Mantenha-se na gravação durante a mistura. Sempre preparar a solução estoque fresco directamente antes da utilização.
Nota: Uma vez resolvido em tampão MTSET hydrolyzes dentro de 30 minutos e será não-reativo. MTSET pode ser pesado e mantido aliquota como pó seco a -20 ° C até à sua utilização.
Observação: Uma vez activado o canal MsCl L 22 C abre-se e liberta a calceína encapsulada, levando a uma diminuição da concentração local do calceína quando effluxing proteolipossomos e subsequente dequenching do corante, resultando num aumento da emissão de fluorescência. - Após a emissão de fluorescência foi atingido um patamar estável de novo, solubilizar os lipossomas por adição de 50 ul de Triton X-100 (4% v / v).
Nota: Idealmente nenhum aumento de fluorescência pode ser observado, o que implica proteína activa em cada lipossoma.
4. Tamanho Medidas de Distribuição de LUV utilizar o acompanhamento de Nano-partículas
- Note-se que apenas as amostras mínimas de lipossoma ou proteolipossomos solução são necessários para a análise da distribuição de tamanho usando o rastreador de nanopartículas. Dilui-se uma solução de lipossomas de 5 mg / mL concentração de lípido 1: 5000 (v / v) em tampão (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; esterilizada por filtração) para análise a um volume final de 1 ml. Filtrar todos os tampões usados para a diluição e preparação LUV antes e reconstituição utilizando uma membrana de 0,2 um para remover as partículas em suspensão, como a poeira que pode perturbar as medições de distribuição de tamanhos.
- Lave o fluxo câmara com água ultra-pura.
- Use os marcadores de superfície para focar o feixe de luz. Injectar aproximadamente 300 ul de amostra diluída e imediatamente lipossoma fechar a válvula de saída para parar o fluxo dentro da câmara de fluxo, sem a introdução de quaisquer bolhas de ar.
- Ajustar as configurações de foco e câmera do obturador / ganho para assegurar sinal de dispersão adequada da amostra para a detecção.
Nota: 20 - 80 sinais deve ser claramente visível no campo de visão. Evitar a superlotação (> 80 sinais) como o software não será capaz de rastrear sinais individuais quando sobrepostos. - Vá para a scr "Capture"een. Ajustar o controlo da temperatura para 25 ° C e a duração da captura a 90 seg utilizando os controlos de software. Pressione o botão "Record" para começar a gravar uma série de tempo.
Nota: Após a conclusão da série de tempo uma nova janela é aberta. - Salvar a série tempo no formato dado (* .avi). Por razões práticas durante a análise do lote salvar todos os arquivos em uma única pasta.
- Abra a válvula de saída e injetar mais 300 ul para a câmara de fluxo. Fechar a válvula e repita os passos de 4,3-4,6 duas vezes.
- Depois de completar todas as corridas de exemplo lavar a câmara de fluxo com 5 ml de água ultra-pura. Vá para a tela "Pre-Process". Ajustar a temperatura parâmetros de calibração = 25 ° C e a viscosidade = 0,91 para o tampão Tris utilizados no presente protocolo.
- Abra a janela do processo de lote e carregar a série tempo registrado (Advanced / Batch Processo / conjunto de arquivos 1-3). Pressione o botão "GO" para iniciar a análise da distribuição de tamanho.
Nota: os automatica de software de análisecamente rastreia as partículas individuais e calcula seu diâmetro com base em seu comportamento movimento utilizando os parâmetros definidos na etapa 4.8.
Nota: A análise da distribuição tamanho resultante salva automaticamente na mesma pasta que os ficheiros de séries temporais. - Além disso criar um arquivo de relatório para resumir os resultados (Export / Criar relatório PDF).
5. Chip Preparação Detentor
- Pesar 1,0 g de MDX4 base de elastómero de qualidade medicinal e de 0,1 g de agente de cura MDX4 num tubo de reacção de 50 ml. Misture-os bem com uma barra de vidro.
- Colocar o tubo num exsicador durante 1 h para desgaseificar o adesivo. Depois usá-lo dentro de 30 min para a colagem de chip, como o adesivo vai endurecer e ser muito difícil de trabalhar.
- Durante desgaseificação elastômero (passo 5.1) limpar uma lâmina de vidro objectivo exaustivamente com clorofórmio para remover quaisquer contaminações antes da colagem de chip. Lavar a lâmina com 5 ml de clorofórmio utilizando uma seringa de vidro. recolher oclorofórmio numa proveta posicionada por baixo. Após a lavagem deixar o slide seca.
Nota: Execute esta etapa sob uma coifa. Alternativa ao clorofórmio, outros solventes orgânicos, tais como acetona, também podem ser usados. - Depositar uma pequena quantidade de material de ligação adesivo sobre a tampa de vidro utilizando uma ponta de pipeta (pontas de pipetas de cristal de 10 ml). Lembrar que as batatas fritas que se encaixam em porta-lâminas a 8-câmara mais tarde, e tem que ser colocado na corrediça em conformidade.
- Remova cuidadosamente uma ficha de cada vez da placa de wafer usando uma pinça de ponta fina e depositar o chip na gota de adesivo na tampa de vidro. Certifique-se de que o lado revestido do chip virado para cima.
- Com cuidado, empurre o chip para o vidro da tampa com as costas de um blunt pinças PE. Para assegurar que a cola é dispensada uniformemente por baixo do chip, o chip cuidadosamente deslize para trás e para trás. Passo crítico: Certifique-se que não há bolhas de ar presas debaixo do chip, uma vez que irá perturbar imagem ópticadas cavidades de chips mais tarde. Também garantir que nenhum material adesivo contamina a superfície do chip.
- Desidratar a tampa de vidro acabado durante 2 horas a 65 ° C num secador de gabinete.
Nota: As fritas são ainda revestidos com uma camada protectora, originário da sua fabricação que necessita de ser removida. - Para remover a camada de protecção, efectuar um passo de lavagem sequencial solvente. Durante a cura de chips, pré-aquecer num banho de água a 54 ° C.
- Coloque 3 copos de vidro em banho-maria, dois deles cheios de isopropanol e um enchido com acetona.
- Insira a tampa do vidro de chips em um suporte de slides e mergulhe-o na primeira isopropanol prato cheio para 10 min. Em seguida transferi-lo para a acetona preenchido prato, incubar outra vez durante 10 minutos antes de transferi-lo para o passo final de lavagem com o segundo prato de isopropanol e incubar mais 10 min.
- Retire o suporte da lâmina do prato e lavá-lo com cuidado extensivamente com Ultrapure água, seguido de secagem das batatas fritas com uma corrente suave de azoto gasoso.
- Take-off da folha de laminação a partir do 8 poços sticky-slide e colocá-lo para trás no banco. Com cuidado, pegue o slide tampa e pressione suavemente para o sticky-slide com os chips voltados para os poços. Deixe o resto suporte de chip acabado por um par de minutos antes de usar.
6. Ensaio Preparação
Nota: fichas Nanopore colada a uma tampa de vidro e separados por um de 8 poços sticky-slide possuem o benefício, que vários chips podem ser abordadas em uma única corrida experimental, com chips sendo completamente separadas umas das outras.
- Após a preparação titular de chips, lavar cada chip com etanol puro e golpe seco com azoto gasoso, para remover quaisquer contaminações como poeira.
- Limpar a superfície do chip com ar, oxigénio ou azoto no plasma. Dependendo do tipo de limpeza de plasma períodos de tempo variar: realizar o tratamento de plasma de oxigénio durante 1 minuto, ar e nitRogen plasma por 5 min a 0,3 mbar na configuração de energia de 80% (média de potência de RF ou altas).
- Após a limpeza plasma incubar fichas em etanol puro para 10-15 minutos para garantir a humidificação cavidade.
- etanol troca gradual de tampão através da adição de 400 ul de tampão Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; esterilizada por filtração), seguido por mistura da solução sem a introdução de bolhas de ar e a subsequente remoção de 400 ul. Repetir este procedimento 12 vezes, para assegurar a remoção de etanol.
Nota: Etanol seria prejudicial para os lipossomas e as bicamadas lipídicas em suspensão. - Narcótico tampão Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; esterilizada por filtração) com 5 mM de CaCl2 e 1 uM Oy647 corante. Remover completamente o tampão de lavagem a partir do chip e adicione imediatamente o tampão dopado para o chip. Nota: fritas será coberta por uma película fina de tampão após a remoção do tampão de lavagem, de modo que o chip não está em contacto directo com o ar, garantindo uma constante de molhagem das cavidades e a superfície do chip.
- Adicionar 1 mg / ml ou LUV Proteo-LUV em tampão Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0; esterilizada por filtração) a cada poço.
Nota: O volume final em cada poço seja de 300 ul. Considere adições subsequentes do corante controle e o modificador MTSET química durante dopado adição de tampão Tris. - Para lípido formação em bicamada que atravessa a poro sobre a superfície do chip incubar o chip durante 1 h à temperatura ambiente com a solução de lipossomas. Depois lavar cada chip com 4x 400 ul de Ca 2 + livre de tampão Tris.
- Adicionar o corante de controlo a cada poço, com uma concentração final de 5 uM. Os chips são agora pronto para o ensaio de translocação.
7. Setup Assay
- Montar o suporte do chip para o microscópio de epifluorescência (objetiva ar 20X, longa distância de trabalho). Concentre-se na borda do chip nanopore para encontrar mais facilmente o plano focal dos micro-cavidades. Uma vez que as cavidades são em foco digitalizar a matriz nanoporo para uma região them exibe maior proporção de vedação.
Nota: Cada microscópio de epifluorescência invertida pode ser utilizada para realizar ensaios de chip. Dependendo da ampliação objetiva (20X - 60X) o número de cavidades ensaiadas irá variar, com até 9.000 cavidades em um único campo de visão usando ampliação de 20x. objetivos de ar com uma longa distância de trabalho são preferíveis. A utilização de microscópios invertidos confocal de varrimento laser (CLSM) também é possível, mas de aquisição de imagem pode ser o factor limitante, devido à profundidade de foco limitada. - Otimizar a iluminação de chip.
Nota: Certifique-se de que ambos os canais de corante não excedam o valor máximo da escala de cinza, pois as alterações não podem ser observados. Para as experiências de exportação ajustar a iluminação do corante translocado para 90% da capacidade máxima do sinal. Ajustar o corante de controlo em cavidades abertas a 80-90% da capacidade máxima do sinal para detectar claramente qualquer vedação de membrana permeável. - Uma vez que todos os canais são ajustados iniciar a série temporal. Captar imagens a cada 10-20 SEC durante 90 min.
Nota: Este é adequada para seguir da mesma forma eventos específicos e inespecíficos de efluxo. - Inicializar o efluxo do substrato fluorescente pela adição de cisteína-específico, carregado positivamente MTSET composto para uma concentração final de 3 mM. Permitir que pelo menos 5 min de tempo de execução do experimento antes MTSET além de ser capaz de, mais tarde, estabelecer um sinal fluorescente estável linha de base antes de canalizar abertura. Sempre preparar solução MTSET fresco diretamente antes do uso.
Análise 8. Dados
- Abra a pilha de séries temporais com uma versão padrão do ImageJ (Arquivo / Importar / Imagem Sequence).
- Se os canais fluorescentes são empilhados, dividir os canais em pilhas individuais para cada canal (Imagem / Pilhas / Pilha de Imagens).
- Duplique a primeira imagem do canal de substrato translocação para o ROI (regiões de interesse) de identificação (Imagem / Duplicar).
- Converter a imagem para uma imagem binária (Imagem / Ajuste / Threshold). Garantirque o algoritmo utilizado descreve sinais para todas as cavidades seladas sem sobreposição pixilation.
- definir automaticamente regiões de interesse com a ferramenta de analisador de partículas (Análise / Análise de Partículas). Definir um tamanho mínimo de partícula definido, para evitar ruídos de partículas. Verifique as opções de "excluir em bordas" e "incluem buracos". Certifique-se que ROIs resultantes refletem o padrão de matriz microcavidade. ROIs ligam, são artefatos, portanto, removê-los. Salvar a lista de ROI.
Nota: parâmetro de medição tem de ser definido como "área" antes da análise de partículas (Analisar / Set Medidas / Area) - Abra o plug-in Time Series Analyzer (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html), que redimensiona todas as ROIs automaticamente para o mesmo tamanho. Re-size todos os ROIs existente para uma largura / altura de pixels 6x6 e forma oval (temporizador Series Analyzer / AutoROIProperties). Marque a opção "Redimensionar ROIS existente". Salvar a lista de ROI redimensionada resultante.
- Abra o gerenciador de ROI(Análise / Ferramentas / ROI Manager) e carregar a lista de ROI redimensionada para cada canal da série histórica (ROI Manger / Mais / Open). ROIs serão sobrepostas. Para analisar a mudança de sinal para cada ROI iniciar a ferramenta Medida multi (ROI Gerente / Mais / Medida multi), selecione "Meça todos os cortes" e "Uma linha por slice" e começar a multi medida.
Nota: parâmetro de medição tem de ser definido como "valor médio cinzenta" para esta etapa (Analisar / SET Medidas / Valor médio de cinza) - Salve a tabela resultante, dando o valor de cinza médio para cada ROI em * .txt ou * formato .xls.
- Importar a análise de ROI de cada canal de processamento de imagem em NanoCalcFX através da opção "Importar arquivo". Definir "Usar primeira linha para nomear série". Defina o tamanho do passo entre as imagens de acordo com os períodos de aquisição de imagem série de tempo e escolher a coluna correspondente e separador decimal.
- Use a opção "folha múltipla" para correlacionar automaticamente os gráficos do fluo indivíduocanais rescent.
Nota: Os eventos podem agora ser analisados e classificados utilizando a informação dada pela informação espectral de 3 cores. - Ajustar as curvas selecionados usando o build-in função de ajuste (opção de ajuste).
Nota: A equação de efluxo e influxo implementado é adequado para todos os eventos conduzido por difusão monoexponencial e limites de ajuste pode ser ajustado. Resultantes constantes de velocidade podem ser plotados usando a ferramenta histograma ou exportados para o refinamento de novos dados.
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Representative Results
membranas que atravessa a poro pode ser facilmente criado na superfície do chip nanoestruturada de uma maneira auto-montadas. No entanto, o processo subjacente ainda é delicado e influenciado por muitos parâmetros como o tamanho de lipossomas, monodispersity da população de lipossomas, lamelaridade, lipídios e as propriedades do sal de concentração e de superfície química. A maioria destes parâmetros foram cuidadosamente caracterizado e padronizado no protocolo acima. Outros parâmetros no entanto devem ser verificados durante cada nova preparação, para garantir uma experiência bem sucedida. Estas são a distribuição de tamanho dos lipossomas e da distribuição da população (Fig. 2 A). Para a formação da membrana-medindo poros ideal e para evitar lipossoma intrusão nas tamanhos cavidade espaço de lipossomas bem acima do diâmetro dos poros são uma necessidade. Além disso, as preparações de lipossomas monodispersas foram mostrados para se obter melhores resultados em membrana e espalhando fusiem. Um outro passo crucial que tem de ser controlada para cada preparação é a actividade da proteína após a reconstituição. Utilizando um ensaio de fluorescência para dequenching lipossomas reconstituídos com MsCl L 22 C, a abertura do canal pode ser monitorizado através de espectroscopia de fluorescência, para originar uma razão de lipossomas que albergam activo MsCl L 22 de proteína C (Fig. 2 B).
Depois de se espalhar à superfície do chip, soluto translocação de um alvo fluorescente por MsCl L 22 C após activação pelo ligando pode ser seguido (Fig. 3 B). Engenharia MsCl G 22 canais C estão fechados em seu estado padrão, aprisionar pequenas moléculas fluorescentes dentro do espaço da cavidade. Por adição do modulador MTSET química cargas positivas são introduzidos para a região de constrição deo MsCl G 22 C poros, abrindo-a através de repulsão eletrostática. O fluoróforo antes retido escapa do espaço de cavidade para conseguir a difusão de equilíbrio. O decréscimo subsequente da fluorescência dentro do espaço de cavidade pode ser monitorizada. Este processo é altamente reprodutível, resultando numa população homogénea de eventos de efluxo (Fig. 3 C). As curvas resultantes de efluxo, agrupam-se duas populações distintas, demonstrando a capacidade do ensaio para distinguir entre os eventos de translocação simples e multicanal (Fig. 3 D). Além disso, o sistema é capaz de acompanhar a três corantes espectralmente bem separados em paralelo e em tempo real, tornando-se possível gravar rastreios de alto conteúdo e discriminar com precisão e objectivamente entre resultados positivos e negativos falsos positivos,. Neste estudo foram analisadas 9.046 cavidades seladas, dos quais 8% apresentada efflcomportamento UX. Implantando os canais de leitura de diferentes fluorescentes, os eventos podem ser discriminadas em eventos monoexponencial de efluxo, cinética complexos, intrusões de lipídios e rupturas de membranas (Fig. 3 E). Só eventos que exibem sinais constantes para o controlo de soluto e o corante de membrana são consideradas para análise final. cinética complexos representam eventos de efluxo com sinais de controle instáveis e, portanto, são omitidos. intrusões de lipídios e rupturas de membranas são eventos que ocorrem artefato intrinsecamente usando sistemas bicamada lipídica de abrangência dos poros. Eles podem ser desprezados, utilizando os sinais de controlo de corantes como mencionado acima (Fig. 4).
Figura distribuição 2. Tamanho da proteolipossomos e função MsCl. A) As vesículas foram analyz ed por análise de acompanhamento de nano-partículas. Amostras LUV foram examinados antes (traço preto) e após reconstituição do MsCl G 22 C (traço vermelho). Após a preparação LUV, um tamanho de partícula médio de 214 ± 70 nm é alcançado. O tamanho é diminuída durante a reconstituição, o que resulta em proteolipossomas de 158 ± 60 nm, em actividade tamanho. B) MsCl foi validado após reconstituição por um ensaio de efluxo. 28 calceína auto-arrefecido é libertado da proteolipossomas através da abertura MTSET mediada do canal MsCl, levando a dequenching do fluoróforo (vermelho) e de um rápido aumento da intensidade de fluorescência. Lipossomas sem a proteína não mostram tais efluxo, além MTSET mesmo após repetidas (preto). Subsequentemente introduziu-solubilização detergente (TX-100) dos lipossomas liberta todos os anteriormente encapsulado corante. Este valor foi reutilizado com permissão de 21.et = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Fechado por ligando translocação de solutos por MsCl a nível única molécula. A) Engineered MsCl G 22 canais C estão fechados em seu estado padrão. Pequenos solutos, tais como um fluoróforo são incapazes de passar através do canal nem nem a bicamada lipídica. Após a adição de MTSET, uma única cisteína modificada de cada MsCl L 22 C prot�mero é modificado, a introdução de várias cargas positivas no lado da constrição do complexo canal pentamérica. A MsCl L 22 C canal é empurrado aberto por repulsão de cargas e o corante retido pode difundir para fora da cavidade, o que levou a uma diminuição na intensidade de fluorescência. B) Time vestígios de MsCl G 22 C de abertura com a adição de MTSET. Proteolipossomas contendo funcionalmente reconstituído MsCl L 22 C foram espalhados sobre a superfície do chip. Oy647 (vermelho) foi retido no interior das cavidades como substrato de translocação. OregonGreen Dextrano (70 kDa, verde) foi adicionado como substrato impermeável canal de controlo para controlar a especificidade de substrato do evento de transporte, bem como a integridade da membrana durante a experiência. LUV foram suplementadas com DOPE ATTO 390 (0,1 mol%; roxo) para verificar se há contaminação de lipídios no interior de cavidades. A adição de MTSET (3 mM final) a t = 0 seg abre o canal, que conduz a Oy647 efluxo a partir das cavidades, gravado através de fluorescência de leitura. C) aleatoriamente escolhido MsCl L 22 curvas C efluxo demonstrar eventos típicos de efluxo. D) Classificação constantes para eventos de translocação (n = 242) de cluster em dois população Gaussians, o que demonstra que os eventos de transporte simples e multi-canal podem ser discriminados. E) rastreio de alta conteúdo e análise estatística de 9.046 cavidades de chips selados pela triple-cor em tempo real de leitura. 8% de todas as cavidades de fichas analisadas mostrar os eventos de efluxo exponenciais. Devido à decodificação espectral (vermelho: translocado soluto; verde: controle de soluto; violeta: lipídica), os eventos de efluxo, cinética complexos, intrusões de lipídios, e rupturas de membranas pode ser discriminado, eliminando falsos positivos. Este valor foi reutilizado com permissão de 21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Classes de eventos distinguem-se pela detecção de três cores. soluto translocado (vermelho), control soluto (verde) e um corante de lípidos (violeta) pode ser espectralmente discriminados permitindo a seleção de dados imparcial. A) cavidades seladas albergando nenhuma proteína de membrana não mostram eventos de fluxo sob as condições experimentais descritas para o canal de MsCl a gravação (ver a Fig. 3A) . A leitura fluorescente é estável para todos os canais. B) mal definidas bicamadas lipídicas suspensos são capazes de invadir a cavidade. C) de ruptura da membrana resulta na bicamada lipídica descontínua abrangendo as fissuras nanopore. Desse modo, o espaço de cavidade já não é separado do compartimento do tampão. corantes aprisionadas (vermelho) fugir da cavidade para baixo o gradiente de concentração. O soluto de controlo (verde), previamente incapazes de passar através da membrana, entra no D) Exemplo para um evento de intrusão lípido cavidade.. Enquanto o sinal de fluorescência para o corante de lípidos (violeta) aumenta, devido à membrana invadir o espaço de cavidade, o soluto é translocação Pushed para fora da cavidade (vermelho), conduzindo a uma diminuição do sinal de fluorescência. O nano-poros é bloqueada pela camada dupla de lípido, evitando a passagem do substrato de controlo (verde). E) Durante a ruptura da membrana, o soluto de transporte fechado escapa rapidamente da cavidade (vermelho), enquanto que o soluto se difunde no controlo (verde). Este valor foi reutilizado com permissão de 21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A técnica apresentada aqui permite uma análise altamente paralela de transporte de proteínas de membrana. sistemas de proteína da membrana reconstituídas pode ser directamente aplicado ao biochip, fazer a adaptação de cada teoricamente transportador de membrana ou canalizar possível. análise de Transporte só é limitado pelo estabelecimento de um sistema de leitura de fluorescente, quer através de mudança direta de fluorescência (translocação de fluoróforos ou substratos marcados com fluorescência) ou a mudança indireta de fluorescência (corantes sensíveis ao pH, reações enzimáticas secundárias). Este último, no entanto, ainda não foram estabelecidos.
Caracterização funcional de canais de membrana ou transportadores sobre o nível de proteína única é o foco principal desta técnica. Em combinação com um microscópio automatizado, o estabelecimento de aplicações de rastreio para efectores de proteínas também é possível. A configuração do ensaio permite a gravação paralela de até 8 chips, com múltiplos pontos de ensaio em cada chip. Por causa da separação completa dos chips, é verdadeiramente paralelo, permitindo múltiplas repetições experimentais incluindo controles em uma única corrida experimental, uma vez que foram estabelecidas as condições.
passos críticos durante a criação de uma experiência são a preparação de vesículas unilamelares realmente, a reconstituição activo da proteína de escolha, espalhando-se a eficiência de proteolipossomas na superfície do chip e a capacidade de retenção da bicamada lipídica suspensa em sentido os substratos utilizados no ensaio.
Embora a preparação de vesículas unilamelares é de importância fundamental para este ensaio a fim de evitar a criação de folhas de membrana multilamelares na superfície do chip durante a formação da bicamada lipídica suspenso, é bastante fácil para garantir unilamellarity das vesículas através de sonicação os lipossomas durante a preparação.
A aplicação direta de proteolipossomos é o grande avanço do Presente métodod. Em contraste com as abordagens anteriores proteínas mais complexas e medicamente relevantes podem agora ser alvo, exigindo, naturalmente, o estabelecimento prévio de um protocolo de reconstituição produzindo proteína funcional de escolha em LUV. Além disso, as proteínas da membrana que possuam domínios extra-membranares grandes diminuir a formação de SSMs adequadas. Isto tem de ser optimizada para cada nova proteína, por exemplo, por variação da concentração de CaCl2.
O rácio de reconstituição da proteína de interesse tem de ser escolhido cuidadosamente. A análise de acontecimentos individuais de proteína é desejada e realizáveis utilizando a técnica aqui apresentada. A quantidade de proteína reconstituída não deve, portanto, exceder 1-2 unidades funcionais de proteínas de membrana por patch-medindo poro assumindo uma reconstituição ideal e que a proteína de membrana é estocasticamente distribuído através da bicamada. Além disso, a direccionalidade da proteína após reconstituição deve também ser mantido em mente, uma vez que tem not para ser igual entre os dois direcionalidades.
Finalmente uma vez que todas estas questões são cuidadosamente verificados e otimizados, nenhum dos substratos utilizados podem exibir qualquer permeabilidade da membrana inespecífica da membrana-medindo poros. fluoróforos carregada positivamente, como a maioria dos corantes à base de rodamina no regime espectral vermelho tendem a ultrapassar rapidamente a barreira da membrana. interacções hidrofóbicas fortes também pode conduzir a uma fixação inespecífica à bicamada lipídica. Ambas as propriedades não são desejados.
O estudo de canais de iões de um modo qualitativo, também é imaginável. Triagem para efetores canal usando um binário Sim / Não leitura poderia ser pensado de usar corantes sensíveis-íon. O maior obstáculo aqui seria o estabelecimento de uma bicamada lipídica, pelo menos em parte, mantendo-ion. Isso só pode ser alcançado através de modificação da superfície do chip nanopore.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat Biotechnol. 25, 1119 (2007).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array. Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).
- Carrillo, L., et al. High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast. Traffic. , (2015).
- Giacomini, K. M., et al. Membrane transporters in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).
- Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).
- Zollmann, T., et al. Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).
- Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys. J. 47, 105-113 (1985).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271, 43-48 (1996).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).
- Naumann, C. A., et al. The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization. Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).
- Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility. Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat. Commun. 5, (2014).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).
- Lohr, C., et al. Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters. Biophysical Journal. 106, 229a (2014).
- Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).
- Milligan, C. J., et al. Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells. Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).
- Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters. Sci. Rep. 5, (2015).
- Kleefen, A., et al. Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays. Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).
- Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).
- Urban, M., et al. Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution. Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).
- Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion. ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).
- Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).
- Heinemann, F., Schwille, P. Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes. ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).
- Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers. ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).
- Winterhalter, M. Black lipid membranes. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).
- Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL. Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).
