Summary
Det automatiserade spårningssystem Flywalk används för högupplösta kvantifiering av lukt guidad beteende Drosophila melanogaster.
Abstract
I sin naturliga miljö, insekter såsom vinäger flugan Drosophila melanogaster bombarderas med en stor mängd kemiskt distinkta doftämnen. För att komplicera saken ytterligare, de lukter detekteras av insekten nervsystemet är oftast inte enskilda föreningar utan blandningar vars sammansättning och koncentrationsförhållanden varierar. Detta leder till en nästan oändlig mängd olika doft stimuli som måste utvärderas av nervsystemet.
För att förstå vilka aspekter av en lukt stimulans bestämma sin utvärdering av i farten, är det därför önskvärt att på ett effektivt sätt undersöka lukt guidad beteende mot många doftämnen och luktblandningar. För att direkt korrelera beteende till nervaktivitet, bör beteende kvantifieras i en jämförbar tidsram och under identiska stimulans villkor som i neurofysiologiska experiment. Men många som för närvarande används lukt bioanalyser i Drosophila neuroetologi är ganska specielseras antingen mot effektivitet eller mot upplösning.
Flywalk, ett automatiserat system lukt leverans och spårning, överbryggar klyftan mellan effektivitet och upplösning. Det gör det möjligt att bestämma exakt när en lukt paket stimulerade ett fritt gående fluga, och för att bestämma djurets dynamiska beteende reaktion.
Introduction
Det övergripande målet för all neuroetologisk forskning är att fastställa ett orsakssamband mellan verksamhetstillstånd enskilda nervceller eller neuronala kretsar och beteendet hos en organism. För att uppnå detta mål neuronal aktivitet och beteende bör övervakas under identiska stimulans betingelser och dessa stimulans villkor bör helst vara liknande dem nervsystemet under luppen utvecklats för att förstå. Särskilt när det gäller beteende bioanalyser, har dessa krav historiskt visat sig vara ganska krävande i Drosophila melanogaster lukt neuroetologi.
När frigörs från källan, lukt plymer snabbt bryta upp i tunna trådar med turbulent spridning som orsakas av luftrörelser är den viktigaste faktorn för lukt fördelning 1. Som ett resultat, en insekt navigera mot en luktkälla upplever intermittent stimulering med luktpaket varvas med varierande intervaller ren luft. Bådepromenader och flygande insekter - inklusive Drosophila - har visat sig utnyttja detta intermittent stimulering system för navigering genom böljande upwind på plume möte och huvudsakligen rörliga kors vind i frånvaro av lukt 2 - 5. Medan stimuleringsförfaranden i fysiologiska experiment i stor utsträckning efterlikna de en insekt kan uppleva i sin naturliga miljö genom att antingen ger enskilda puffar av lukt varvas med längre perioder av ren luft eller dynamiska stimuleringssekvenser 6 - 11, många beteende bioanalyser som används i Drosophila neuroetologi såsom fälla analys , frilands arenor eller T-labyrinten lita på lukt-gradienter 12 - 15. Men eftersom lukt gradienter per definition är variabel i koncentration beroende på avståndet från luktkällan, ett visst beteende kan inte tillskrivas en exakt lukt koncentration med hjälp av dessa paradigm. Dessutom lutningen aven lukt lutning beror kritiskt på fysikalisk-kemiska egenskaperna hos luktämnen. En gradient av en mycket flyktig förening kommer att vara grundare än den som skapas av en mindre flyktig förening och därför också svårare att spåra för en organism förlitar sig på mätning av koncentrationsskillnader i rummet som det enda medlet för navigering 16 - 20, vilket kan leda till en felaktig tolkning av lukt preferenser framför allt i valet analyser. Denna effekt är också mycket skadliga vid utredning beteende mot luktblandningar eftersom det leder till olika blandningskomponentförhållanden vid varje punkt i rymden och därför återigen utesluter ett klart samband mellan fysiologi och beteende.
Medan ättika flugor tenderar att aggregera på jäsa frukt, de är ensamma i sin navigering mot matkällor och äggläggning webbplatser. Ändå snarare än testa enskilda djur många beteende paradigm som används i Drosophila neuroethology undersöka lukt guidad beteende kohorter av flugor och attraktion gjorde den fraktion av flugor väljer lukten över en kontroll stimulans. Dessa kohort experiment har i hög grad bidragit till förståelsen av flyg neuroetologi och många av de iakttagelser som gjorts genom att använda dem kunde bekräftas i en enda fluga experiment. Det har emellertid visat sig att flugor kan påverka varandras beslut 21 och i extrema fall bedömningen av en lukt kan växla från likgiltighet till undvikande beroende på befolkningstätheten 22. Dessutom, resultat från dessa typer av experiment ger ofta bara slutpunkten av en sekvens av beteende beslut snarare än att observera vad flugan gör när den gör det, vilket skulle vara önskvärt när man försöker att korrelera beteende med nervaktivitet. Dessa ganska lågupplösta kohort experiment kontrasteras av högupplösta enda gylf metoder såsom bundna flygarenor och löpband, som tillåterför en direkt observation av beteendereaktioner vid tidpunkten för stimulus presenteras 20,23,24. Ändå kohort experiment är fortfarande populära, eftersom de är mycket effektiva och ger robusta resultat även vid jämförelsevis låg provstorlekar eftersom interindividuell och inter rättegång variabilitet delvis genomsnitt ut på grund av observationen av befolkningen över långa tidsperioder. Medan bunden flygning och löpband ger förmodligen guldmyntfoten om stimulans presentation och tidsupplösning, är arenor som används utformad för enskilda djur och det är därför tidskrävande att få urvalsstorlekar som krävs för en statistisk analys. Flera andra metoder har nyligen utvecklats som tillåter en effektiv förvärv av högupplösta beteendedata i kombination med en väl definierad stimulans regim. Dessa inkluderar oövervakad 3D-följning av flera vinäger flugor i en vindtunnel i kombination med en exakt 3D-modell av lukt plym 5 25 och Flywalk paradigm 26.
I Flywalk är 15 individuella flugor som ligger i små glasrör och kontinuerligt övervakas av en överliggande kameran i rött ljus. Lukter tillsätts till en kontinuerlig luftström av 20 cm / sek och färdas genom glasrören med en konstant hastighet. Luftströmmen fuktas genom att passera 250 ml flaskor innehållande destillerat vatten (luftfuktare) innan lukten leveranssystem. De flies' positioner redovisas i en kvadrat område av intresse (ROI) som omfattar större delen av längden av de lukt rör (men exklusive de yttre kanterna av rören (ungefär 5 mm vid varje sida) där flugorna inte kan röra sig ytterligare upp- eller medvind) runt tiden för lukt presentation (Figur 1A, B). Fly identiteter hålls konstant genom uppföljningssystemet throughout experimentet på grundval av deras Y-positioner (dvs. deras glasrörs gränser). Luktstimulering åstadkommes med användning av ett flerkomponent stimulans enhet som tillåter presentationen av upp till 8 enkel lukt och alla möjliga blandningar därav 26,29 (Figur 1B). Förloppet för ett experiment styrs av en dator som reglerar lukt avgivningssystemet och samla temperatur och fuktighet information (dator 1, Figur 1C). Denna dator styr också en datalogger (start / stopp-inspelning) på en annan dator som kontinuerligt följer flyga befattningar i 20 bilder per sekund (dator 2). Fly positioner, lukt ventilstatus (dvs. tidspunkt ventilöppning), lukt ID, temperatur och luftfuktighet runt luktstimuleringscykler inloggad dator 2. På detta sätt information om lukt och flyga positioner är synkroniserade och exporteras som CSV-filer som kan ytterligare bearbetas och analyseras med hjälp av skräddarsydda skriftlig analysrutiner. Därför atthela systemet är datorstyrt, krävs ingen mänsklig inblandning under en experimentell session.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bygg- och tekniska detaljerna i Flywalk har beskrivits på annan plats 26 (vid eventuella problem att etablera detta inrättas, ytterligare information kan erhållas från MK). Här fokuserar vi på detaljerade instruktioner om hanteringen av paradigm som kommer att hjälpa att få tillförlitliga resultat.
1. Fly Hantering
- Bakre flyger i låga till medel kulturer densitet på mat mediet 27 enligt en 12 timmar: 12 timmar ljus: mörker regimen vid 23-25 ° C och 70% relativ fuktighet. För detta ändamål tillåter 20-30 nykläckta vuxna flugor att reproducera i en stor livsmedels flaska för en vecka, sedan kasta vuxna flugor och vänta på avkomman att växa fram.
- Samla 30-40 nyligen framkommit (ålder <24 timmar) vuxna flugor och åldras dem i ny en flaska innehållande mat mediet 27 för 3-5 dagar.
- Tjugofyra timmar före starten av beteende experiment: Överför alla 30-40 tidigare insamlade 3-5 d gamla (se 2.2) flyger till en ny vial innehållande en fuktig skumgummi plugg eller en fuktig mjukpapper användning av en sug.
OBS: inte söva flugor använder CO2.
2. Beredning av Flywalk Setup
- Använd 250 ml flaskor som luftfuktare. Fyll luftfuktare med 100 ml destillerat vatten.
- Förbered luktflaskor.
- Bered 500 ^ 10 -3 utspädningar av rena lukter etylacetat, etylbutyrat, isopentyl-acetat och 2,3-butandion i lösningsmedelsmineralolja.
- Fäst två boll backventiler per luktflaska. Observera att incheckning ventiler möjliggör enkelriktad endast luftflöde. Därför ansluter backventiler på ett sådant sätt att luft kan komma in i flaskan på ett sida och lämna den på den andra sidan.
- Avlägsna locket på en 200 | j, l PCR-reaktionsröret. Pipett 100 ul av varje lukt utspädning i ett separat reaktions rör och placera rören i separata luktflaskor. Också förbereda en lukt flaska innehållande endast lösningsmedlet mineral oil.
- Tätt försegla luktflaskor genom att stänga dem med pluggar i rostfritt stål och gummipackningar.
- Anslut 5 luktflaskor (4 innehåller lukt och en innehåller mineralolja) och lukten leveranssystem. Se till att ansluta dem i rätt flödesriktningen. En felaktig anslutning kommer inte bara att äventyra den planerade experimentet, men det kan också förorena avgivningssystemet.
- Kontrollera om det finns läckor genom att täta utloppet av blandningskammaren av stimulans enheten. Se till att alla luftflöden innan stimulans enheten nu successivt sjunka till noll. Om inte, kontrollera för läckage som nu kan identifieras av väsande ljudet av luft som lämnar systemet.
- Överför försiktigt 15 individuella flugor till 15 individuella glasrör med hjälp av en suganordning och nära glasrör på båda sidor med hjälp av motsvarande adaptrar.
Obs: Eftersom systemet måste hermetiskt tillslutet för lyckade experiment, se till att adaptrar passar glasrör tättoch notera att glasrör kan gå sönder under detta steg. Var noga med att undvika skador genom att bära skyddshandskar och skyddsglasögon. - Anslut glasrör till Flywalk installation och, från och med nu, vänta minst 15 minuter innan försöket att låta flugor att vänja till den nya miljön.
- Efter att fästa glasrör: kontrollera avläsning av de efterföljande digitala flödesmätare på datorn 1 om 16 luftflöden efter glasrör lägga till upp till luftflödet in i systemet. Också kolla på datorn 1, om luftfuktigheten är mellan 60% och 80%.
- Design stimulans protokoll som styr sekvensen och tidpunkten för lukt stimuli presenteras för flugorna. För att få till exempel de beskrivna uppgifterna, nuvarande 4 lukter och kontroll (mineralolja) var för sig och alla möjliga ternära och kvar blandningar av lukter samtidigt för 40 gånger vardera. Ställ pulslängd till 500 msek vid en interstimulus intervall på 90 sek och randomisera stimulans sekvens.
- Slå på light källa (LED-cluster, λ = 630). Se till att ge tillräckligt med ljus för effektiv spårning utan att öka temperaturen inuti glasrören.
- Sätt upp ett område av intresse av spårningssystemet genom att dra en ram över det område som ska övervakas på ett sådant sätt att alla 15 glasrör ingår och ungefär 5 mm av kanterna hos rören är undantagna.
- Ställ in 14 parallella separationslinjerna mellan enskilda rör i uppföljningssystemet genom att ändra sina Y-positioner i motsvarande skript för att hålla enskilda flugor identifieras under hela experimentet. Se till att placera dem på ett sådant sätt att det alltid finns ett glasrör mellan två sådana skiljelinjer, eftersom endast en fluga spåras mellan en uppsättning av två linjer.
- Se till att ställa kameraparametrar på ett sådant sätt att flugor är tillförlitligt spåras genom hela glasrören. Om flugor går förlorade vid kanterna av regionen av intresse, öka ljusstyrkan eller förstärkningen av spårnings software. Undvik mekaniska vibrationer i tracking system. Spåra att använda kommersiell programvara enligt tillverkarens protokoll.
- Börja experiment genom att starta stimulans protokollet. Record flies' XY-koordinater vid 20 fps (frames per sekund) och logga in kombination med lukten ventilstatus i textfiler.
3. Data Analysis
OBS: Följande steg i analysen uppgifter automatiseras med hjälp av skräddarsydda skriftliga rutiner programmerade i R. Eftersom dessa åtgärder är avgörande för att få meningsfulla resultat analysen kommer ändå att presenteras i en steg-för-steg sätt. Rådata för analys är .csv-filer som innehåller synkroniserade information om luktventilstatus, pulsnummer i försöket och 15 fly x-positioner i cm på en gemensam tidsaxel för en lukt stimulering cykel. Anpassad kod för dataanalys kan lämnas på begäran.
- Öppna CSV-fil, hitta tid punkten för ventilöppning betecknas med en chaNBE i kolumnen representerar ventil status.
- Beräkna linjär funktion av lukt positionen av formen
f (t) = s * t + i
där t är tiden i stimulering cykeln, s vindhastigheten (här 20 cm / sek) och skärningspunkt jag kan beräknas med hjälp av tidspunkten lukten kommer in i rören i position 0 (ventilöppning plus fördröjning). - Hitta tidpunkt vid vilken lukt och flyga x-positionen skär för varje flyga och ställa denna tidpunkt, till 0. Obs: Detta sätt flyga positioner anpassas till varje individs möter med lukten.
- Uteslut flugor som sitter vid själva kanterna av regionen av intresse.
- Beräkna hastighet från X-positioner genom att dividera förflyttning längs x-axeln med tidsintervallet (100 ms) och upprepa proceduren för varje stimuleringscykel.
- För att få snabba tids kurser som visas i figur 2E beräkna medelhastighet tidsförloppet för varje fluga och lukt och från de medel tidsförloppet för en given lukt.
- För att erhålla netto förskjutning som visas i figur 3C beräkna netto förskjutningen inom fyra sekunder efter lukten pulsen för varje händelsespårning och därefter den genomsnittliga netto förskjutningen per fluga och lukt.
4. Rengöring Förfarande
- Clean Glass Tubes
- Ta bort flugor och adaptrar från glasrör och njuta glasrör i tvättmedel.
- Skölj glasrör under rinnande destillerat vatten och torka dem med tryckluft.
- Värme glasrör vid 200 ° C under 8 h.
- Clean Lukt Delivery System
- Ta bort alla luktflaskor och slangar från den centrala blandningskammaren.
- Ta bort slangadaptrar från blandningskammaren.
- Ren blandningskammare genom att skölja det med laboratorierengöringslösning och lösningsmedel (t ex etanol, aceton). Utför dessa steg under laboratoriehuven.
- Torr blandningskammare som använder tryckluft och värm vid 200 ° C under 8 h.
- Rena Lukt Flaskor och backventiler
- Ta bort stålplugg (kasseringsgummipackningen) och backventiler från luktflaskor och dra alla komponenter i laboratorierengöringslösning.
- Sonikera komponenter i ett ultraljudsbad och skölj dem med destillerat vatten.
- Rengör alla komponenter förutom backventiler med etanol och aceton. Utför dessa steg under laboratoriehuven.
- Torra komponenter med tryckluft och värm dem vid 200 ° C under 8 h.
- Rengör backventiler på insidan genom att spola dem med etanol och aceton med hjälp av en spruta (överväga flödesriktningen). Utför dessa steg under laboratoriehuven bär laboratorieskyddsglasögon. Eftersom aceton angriper gummidelar, omedelbart ventiler torra kontroll genom att spola dem med tryckluft.
- Avlägsna återstående odörer genom pulsning av luft genom backventiler i flera dagar. Använd en inkubator vid 60 ° C och en 1 sekund luft på / 1 sek luft utanför ordning för detta reningssteg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eftersom flugor får distribuera fritt inom sina glasrör mellan luktpulser och odören pulsen färdas genom glasrören med en konstant hastighet flugor stöter odören vid olika tidpunkter beroende på deras x-positionen vid tidpunkten för stimulans. Som ett resultat, är de inträden i de motvindstyp banor framkallade av en 500 ms puls av en attraktiv 10 -3 utspädning av etylacetat fördröjd med ungefär en sekund för flugor på medvinds slutet av sin glasrör jämfört med dem av flugor som sitter närmare den vindsidan änden vid en vindhastighet av 20 cm / sek och 20 cm glasrör längd (Figur 2A). Korrigering för tidsskillnaden lukt möte för varje individ baserat på dess x-position vid tidpunkten för lukt presentation visar att svars förseningar mot etylacetat överensstämmer mellan individer (Figur 2B).
På motsvarande sätt, den genomsnittliga vindsidan bana utan korrektion för Odor Alla fördröjs med ungefär 0,5 sek jämfört med den genomsnittliga bana med korrigering (Figur 2C; notera att korrigering för tids odören behöver ange vindsidan änden av glasrören utfördes för båda banor). Dessutom det korrigerade medelvärdet på vindsidan förloppet för en enda luktpuls visar också en brantare lutning (dvs en högre gånghastighet) än den okorrigerade en (figur 2D). I likhet med de observationer för en enda lukt puls, utelämna korrigeringen för lukt resor leder till en ökad fördröjning och lägre responsamplitud i en komplett datamängd som består av två laborationer (dvs. 30 flugor) med 40 presentationer av lukt pulser vardera (Figur 2E) .
Upprepad stimulering med 500 msek pulser av attraktiva 10 -3 utspädningar av etylbutyrat (ETB), isopentylacetat (lAA), etylacetat (ETA) och 2,3-butandion (BEDN) framkallar vindsidan ökningar på odeller möter i svalt kvinnliga flugor, medan stimulering med lösningsmedlet mineralolja (MOL) väcker inga eller endast svaga reaktioner. Mekanisk stimulering ensam har tidigare visat sig inducera ökad rörlighet på ett liknande paradigm 28. Men eftersom luktstimulering i Flywalk paradigm inte ändrar den totala luftflöde och ökad rörlighet är mestadels frånvarande i kontrollsituation med hjälp av MOL, vindsidan ökningar dessa återspegla verkliga luktsvar. Genomsnittlig svarstid-kurser stereotypa mellan individer (Figur 3A) och lukt specifik latens, amplitud och varaktighet (Figur 3A, B). Responses to etylacetat uppvisar en skarp verkan, hög amplitud och kort varaktighet. I motsats, svar på 2,3-butandion uppvisar vanligtvis en något senare debut, en lägre amplitud och en längre varaktighet. Etylbutyrat och isopentylacetat framkalla liknande tidsmässig dynamik såsom etylacetat, men svaren är lägre i amplitud. Correspondingly, alla 4 lukter framkalla en högre vindsidan förskjutning inom fyra sekunder efter lukt möter än vad lösningsmedlet och negativa kontrollen mineralolja (figur 3C).
Genom att använda samma 4 lockades det tidigare visat att binära blandningar av lockmedel är minst lika attraktiv som den mer attraktiv beståndsdel i blandningen 29. Här är denna observation utvidgas genom att testa alla möjliga ternära blandningar och hela blandningen av alla 4 lock. I likhet med den tidigare observationen med binära blandningar, alla dessa mer komplexa blandningar är minst lika attraktiv som den mest attraktiva enda förening (Figur 4A). De mest attraktiva blandningarna är de som innehåller både etylacetat och 2,3-butandion. Svaren på dessa 3 blandningar inte skiljer sig markant från varandra och även svars kinetik är slående likartade (Figur 4A, B). Däremot utelämnande etylacetat från den fullständiga Blend leder till en minskning av den maximala vindsidan hastighet, och utesluta 2,3-butandion förkortar responsen (figur 4C). Eftersom etylacetat framkallar korta hög amplitud svar, medan 2,3-butandion framkallar svar med lägre amplitud men längre varaktighet (Figurerna 3B, 4D), dessa iakttagelser som påminner om vår tidigare bedömning, att svar tids kurser mot blandningar av lockmedel tenderar att följa en optimalt svar tidsförloppet skapas från blandning konstituerande svarstid kurser 29. I detta dataset kan konstrueras optimalt för alla 4 lock på grundval av svarstidsbanor mot etylacetat och 2,3-butandion. Etylbutyrat och / eller isopentylacetat är nödvändiga förutom att nå maximal gånghastighet observerades i svaren mot hela blandningen (Figur 4D). Följaktligen ökar den ökade blandningen komplexitet från 2 till 3 eller 4 komponenter attraktions blandningen even längre än vad som kan förväntas från tidigare observationen, att svar mot blandningar av lockmedel utgör en optimal av svaren mot blandningen beståndsdelar. Trots den allmänna slutsatsen att konstituerande valens är konserverad i lukt blandningar kvarstår även för dessa mer komplexa blandningar 29.
Figur 1. Princip och layout av Flywalk installationen. (A) Schematisk bild av principen. Gul fyrkant: lukt stimulans som rör sig genom röret och resulterar i vindsidan rörelse av flugan; svart föremål: kamera för att spåra beteendemässiga reaktioner. (B) Schematisk bild av luftflödet genom installationen med kol-filtrerad luft som befuktas och delas upp i 8 kanaler, innan lukten leveranssystemet 26,30. Blow-up Bild: 1, trevägs solenoidventilen pass ing luftflödet antingen genom en tom flaska (c; kompensations flöde) eller genom en flaska innehållande luktkälla (o; lukt flöde); 2, kulventiler att begränsa luftflödet i en riktning och för att undvika kontaminering-system; blandningskammaren: specialbyggd låda, som samlar luft från alla magnetventiler och överföringar att dela upp styrelse, där luft delas 15 glasrör laddade med enskilda flugor och ett rör som är utrustade med temperatur- och fuktsensorer. Obs: flödesregulatorer och flödesmätare efter glasrör garanterar samma flöde i alla rör. Blå kvadrat betecknar regionen av intresse (ROI) i spårningssystem. (C) Schematisk bild av informationsflödet mellan spårning kamera, spårning dator, och lukt leveranssystem. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
oad / 53.394 / 53394fig2.jpg "/>
Figur 2. rättegångs och motiven bakom dataanalys. (A) Individuell flyger möter lukten på olika positioner och därmed olika tidpunkter. Vänster panel: Schematisk bild av möjliga flyga positioner vid tidpunkten för luktventil växling. Höger panel: Rådata röntgen positionerna för 15 flugor kring presentationen av en 500 ms puls av en 10 -3 utspädning av etylacetat. Obs promenader på vindsidan av enskilda flugor vid olika tidpunkter beroende på deras x-positioner. Vänster streckad linje: tid av lukt ventil växling. Lukt mötet mellan enskilda flugor flyttas med en system inneboende fördröjning för lukten att nå glasrör (d) och vindhastigheten (w). Därför lukt möter beräknas individuellt för varje fluga baserat på dess x-positionen. Nederst till höger: inriktade x-positionerna för de 15 flugor (grå) och menar x-läge (djärv svart). (B) Samma uppgifter som i A, men korrigerat för förseningar och vindhastighet. BottOM: linje x-positionerna för de 15 flugor (grå) och betyder X-läge (djärvt rött) efter korrigering. (C) Jämförelse av medelvindsidan framsteg av 15 flugor framkallade av en 500 ms puls av etylacetat med och utan korrektion för lukt resor. Observera att den okorrigerade (svart) spår korrigeras för förseningen, men inte för lukt resor. (D) Medelvärde vindsidan hastighet av 15 flugor framkallade av en 500 ms puls av etylacetat med och utan korrektion för lukt resor. Streckade linjer visar hastighet beräknas från vindsidan framsteg värden som visas i C, djärva linjer visas på vindsidan fart efter utjämning med hjälp av en 1: a ordningen 9-punkts Savitzky-Golay filter. (E) Ofiltrerat innebära vindsidan fart med och utan korrektion för lukt resor för 30 flugor och 40 pulser av etylacetat vardera (dvs. en fullständig uppsättning uppgifter). Klicka här för att se en större version av dennafigur.
. Figur 3. Exempel svar för 10 -3 utspädningar av 4 attraktiva lukt (A) Färgkodade genomsnittliga svarstids kurser 30 individuella flugor till 500 msek pulser av 4 dragande och lösningsmedelsmineralolja (MOL, ETB: etylbutyrat; IAA: isopentylacetat, eta: etylacetat; BEDN: 2,3-butandion). Varje rad representerar den genomsnittliga reaktionen tidsförloppet för en enskild fluga. Varje fluga presenterades med varje doft för 40 gånger och - eftersom flugor får distribuera fritt och kan lämna området av intresse av spårningssystemet - innebär svarstids kurser beräknas utifrån alla kompletta banor per fluga (n = 7-39 banor per fluga och lukt). Gul stapel representerar lukten pulsen. (B) Svarstid-kurser till 4 dragande och lösningsmedelsmineralolja (n = 30 flugor, medelvärde+/- SEM). (C) Nettovindsidan förskjutning inom fyra sekunder efter lukt möter (samma data som i (A) och (B), n = 30 flugor). Fyllda rutor indikerar statistiskt signifikant vindsidan rörelse i förhållande till den negativa kontrollen mineralolja (p <0,05; Wilcoxon signed rank test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4. Svaren mot ternära och kvar blandningar av lock. (A) Net vindsidan förskjutning för 4 dragande och alla ternära och kvar blandningar därav sorterade efter deras median svar. Olika bokstäver indikerar statistiskt signifikanta skillnader mellan svar (p <0,05; Kruskal-Wallis rangsummetest och post hoc-Wilcoxon signed rank test, n = 30flugor). Black box nedan visar blandningar innehållande etylacetat och 2,3butanedione. (B) Svarstid-kurser blandningar innehållande etylacetat och 2,3-butandion (medelvärde +/- sem, n = 30 flugor). Obs liknande respons-kinetik. (C) Jämförelse av svarstids kurser blandningar utan etylacetat eller 2,3-butandion och svars kinetik framkallade av hela blandningen (medelvärde +/- sem, n = 30 flugor). Obs lägre amplitud utan ETA och kortare svar utan BEDN. (D) Jämförelse av optimala tidsförlopp (streckad) konstrueras från ETA (röd) och BEDN (grön) och den fullständiga blandningen. Markeringar anger delar av tidsförloppet förklaras av olika blandningsbeståndsdelar. Observera att i en tidigare studie har det visat sig att svaren mot binära blandningar av lock kan förutsägas från en optimal tidsförlopp som skapas på grundval av blandningen ingående tids kurser 29. Denna optimala tidsförlopp för ETA och BEDN visas som enstreckad linje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om Flywalk systemet verkar ganska sofistikerade vid första anblicken, en gång ställa upp och köra det är lätt att använda och ger mycket robusta resultat. För att understryka överensstämmelsen mellan de resultat med bioanalys det kan sägas att de representativa resultat som visas här erhölls nästan 2 år efter några av de resultat som visas i en tidigare studie 29 med en modifierad installation med en ny mjukvara och ljuskälla. Trots lock svaren är - trots något högre svars amplituder - mycket liknar de som tidigare publicerats om deras dynamik.
Det finns vissa kritiska aspekter som bör beaktas i synnerhet för att uppnå resultat av hög kvalitet med hjälp av Flywalk. Viktigt, bör luftfuktigheten inte understiga 60% under loppet av ett experiment. En typisk experiment session varar i cirka 8 timmar. Rimligen stora kvinnliga CS vildtyp flugor svalt under 24 timmar innan exexperimentera lätt överleva under minst 12 h i den experimentella uppställningen tillgänglig fuktigheten är tillräckligt hög. För att undvika problem i samband med fuktighet är det lämpligt att installera en fuktsensor i en tom glasrör (Figur 1B) och för att undvika att placera flödesregulatorer i luftflödet någonstans mellan luftfuktare och glasrör. Det är också absolut nödvändigt för datakvalitet att systemet är hermetiskt tillslutet. De flöden som lämnar systemet efter glasrör bör sammanfatta till luftflödet in i systemet. Mest misslyckade försök kan hänföras till läckor i systemet och stor försiktighet bör vidtas före starten av experimentet för att säkerställa att systemet är lufttätt. Slutligen, som med alla inställningar som används i lukt forskning, är en av de stora vardagsfrågor för att undvika kontaminering. De flesta av de delar som kommer i kontakt med de lukter är gjorda av glas, stål, teflon eller PEEK och kan därför värmas upp till åtminstone 200 ° C, vilket är tillräckligt för att avlägsna det mesta odors med undantag för dem med särskilt höga kokpunkter såsom långkedjade feromoner. Eftersom backventiler innehåller gummidelar kan inte värmas så högt och därför är den största föroreningskällan, vilket är anledningen till en viss rengöring protokoll utformades för dem. Ändå är det lämpligt att hålla reda på lukter en viss backventil har kommit i kontakt med. Vid tveksamhet om sin renlighet ersätta den.
Som en kompromiss mellan bundna analyser och kohortstudier experiment har Flywalk givetvis också en del nackdelar jämfört med andra metoder. Paradigm är mycket effektiv när beteende mot en mängd olika stimuli måste bedömas och jämföras. Noterbart eftersom svaret tidsförloppet för 15 personer till strax en puls av en viss lukt liknar starkt svarstid banor som erhållits i en full uppsättning data (dvs. 30 flugor och 40 presentationer vardera, figurerna 2D, 2E t.ex. hedoniska valens bara en lukt behöver undersökas. Dessutom är den temporala upplösningen av visuella spårningssystem ofta lägre än den för de snabbaste bioanalyser såsom tjudrat flygning eller löpband. De kortaste svars förseningar som rapporterats i Drosophila lukt guidad beteende är långt under 100 ms efter lukt möter i bundna paradigm 20,23 och därmed faller inom ett tidsfönster som inte kan lösas när man analyserar data vid 10 Hz. Men attraherande svar i Flywalk börjar vanligtvis inom de första 100-300msek (Figur 3B), vilket ligger väl i linje med motvindstyp stöt förseningar observerats i fritt flygande flugor 5. Det återstår därför att undersöka om denna skillnad i svars förseningar bundna paradigm jämfört med vindtunnel och Flywalk orsakas av skillnader i spatial och / eller tidsupplösning i visuella spårnings paradigm eller genom ett högre upphetsning tillstånd flugor i den bundna situationen.
Sammanfattningsvis är Flywalk ett ickevals bioanalys, som kombinerar mycket kontrollerad stimulans presentation av bundna analyser med effektiviteten i kohort experiment som regelbundet används i Drosophila neuroetologi. Eftersom samma uppsättning individer kan ifrågasättas med en mängd olika stimuli, dess speciella styrka ligger i statistisk styrka när man jämför svar mot olika stimuli. Dessutom utnyttjar det faktum att flugor surge vindsidan vid möte av en attraktiv doft och på detta sätt frånkopplas luktutvärderingfrån lukt källa lokalisering utan att det behövs en lutning som en riktnings kö. Det bör därför idealiskt lämpad för att utnyttja optogenetic verktygslådan som finns i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Daniel Veit för tekniskt bistånd och Pedro Gouveia på Electricidade Em Pò (electricidadeempo.net) för att anpassa mjukvara för våra krav. Vi vill också tacka Tom Retzke stöd under inspelningen processen. Denna studie stöddes av Max Planck-sällskapet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D.
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M.
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
