Abstract
転位した基板は、非起電性である場合、単一のタンパク質レベルでの膜タンパク質の輸送はまだ、詳細な分析を忌避します。かなりの努力がこの分野で行われているが、膜トランスポーターの解析に必要な溶媒を含まない脂質二重層の技術と組み合わせて、自動化ハイスループットトランスポート分析を可能にする技術はまれです。トランスポーターのこのクラスは、しかし、細胞の恒常性において非常に重要なので、薬剤開発や新たな洞察を得るための方法論における重要な目標は必死に必要です。
ここで紹介する原稿は、単一のトランスポーター解像度で膜タンパク質媒介輸送プロセスの分析のための新規バイオチップの確立と取り扱いについて説明します。バイオチップは、その設計において非常に平行であり、工業用グレードおよび量で製造することができるナノポアで囲まれたマイクロキャビティから構成されています。プロテイン保有するリポソームは、直接に適用することができますSSM-技術（固体担持脂質膜）を用いた自己組織化細孔スパニング脂質二重層を形成するチップ表面。膜のポア貫通部分は、中またはリアルタイムでマルチスペクトル蛍光読み出しを続けることができ、キャビティ空間のうち基板転位のためのインターフェースを提供し、自立しています。標準作業手順書（SOP）の設立は、機能的に再構成することができる事実上すべての膜タンパク質のチップ表面上のタンパク質-保有脂質二重層の簡単な設置を可能にします。唯一の前提条件は、非起電輸送基質用の蛍光読み出しシステムの確立です。
ハイコンテンツスクリーニング用途は、並行して複数のチップを記録し、自動化倒立蛍光顕微鏡を使用することによって達成できるです。大きなデータセットを自由に利用できるカスタム設計解析ソフトウェアを用いて分析することができます。三色のマルチスペクトル蛍光読み出し、さらに、偽陽性の結果を排除し、別のイベントクラスに公平なデータ判別を可能にします。
チップ技術は、現在のSiO 2表面に基づいているが、金でコーティングされたチップ表面を使用してさらに官能化することも可能です。
Introduction
膜タンパク質の分析は、過去20年間で基礎および医薬品の研究のための関心が高まっになっています。新規薬剤の開発は、現在、制限要因の一つである、新たな標的の同定および詳細な特性に依存します。すべての薬物標的の約60％が膜タンパク質1であるという事実は、最も重要なその機能を解明するための技術の開発を行います。
4 -過去には、起電チャンネルおよびトランスポーターの研究のための技術は、多数の2で開発されてきました。逆における非起電性基板は、より多くの困難な課題を提示します。彼らはカスケード5のシグナル伝達に重要な受容体などの細胞膜と機能を横切る溶質および栄養素のフラックスを制御するように、彼らは、しかしプライム薬物標的としての特別な関心のです。
かなりの努力がトンの開発に置かれていますechniques膜輸送タンパク質6、7の機能を研究します。いくつか例を挙げると固体担持脂質二重層、繋留二重層11、12、microblackの脂質膜13、14およびネイティブベシクルアレイ15、16を含む10、 -固体支持膜を用いたシステムでは、このフィールド8として最も有望なツールを浮上しています。それらのいくつかは、市販のセットアップ17、18のようにしてもご利用いただけます。いくつかの実施例は、高度に並列に14、19、スクリーニング用途のための前提条件で単一の膜タンパク質を研究する能力を組み合わせること公開されています。しかし、これらの方法はほとんどの産業環境への基礎研究から橋渡しません。困難は、多くの場合、自動化するシステムの能力は、コストのかかる生産および/または面倒な準備にあります。アプローチoを上記の全ての障害をvercomingすることは、最終的な目標です。
22 -ここで紹介する手法は、単一のタンパク質レベル20に制御された環境で、in vitroで膜チャネルおよびトランスポーターを研究するために開発されました。 26または黒色脂質膜27 - LUVをに精製された膜タンパク質の再構成は、はるかにGUVs 23で同等のアプローチよりも確立されています。二重層の形成は自己集合プロセスを介して行われている場合、それらは直接チップ表面に適用することができます。ナノ多孔性チップ（ 図 1）のガラスボトム設計により、システムの簡単な自動化を可能にする空気顕微鏡を可能にします。電動ステージとの組み合わせで複数のチップを、分析のために密封された空洞の数千人を含むビューの各フィールドで、同時に測定することができます。
図 1。多重化されたナノ細孔のバイオチップの設計 A）は、シリコン・オン・インシュレータ（SOI）ウエハを反応性イオンエッチングにより構成されています。約1150個々のチップは、同一の特性と品質。B）各チップは、ナノ開口を備え25万個々のマイクロキャビティを備えるとともに、各ウェハから製造されます。スケールバー：200μmのC）各キャビティは、マルチスペクトル蛍光読み出しを経由してアドレス可能です。 intransparent上層倒立蛍光顕微鏡とバイオチップの互換性行うブロックバッファリザーバからの蛍光シグナルを、D）原子間力顕微鏡（AFM）イメージングが均一に配置された孔の開口部および3.6ナノメートルの二酸化ケイ素層の表面粗さを（明らかに、N = 40）小胞の融合のために最適。スケールバー：5μmのE）走査型電子マイクroscopy（SEM）画像は、シリコンチップ内のフェムトリットルの空洞へのアクセスを可能にするナノ細孔の断面を示しています。この数字は21から許可を得て再利用した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
すべてのデータ分析は、エンドユーザのための無制限のアクセスを保証するためにフリーウェアを使用して実行されます。時系列は、フリーの画像処理ソフトウェアとバッチ処理と曲線の複数の蛍光チャネルおよび何千も大きなデータセットの単純な相関関係を可能にするカスタムビルド曲線分析ソフトウェアを用いて分析します。
このプロトコルで使用されるモデルタンパク質は、E由来大コンダクタンス（MSCL）チャネルタンパク質の機械受容チャネルであります大腸菌 。それは、本質的に浸透圧ショックを放出する弁として機能するが、合理的にSYNT設計ように変更されましたhetic機能は、共有チャネルの収縮側に取り付けることができます。共有結合した活性化剤（MTSET）の電荷反発を経由してチャンネルがナノバルブを作成、開くようにトリガされます。イオン、水、小さなタンパク質だけでなく、小型の蛍光団のような小分子は、チャネルを介して透過することができます。ここでは、タンパク質は、タンパク質媒介転座を検出するシステムの能力を実証するためのモデルとして使用されます。
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Protocol
大型単層小胞（LUVを）の調製
- ほこりの粒子を除去するために窒素ガスで丸底フラスコ（10ミリリットルボリューム）清掃してください。エタノールで丸底フラスコをすすぎます。
注：残留エタノールを許容することができ、その後の工程に支障をきたしません。 - 任意の汚染を除去するために、クロロホルムで1ミリリットルガラスシリンジの4倍を洗ってください。丸底フラスコにを4ml SoyPC20（クロロホルム中25 mg / mlで）を加え、0.1モル％の最終濃度まで追加のドープATTO 390と脂質溶液をドープします。
注：代わりDOPE ATTO 390、他のフルオロフォアで標識された脂質または親油性染料も使用することができ、利用可能な励起源に応じ。 - ロータリーエバポレーターに丸底フラスコを接続します。フラスコのガラス壁上に均一な脂質フィルムを形成するために、300ミリバール、30℃の水浴温度および最大回転速度で40分間、脂質薄膜を乾燥させます。
- TRANSFER室温でさらに30分間、高真空ポンプ及び乾燥脂質フィルムにフラスコ。
- そしてフラスコに8ガラスビーズ（2.7 mmの直径、エタノール洗浄し、乾燥させた）; 5ミリリットルバッファー（滅菌濾過した20 mMトリス、150mMのNaCl、pH8.0）に追加します。ロータリーエバポレーターにフラスコを接続し、最大速度で50℃の真空ずに回転させます。
注：ガラスビーズは、機械的に（多層）小胞の形成をもたらす、ガラス壁に脂質膜を変位。 45分間の回転後、溶液は乳白色表示され、残留脂質フィルムは、フラスコの壁で見えてはいけません。代わりにガラスビーズのフラスコまたは穏やかな再水和法をボルテックスし、水浴ソニファイアーフラスコを超音波処理のような他の方法も適用可能です。 - 室温で4分間、超音波浴超音波処理に不活性ガス（アルゴン）下でフラスコを転送します。
注：超音波衝撃波はそれらを単層作り、リポソームを崩壊させます。 - LUVソリューションを分割します1ミリリットルのアリコートに。
- 液体窒素中でLUV溶液を凍結することにより5回の凍結/融解サイクルを実行し、水浴中40℃で解凍しました。
注：これは、破壊につながり、互いに個別のリポソームの自発的な再配置、サイズの増加につながります。 - -80℃での最後の凍結ステップストアですべてのサンプル。
注：LUVを、少なくとも6ヶ月間安定です。
2.タンパク質の再構築
- 氷上で1ミリリットルのLUVアリコートを解凍します。直接再構成する前に、ミニ押出機を用いて400nmのポリカーボネートフィルター膜を通してリポソーム17Xを押し出します。
注：脂質凝集体が除去され、最終の均一なサイズ分布が達成されます。 - 0.25％（v / v）の最終濃度（v / v）の4％のTriton X-100の添加によりたLUVを不安定化し、50℃で5分間インキュベートします。
注：このステップで使用されるリポソームの量は、精製のMsCl Gの質量に依存します<SUP> 22 Cは （ステップ2.3参照）を使用します。 28に詳細に記載されるように（ 大腸菌由来）のMsCl G 22 Cを精製します 。 - 1時20分（w / w）の割合で精製したMSCL G 22 Cと洗剤飽和リポソームを混合し、50℃でさらに30分間インキュベートします。
- 中のリポソームを不安定化するために使用さμlの洗剤当たり16ミリグラム（湿重量）バイオビーズを用いて、タンパク質/リポソーム溶液に、界面活性剤除去のためのトリス緩衝液（滅菌が濾過さ20mMトリス、150mMのNaCl、pH8.0）にバイオビーズを追加ステップ2.2。
- 回転板上で4℃で一晩界面活性剤の除去（16時間）を行います。
注：液の一定の混合は、最適な界面活性剤の除去を確実にします。 - 4℃での界面活性剤除去ストアのプロテオ後と同じ日に実験に使用します。
3.活性アッセイ
- タンパク質の再構成時にはdetergent-の100μlのアリコートを取りますステップ2.3を終えた後の不安定化プロテオリポソーム液。
- タンパク質 - リポソーム溶液にカルセインの1容積（30 mm）を追加し、50℃でさらに5分間インキュベートします。
- 2.6 - ステップ2.4で説明したように、溶液から界面活性剤を除去。
- 界面活性剤を除去した後、トリス緩衝液（ベッド容積3x）でサイズ排除カラム（20 mlのベッドボリューム以上）平衡化。
注：プロテオリポソームの分離は、しかし、分別した後、最高のタンパク質の活性を確保することをお勧めし4°Cで一定のサンプルを保持しながら、室温で行うことができます。 - サイズ排除カラムに全体の一部（200μl）を適用することにより、自由カルセインから独立したプロテオリポソーム。混合物は重力流を使用して上に連続バッファアプリケーションを介してカラムからプロテオリポソームの溶出に続いて、カラムに浸透することを可能にします。溶出前にある離散的なオレンジ色のバンドとしてプロテオリポソームを含むカルセインを観察します。 500＆＃の画分を収集181;それぞれリットル。
注意：無料カルセイン色素が完全な分離とプロテオリポソーム画分後に溶出します。 - ピペットのためのマイクロウェルプレート上に各画分の80μlの蛍光アウトを読んで、蛍光発光を経由してカルセイン含むプロテオリポソームの最高額を含む画分を識別します。 490 nmでの励起と520 nmで蛍光を検出します。以下の活性アッセイのための最高のシグナルでプロテオリポソーム画分を使用してください。
- 1ミリリットルの蛍光キュベット中で980μlのトリス緩衝液でプロテオリポソーム含有画分を20μlを混ぜます。
- 分光蛍光光度計を用いて520 nmの（励起490 nm）における蛍光発光を測定します。 1分間記録し、その後、原液（160 mM）のからMTSET25μlの（[2-（トリメチルアンモニウム）エチル] methanethiosulfonate）を加えてよく混ぜます。混合中の記録に保管してください。必ず直接使用前に新鮮なストック溶液を準備します。
注意：一度バッファMTSET加水分解しで解決30分以内に、Sと非反応性であろう。 MTSETを秤量し、使用するまで-20℃で乾燥粉末としてのアリコートを維持することができます。
注：一度MSCL G 22 Cチャンネルは、蛍光発光の増加をもたらす、プロテオリポソームと染料のその後の脱消光を流出する際にカルセインの局所濃度の減少につながる、閉じ込められたカルセインを開き、リリース活性化しました。 - 蛍光発光は、再び安定したプラトーに到達した後、50μlのトリトンX-100（4％v / v）を添加することによりリポソームを可溶化します。
注：理想的にはそれ以上の蛍光の増加が観察されないことができ、すべてのリポソームに活性なタンパク質を意味します。
ナノ粒子の追跡を使用したLUVの4サイズ分布測定
- リポソームまたはプロテオリポソーム溶液を最小限のサンプルは、ナノ粒子のトラッカーを使用して、サイズ分布分析のために必要であることに注意してください。 5ミリグラム/メートルのリポソーム溶液を希釈Lの脂質濃度1：5,000（v / v）の緩衝液（20mMのTris、150mMのNaCl、pH8.0の;滅菌濾過）、1 mlの最終容積に分析しました。サイズ分布測定を乱す塵のような懸濁粒子を除去するために、0.2μmの膜を用いて希釈し、前LUVの準備および再構成するために使用されるすべてのバッファをフィルタリングします。
- 超純水で流れ室を洗ってください。
- 光ビームに集中する表面マーカーを使用してください。希釈されたリポソーム試料の約300μLを注入し、すぐに気泡を導入することなく、フローチャンバ内の流れを停止するために、出口弁を閉じます。
- 検出用試料の十分な散乱信号を確実にするために、焦点とカメラのシャッター/ゲイン設定を調整します。
注：20から80までの信号が視野ではっきりと見えるはずです。ソフトウェアが重複するときに個々の信号を追跡することができなくなりますように過密状態（> 80信号）を防ぎます。 - 「キャプチャー」SCRに行きますEEN。 25℃に温度制御およびソフトウェアのコントロールを使用して90秒にキャプチャ持続時間を調整します。時系列の記録を開始するために押して「記録」。
注意：新しいウィンドウが開き、時系列が完了します。 - 指定された形式で時系列を保存します（* .AVI）。バッチ分析中に実用的な理由から単一のフォルダ内のすべてのファイルを保存します。
- 出口バルブを開き、フローチャンバ内に別の300μlを注入。バルブを閉じて、リピートは4.3手順 - 二回4.6。
- 完了後、すべてのサンプルのランを5mlの超純水を用いてフローチャンバーを洗浄します。 「プリプロセス」画面に移動します。このプロトコルで使用されるトリス緩衝液のためのキャリブレーション・パラメータ温度= 25℃、粘度= 0.91を設定します。
- バッチ処理ウィンドウを開き、記録された時系列（アドバンスト/バッチプロセス/設定ファイル1-3）をロードします。プレスサイズ分布分析を開始するには「GO」。
注：分析ソフトウェアの電話交換的には、単一粒子を追跡し、ステップ4.8で設定したパラメータを用いて、それらの移動行動に基づいてそれらの直径を計算します。
注：結果のサイズ分布の分析は、時系列ファイルと同じフォルダに自動的に保存されます。 - さらに、（エクスポート/レポートPDFの作成）の結果を要約するレポートファイルを作成します。
5.チップホルダーの準備
- MDX4医療グレードのエラストマーベース、50mlの反応チューブに硬化剤0.1グラムMDX4を1.0g秤量します。ガラス棒で十分に両方をブレンド。
- 脱ガス接着剤に1時間デシケーターにチューブを入れてください。接着剤が硬化して動作するようにあまりにもハードになるようにその後、チップ接着のために30分以内にそれを使用。
- エラストマー脱ガス（ステップ5.1）の間、チップボンディングの前に任意の汚染物質を除去するためにクロロホルムで徹底的に客観スライドガラスを清掃してください。ガラスシリンジを使用して、クロロホルム5mlでスライドを洗浄します。集めます下に位置し、ビーカー内のクロロホルム。洗浄後、スライドを乾燥させて。
注：ヒュームフードの下で、この手順を実行します。クロロホルムの代わりに、アセトンのような他の有機溶媒を使用することもできます。 - （10μlのピペット用結晶のヒント）ピペットチップを使用したカバーガラス上に接着接合材料の少量を堆積させます。チップは後に8チャンバースライドホルダーに適合しなければならないし、それに応じてスライド上に配置する必要があることに注意してください。
- 慎重に先端の細いピンセットを用いてウエハ基板から一度に一つのチップを取り外し、カバーガラス上の接着剤の降下にチップを付着させます。チップのコーティング面が上向きに直面していることを確認してください。
- 静かに鈍いPEピンセットの背面とカバーガラスの上にチップを押してください。接着剤は、チップの下に均等に分配されることを保証するために、慎重に前後にチップをスライドさせます。重要なステップ：それは光学イメージングを乱すように、空気の泡がチップの下に閉じ込められていないことを確認します後で上のチップキャビティの。また、全く接着材がチップ表面を汚染しないことを確認してください。
- キャビネット乾燥機中で65℃で2時間、完成したカバーガラスを乾燥します。
注意：チップはまだ除去される必要があるそれらの製造に由来する保護層で被覆されます。 - 保護層を除去するために、シーケンシャル溶剤洗浄工程を行います。チップの硬化中に、54℃の水浴を予熱。
- 水浴、イソプロパノール及びアセトンを充填した1つで満たされ、それらの2に3ガラスビーカーを置きます。
- スライドホルダーにチップカバーガラスを挿入し、10分間の最初のイソプロパノール満たされた皿にそれを沈めます。その後、アセトン満たされた皿にそれを転送する第二イソプロパノール皿に最後の洗浄工程のためにそれを転送する前に、再び10分間インキュベートし、さらに10分間インキュベートします。
- 皿からスライドホルダーを外し、慎重にultrapurで広範囲にそれを洗います窒素ガスの穏やかな気流でチップを乾燥させ、E水、。
- 8ウェルスティッキースライドからラミネートシートを-脱いでベンチに後方に置きます。慎重にカバースライドをピックアップし、優しく井戸に面したチップを搭載した粘着性のスライド上に押してください。使用前に数分間、完成したチップホルダーの残りをしましょう。
6.アッセイの準備
注：ナノ細孔チップカバーガラスに接着し、8ウェルスティッキースライドで区切って、複数のチップがチップが完全に分離されて、単一の実験で対処することができ、利益を有しています。
- チップホルダーの準備の後、純粋なエタノールで各チップを洗浄し、塵のような汚染物質を除去するために、窒素ガスでブロー乾燥。
- 空気、酸素または窒素プラズマでチップ表面を清掃してください。プラズマ洗浄の時間期間のタイプに依存して変化：1分間酸素プラズマ処理を行い、空気およびNIT80％の出力設定（RFパワー媒体または高い）で0.3ミリバールで5分間ローゲンプラズマ。
- プラズマ洗浄した後、キャビティの濡れ性を確保するために10〜15分間純エタノールでチップをインキュベートします。
- トリス緩衝液400μlの添加することにより、バッファのための段階的な交換エタノール（20 mMトリス、150mMのNaCl、pH8.0のは、滅菌濾過）、気泡や400μlとその後の除去を導入することなく溶液を混合しました。エタノールの除去を確実にするために、この手順を12回繰り返します。
注：エタノールは、リポソーム懸濁脂質二重層のために有害であろう。 - 5 mMのCaCl 2を1μMOy647染料と、ドープトリス緩衝液（滅菌が濾過さ20mMトリス、150mMのNaCl、pH8.0）に。完全にチップからの洗浄緩衝液を除去し、直ちにチップにドープされたバッファを追加します。注意：チップは空洞の一定湿潤およびチップ表面を確保し、空気と直接接触しないので、チップは、洗浄緩衝液を除去した後、薄いバッファ膜で覆われます。
- トリス緩衝液中1mg / mlのLUVをまたはプロテオLUVを追加（20 mMトリス、150mMのNaCl、pH8.0の、滅菌濾過したもの）を各ウェルに。
注：各ウェルの最終容量は300μlです。ドープしたトリス緩衝液の添加時の制御染料と化学修飾剤MTSETのその後の追加を検討してください。 - チップ表面の気孔スパニング脂質二重層の形成のためにリポソーム溶液を用いて室温で1時間、チップをインキュベートします。その後の Ca 2+を含まないトリス緩衝液の4倍の400μlの各チップを洗います。
- 5μMの最終濃度で、各ウェルに制御染料を追加します。チップは現在、転座アッセイの準備ができています。
7.アッセイのセットアップ
- 落射蛍光顕微鏡（20Xエア目的、長作動距離）にチップホルダーをマウントします。より簡単にマイクロキャビティの焦点面を見つけるために、ナノ細孔チップの縁に焦点を当てています。空洞が焦点になったら番目の領域のためのナノポア・アレイをスキャンディスプレイで最も高い比率を封止します。
注：すべての倒立落射蛍光顕微鏡は、チップアッセイを実施するために使用することができます。対物倍率（20X - 60X）によってアッセイされた空洞の数は20倍の倍率を使用して、1つの視野で最大9,000空洞で、異なります。長作動距離と空気の目標が好ましいです。倒立共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を使用することも可能であるが、画像取得起因焦点の制限された深さに制限要因であるかもしれません。 - チップ照明を最適化します。
注：変更を観察することができないように、両方の色素チャネルは最大のグレースケール値を超えていないことを確認。輸出実験のために最大の信号容量の90％に転染料の照明を調整します。明らかに任意の漏出性の膜シールを検出するために、最大信号容量80〜90％までオープンキャビティ内の制御染料を調整します。 - 一度全てのチャンネルは、時系列を開始して調整されます。画像を取るごとに10-20 SE90分間℃。
注：これは、同様に特定し、非特異的流出のイベントに従うことが適切です。 - システイン固有の添加によって蛍光基質の流出を初期化し、積極的に3 mMの最終濃度に複合MTSET荷電。後に開口部をチャンネルにベースライン前に安定した蛍光シグナルを確立することができるようにMTSET添加前実験ランタイムの少なくとも5分を許可します。必ず使用前に新鮮な直接MTSET溶液を調製。
8.データ解析
- ImageJの標準バージョン（ファイル/インポート/イメージシーケンス）で時系列画像スタックを開きます。
- 蛍光チャネルが積層されている場合は、各チャネル（画像への画像/スタック/スタック）のために個々のスタック内のチャンネルを分割します。
- ROI（関心領域）の識別（イメージ/複製）のための転基板チャネルの最初のイメージを複製します。
- バイナリイメージ（画像/調整/しきい値）に画像を変換します。確保使用されるアルゴリズムはピクシレーションを重複することなく、すべての密封された空洞のための信号を示しています。
- 自動的に粒子アナライザーツール（粒子を分析/分析）で関心領域を定義します。粒子ノイズを回避するために、定義された最小粒径を規定します。 「エッジの除外」オプションをチェックし、「穴が含まれます」。結果としてのROIは、マイクロキャビティアレイパターンを反映していることを確認してください。介在するのROIは、したがって、それらを削除し、成果物です。 ROIのリストを保存します。
注：測定パラメータは、（/セット測定/エリアの分析）粒子解析の前に「エリア」に設定する必要があります - 時系列分析プラグイン（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html）、同じサイズに自動的にすべてのROIのサイズを変更開きます。再サイズ6×6ピクセルと楕円形（タイマシリーズアナライザ/ AutoROIProperties）の幅/高さにすべての既存のROI。 「既存のROISのサイズを変更する」オプションをチェックしてください。得られたリサイズROIのリストを保存します。
- ROIマネージャを開きます。（/ツール/ ROIマネージャーの分析）し、時系列（ROIマネージャ/詳細/オープン）の各チャネルのリサイズROIリストをロードします。 ROIが重畳されます。 「すべてのスライスを測定」と「スライス当たり1行」と開始マルチメジャーを選択し、マルチ計測]ツール（ROIマネージャ/詳細/マルチメジャー）を起動し、各ROIのための信号の変化を分析するために。
注：測定パラメータは、（/ /セット測定分析グレイ平均値）この手順は、「グレイ平均値」に設定されなければなりません - * .txtファイルまたは* .xls形式で各ROIの平均グレー値を与え、結果のテーブルを保存します。
- 「インポートファイル」オプションを使用してNanoCalcFXに各撮像チャンネルのROI分析をインポートします。 」シリーズを命名するための最初の行を使用する」に設定します。時系列画像取得期間に応じて画像間のステップサイズを設定し、対応する列と小数点記号を選択します。
- 自動的に個々のfluoのグラフを相関させるために「複数のシート」オプションを使用しますrescentチャンネル。
注：イベントは、現在分析し、3色スペクトル情報によって与えられた情報を用いて分類することができます。 - ビルドでフィット関数（フィットオプション）を使用して、選択したカーブにフィット。
注：すべての単一指数拡散駆動イベントとフィット感の境界を設定することができるために実装流出と流入式が適しています。得られた速度定数は、ヒストグラムツールを使用してプロットまたはさらなるデータ改善のためにエクスポートすることができます。
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Representative Results
ポア貫通膜は容易に自己集合したようにナノ構造チップ表面上に作成することができます。しかし、根本的なプロセスはまだ繊細でリポソームのサイズ、リポソーム集団の単分散性、ラメラ、脂質や塩分濃度と化学的表面特性のような多くのパラメータの影響を受けています。これらのパラメータのほとんどは、慎重に特徴付けられ、上記のプロトコルで標準化されています。他のパラメータは、しかし、成功した実験を確実にするために、すべての新規作成時にチェックする必要があります。これらは、リポソームのサイズ分布及び集団の分散度（ 図 2 A）です。最適な細孔膜貫通形成のために、よく細孔径上記キャビティ空間リポソームサイズにリポソーム侵入を避けるためには必需品です。また、単分散のリポソーム製剤は、膜拡散及びFUSIで最良の結果をもたらすことが示されていますに。すべての準備のためにチェックしなければならないもう一つの重要なステップは、再構成後のタンパク質活性です。 MSCL G 22 Cで再構成したリポソームのための蛍光脱消光アッセイを使用して、チャネルの開口がアクティブのMsCl G 22 Cタンパク質 （ 図 2 B）を保有するリポソームの比率を与え、蛍光分光法を介してモニターすることができます。
いったんチップ表面に広がり、リガンド活性化の際にMSCL G 22 Cによる蛍光対象の溶質転座は、（ 図 3 B）を追跡することができます。工学MSCL G 22 Cチャンネルは、キャビティ空間の中に小さな蛍光分子を捕捉する、デフォルトの状態で閉じられています。化学モジュレーターMTSETの添加により正の電荷は、狭窄領域に導入されMSCL G 22 C細孔 、静電反発を介してそれを押し退け。事前捕捉されたフルオロフォアは、拡散平衡を達成するためのキャビティ空間を忌避します。キャビティ空間内の蛍光のその後の減少をモニターすることができます。このプロセスは、流出イベント（ 図 3 C）の均一な集団を生じる、高度に再現可能です。得られた流出曲線は、シングルおよびマルチチャンネル転座イベント（ 図 3 D）とを区別するためのアッセイの能力を実証し、二つの異なる集団でクラスタ化します。さらに、システムは、それが可能な高コンテンツの上映を記録し、正、偽陽性と陰性の結果との間で正確かつ客観的に区別すること、並行して、リアルタイムで3分光よく分離染料にフォローアップすることができます。本研究では9.046密封された空洞は、8％がefflを表示するの、分析しましたUXの振る舞い。異なる蛍光読み出しチャネルの展開、イベントが単一指数流出イベント、複雑な動力学、脂質の侵入および膜破裂（ 図 3 E）に判別することができます。制御溶質と膜色素のための安定した信号を表示イベントのみが最終的な分析のために考慮されています。複雑な動態は、非定常制御信号に流出イベントを表し、従って、省略されています。脂質侵入および膜破裂は、本質的に細孔スパニング脂質二重層システムを使用して発生したアーティファクトイベントです。 （ 図 4）上述したように、それらは制御色素信号を使用して廃棄することができます。
プロテオリポソームとMSCL機能の 図 2. サイズ分布 。A）小胞はアナライザーましたナノ粒子追跡分析によって編。 LUVサンプルは（黒のトレース）の前とMSCL G 22 C（赤トレース）の再構成後に調べました。 LUVの調製後、214±70nmの平均粒径が達成されます。サイズは、サイズが158±60nmのプロテオリポソームで、その結果、再構成中に減少される。B）MSCL活動が流出アッセイにより再構成した後に検証された。28自己急冷カルセインがMSCLチャネルのMTSET媒介開口部を通ってプロテオから解放され、フルオロフォア（赤）の脱消光及び蛍光強度の急激な増加につながります。タンパク質を含まないリポソームは、そのような流出、繰り返してもMTSET加算（黒）を示しません。リポソームリリースの後続の洗剤導入可溶化（TX-100）すべての以前にカプセル化された染料。この数字は21から許可を得て再利用しました。ら= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3。単一分子レベルでのMSCLによりリガンド依存性溶質転 。A）エンジニアMSCL G 22 Cチャンネルは、デフォルト状態で閉じられています。このような蛍光団のような小さな溶質は、チャンネルや脂質二重層を通してどちらを渡すことができません。 MTSET、各MSCL G 22 Cプロトマーの操作された単一のシステインを添加すると五量体チャネル複合体のくびれ側の複数の正電荷を導入し、変更されます。 MSCL G 22 Cチャンネルは電荷反発によって押し開かれ、捕捉された色素は、蛍光強度の減少をもたらす、空洞の外に拡散することができる。B）のチタンMTSETを添加した際MSCL G 22 Cの開口部の私の痕跡。機能的に再構成されたMSCL G 22 Cを含むプロテオは、チップ表面上に広げました。 Oy647（赤）は、転基板としての空洞の内部に封入されました。 OregonGreenデキストラン（70 kDaの、緑）が実験中にトランスポートイベントの基質特異性だけでなく、膜の完全性を監視するために、チャネル不透過性の制御基板として加えました。空洞内部の脂質汚染を確認するために、LUVをはDOPE ATTO 390（紫0.1モル％）を補充しました。 MTSETの追加（3 mMの最終）tで= 0秒蛍光読み出しを経由して記録された空洞、。C）ランダムに選んだMSCL G 22 Cの流出曲線の典型的な流出のイベントを示しています。D）レートからOy647流出につながる、チャネルを開き2つのガウス人口への転座イベント（N = 242）は、クラスタの定数三色のリアルタイム読み出しによって9046密封チップキャビティのS、シングルおよびマルチチャネルトランスポート・イベントを識別することができることを実証する。E）高含有量スクリーニングおよび統計分析。すべての分析チップキャビティの8％は、指数流出イベントを表示します。 （：;：制御溶質;紫：緑転座溶質赤脂質）によるスペクトル復号化、流出イベント、複雑な動力学、脂質の侵入、および膜破裂、従って偽陽性を排除し、識別することができました。この数字は21から許可を得て再利用した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 4。イベントクラスは、三色検出によって区別します 。トランスロケーション溶質（赤）、制御L溶質（緑）、脂質色素（紫）は、スペクトル公平なデータ選択を可能に判別することができない膜タンパク質を保有しない。A）密閉キャビティ（図3A参照）を記録MSCLチャネルについて記載した実験条件の下では、フラックスイベントを表示しません。蛍光読み出しはすべてのチャンネルで安定している。B）に懸濁脂質二重層は、ナノ細孔の亀裂にまたがる不連続な脂質二重層内の空洞。C）破水結果を侵入することができます病気に定義されました。これにより、キャビティ空間は、もはやバッファ室から分離されていません。封入された色素（赤）は濃度勾配下に空洞を逃れます。膜を横切って通過する以前にできない制御溶質（緑）は、脂質の侵入イベントの空洞。D）の例に入ります。脂質色素（紫）のための蛍光シグナルがキャビティ空間に侵入膜に起因して増加しているが、転座の溶質がpusheです蛍光シグナルの減少につながるキャビティ（赤）のうち、D、。ナノポアは、制御基板（緑）の通過を防止する、脂質二重層によって遮断される。E）膜破断時の制御溶質（緑）で拡散しながら、同封の輸送溶質が急速に、キャビティ（赤）から逃れます。この数字は21から許可を得て再利用した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介する手法は、膜タンパク質輸送の高度な並列分析を可能にします。再構成された膜タンパク質系は、直接、理論的にすべての膜輸送体またはチャネル可能の適応を行う、バイオチップに適用することができます。輸送解析は、唯一の直接蛍光変化（蛍光体の転座または蛍光標識された基質）または間接的な蛍光変化（pH感受性色素、二次酵素反応）のいずれかを介して、蛍光読み出しシステムの確立によって制限されます。後者は、しかし、まだ確立されなければなりません。
単一のタンパク質レベルでの膜チャネルまたはトランスポーターの機能解析は、この技術の主な焦点です。自動顕微鏡と組み合わせて、タンパク質エフェクターのスクリーニングアプリケーションの設置も可能です。アッセイのセットアップは、各チップ上に複数のアッセイポイントで、最大8チップの並列記録を可能にします。条件が確立された後ため、チップの完全な分離のために、それは、単一の実験内のコントロールを含む複数の実験の繰り返しを可能にする、真に平行です。
実験のセットアップ時に重要なステップは、チップ表面上のプロテオリポソームの効率およびアッセイにおいて使用される基板に向かって懸濁脂質二重層の保持能力を広げ、真に単層小胞の調製、選択されたタンパク質の活性の再構成です。
単層小胞の調製は、懸濁脂質二重層の形成の間、チップ表面上の多層膜シートの確立を避けるために、このアッセイのために基本的に重要であるが、調製時にリポソームの超音波処理を介して、小胞のunilamellarityを確実にするためにかなり容易です。
プロテオリポソームの直接的なアプリケーションは、メソッドpresenteの大きな進歩ですD。従来のアプローチとは対照的に、より複雑で、医学的に関連するタンパク質は、今や当然たLUVにおいて選択される機能性タンパク質を生じる再構成プロトコルの事前の確立を必要とする、標的とすることができます。さらに、大型膜外ドメインを有する膜タンパク質は、適切なのSSMの形成を減少させます。これは、のCaCl 2濃度を変化させることによって、例えば、それぞれの新たなタンパク質のために最適化されなければなりません。
関心対象のタンパク質の再構成比を慎重に選択しなければなりません。単一タンパク質事象の分析は、ここに提示技術を用いて所望と達成可能れます。再構成されたタンパク質の量は、したがって、理想的な再構成を想定した細孔膜貫通パッチごと、および膜タンパク質は、確率的に二層に分散されている1-2機能性タンパク質単位を超えてはなりません。それは、nを持っているように加え、再構成後のタンパク質の方向性も、心に留めておくべきですOTは、両方の方向性との間に等しくなるようにします。
最後に、一度、すべてのこれらの問題は慎重にチェックし、最適化され、使用される基板のいずれも、細孔膜貫通の任意の非特異的膜透過性を示さないことがあります。赤のスペクトル領域における最もローダミン系色素などの正に帯電したフルオロフォアは、すぐに膜障壁を克服する傾向があります。強い疎水性相互作用は、脂質二重層への非特異的結合を導くことができます。両方のプロパティが望まれていません。
定性的な方法でイオンチャネルの研究でも想像です。はいバイナリを使用して、チャネルエフェクターのスクリーニング/いいえ読み出しがイオン感受性色素を使用して考えることができませんでした。ここでの最大の障害は、少なくとも部分的にイオン保持脂質二重層の確立であろう。これは、ナノ細孔チップの表面修飾を介して達成可能であるかもしれません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate |
Toronto Research Chemicals Inc. | T792900 | MTSET; hydrolized by water. Keep as dry pouder aliquot at -80 °C. Use immediately (30 minutes) after solubilization in buffer. |
| 1 ml gas-tight syringe | Hamilton | #1001 | |
| 10 ml round flask | Schott Duran | ||
| 2.7 mm glas beads | Roth | N032.1 | |
| 2-Propanole | Roth | 9866.5 | |
| 30 cm Luer-Lock Extension Tube | Sarstedt | 744304 | |
| Acetone | Roth | 5025.5 | |
| Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | need to be activated before first use |
| CaCl2 Dihydrat | Roth | HN04.3 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | store dark at -20 °C |
| Chloroform reagent grade | VWR Chemicals | 22711324 | |
| DOPEATTO390 | ATTO-TEC | AD 390-165 | store dark at -20 °C |
| Ethanol absolute | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Injekt Single-use syringe | Braun | 460 60 51V | |
| Injekt-F single-use syringe | Braun | 91 66 017V | |
| Keck clips | Schott | KC29 | |
| L-α-Phosphatidylcholine, 20% (Soy) | Avanti Polar Lipids | 5416016 | store under inert gas at -20 °C |
| NaCl 99.5% p.a. | Roth | 3957.2 | |
| Nanopore E100 wafer/chips | Micromotive (Mainz/Germany) | available on request | |
| Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 µm | Whatman | 800282 | |
| Oregon Green Dextran 488 (70 kDa) | life Technologies | D-7173 | store dark at -20 °C |
| Oy647 | Luminartis (Münster/Germany) | OY-647-T-1mg | store dark at -20 °C |
| Rotilabo-syringe filtration, unsterile, pore-size 0.22 µm | Roth | P 818.1 | |
| Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | G5080 | column material for size exclusion chromatography |
| Silastic MDX4-4210 | Dow Corning | curing agent for chip fixation onto cover glass support | |
| sticky-Slide 8-well | ibidi | 80828 | multi-well chamber for the mounting onto glass slides (chip holder) |
| Three-way stopcock blue | Sarstedt | 744410001 | |
| Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality | Roth | 5429.2 | |
| Triton-X 100 | Roth | 6683.1 | |
| Whatman 0.2 µm cellulose nitrate membrane filter | Roth | NH69.1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Büchi 461 water bath | Büchi | ||
| Büchi Rotavapor RE 111 | Büchi | ||
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrophtometer | Varian | ||
| LiposoFast Mini Extruder | Avestin | ||
| Membrane pump | Vaccubrand | 15430 | |
| Nanosight Nanoparticle Tracking Microscope | Malvern / Nanosight | LM 14C | |
| NyONE microscope | Synentec | available on request | |
| Pump control | Vaccubrand | CVC 2II | |
| Sonicator bath Sonorex RK100H | Brandelin electronic | 31200001107477 | |
| Vaccum pump RC5 | Vaccubrand | 1805400204 | |
| Water bath W13 | Haake | 002-9910 | |
| Plasma Cleaner PDC-37G | Harrick Plasma | PDC-37G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageJ | Open Source | http://imagej.nih.gov/ij/ | scientific image processing software |
| NanoCalcFX | Freeware | http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ | data analysis/evaluation software for massive transport kinetic datasets |
| NTA 2.3 Analytical Software | Nanosight | data acquisition and analysis software for nanoparticle tracking microscope | |
| NTA 2.3 Temperature Comms | Nanosight | temperature controle software for nanoparticle tracking microscope |
References
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