Summary
De automatische tracking systeem Flywalk wordt gebruikt voor hoge-resolutie kwantificering van geur-begeleide gedrag in Drosophila melanogaster.
Abstract
In hun natuurlijke omgeving, insecten zoals de azijn Drosophila melanogaster worden gebombardeerd met een enorme hoeveelheid chemisch verschillende geurstoffen. Om de zaak nog verder te compliceren, de gedetecteerd door het insect zenuwstelsel geuren zijn meestal niet enkel verbindingen, maar mengsels waarvan de samenstelling en de concentratie ratio's variëren. Dit leidt tot een bijna oneindig aantal verschillende olfactorische stimuli die moeten worden geëvalueerd door het zenuwstelsel.
Om te begrijpen welke aspecten van een geur stimulus zijn bepalend voor de evaluatie door de vlieg, is het daarom wenselijk om efficiënt te onderzoeken geur geleid gedrag ten opzichte van vele geurstoffen en geur mengsels. Om direct correleren gedrag neuronale activiteit, moet het gedrag worden gekwantificeerd in een vergelijkbare tijd en onder dezelfde voorwaarden als stimulans in neurofysiologische experimenten. Echter, veel momenteel gebruikt olfactorische bioassays in Drosophila neuroethology nogal speciaseerd, hetzij in de richting van de efficiëntie of naar resolutie.
Flywalk, een geautomatiseerde geur levering en tracking systeem, overbrugt de kloof tussen efficiëntie en resolutie. Zij maakt de bepaling van precies wanneer een geur packet stimuleerde vrijlopende vlieg en de animal's bepalen dynamische gedragsreactie.
Introduction
Het overkoepelende doel van een neuroethological onderzoek is om een oorzakelijk verband tussen de activiteit staten van enkele neuronen of neuronale circuits en het gedrag van een organisme vast te stellen. Om dit doel te bereiken neuronale activiteit en het gedrag moeten worden gecontroleerd onder identieke stimulus omstandigheden en deze stimulans voorwaarden idealiter vergelijkbaar zijn met die van het zenuwstelsel onder de loep geëvolueerd om gevoel van te maken. Vooral als het gaat om gedragsverandering bioassays, hebben deze eisen in het verleden bewezen heel veeleisend in Drosophila melanogaster olfactorische neuroethology.
Eenmaal vrijgekomen uit de bron, geur pluimen snel breken in dunne filamenten met turbulente diffusie veroorzaakt door beweging van de lucht zijn de belangrijkste determinant van geur verdeling 1. Dientengevolge, een insect navigeren naar een geurbron ervaart intermitterende stimulatie met geur pakketten afgewisseld met variabele intervallen van schone lucht. Beidewandelen en vliegende insecten - met inbegrip van Drosophila - is aangetoond dat deze regeling intermitterende stimulatie voor navigatie misbruiken door stijgende upwind op pluim ontmoeting en overwegend bewegende cross-wind in de afwezigheid van geuren 2-5. Overwegende dat stimulatie procedures in fysiologische experimenten grotendeels lijken op die van een insect kunnen ervaren in de natuurlijke omgeving door ofwel het verstrekken van enkele trekjes van geuren afgewisseld met langere periodes van schone lucht of dynamische stimulatie sequenties 6-11, veel gedragsproblemen bioassays gebruikt in Drosophila neuroethology zoals val assay , open veld arena's of T-doolhof vertrouwen op geur-hellingen 12-15. Omdat geur hellingen per definitie variabele concentratie, afhankelijk van de afstand tot de geurbron een bepaald gedrag kan niet worden toegeschreven aan een nauwkeurige geurconcentratie via deze paradigma. Bovendien is de helling vaneen geur gradiënt kritisch afhangt van de fysisch-chemische eigenschappen van de geurstof. 20, hetgeen kan leiden tot een verkeerde interpretatie - Een gradiënt van een zeer vluchtige verbinding zullen ondieper dan door een minder vluchtige verbinding en dus ook moeilijker te sporen om een organisme te vertrouwen op het meten concentratieverschillen in ruimte als de enige navigatiemiddel 16 zijn olfactorische preferenties name keuze assays. Dit effect is ook zeer schadelijk is bij het onderzoek naar gedrag naar geur mengsels, omdat het leidt tot verschillende mengselcomponent verhoudingen op elk punt in de ruimte en dus opnieuw verzet tegen een duidelijke correlatie tussen de fysiologie en gedrag.
Terwijl azijn vliegt de neiging te aggregeren op het vergisten van fruit, ze zijn solitair in hun navigatie richting voedselbronnen en ovipositie sites. Niettemin plaats testen van individuele dieren vele gedragsparadigma's gebruikt in Drosophila neuroethology onderzoekt de geur geleid gedrag van cohorten van vliegen en aantrekkingskracht wordt gescoord als de fractie van vliegen het kiezen van de geur over een controle stimulus. Deze cohort experimenten hebben in belangrijke mate bijgedragen aan het begrip van fly neuroethology en veel van de opmerkingen van het gebruik van hen kon in single-fly experimenten worden bevestigd. Er is echter waargenomen dat vliegt kan elke other's beslissing 21 beïnvloeden en in het uiterste geval de evaluatie van een geur kan overschakelen van onverschilligheid voor het vermijden, afhankelijk van de bevolkingsdichtheid 22. Bovendien, de resultaten van dergelijke experimenten geven vaak slechts het eindpunt van een sequentie van gedrags- besluiten in plaats observeren wat vlieg doet terwijl het doet, hetgeen wenselijk is bij een poging om gedrag neuronale activiteit correleren. Deze vrij lage resolutie cohort experimenten worden in contrast met single-fly methoden met een hoge resolutie, zoals aangebonden vlucht arena's en loopbanden die het mogelijk makenvoor een directe observatie van gedragsreacties op het moment dat de stimulus wordt gepresenteerd 20,23,24. Toch cohort experimenten zijn nog steeds populair, omdat ze zijn zeer efficiënt en bieden robuuste resultaten, zelfs bij relatief lage steekproefomvang omdat inter-individuele en inter-proces variabiliteit gedeeltelijk uitgemiddeld als gevolg van de observatie van de bevolking gedurende langere perioden. Terwijl vastgebonden vlucht en loopband verschaffen waarschijnlijk de gouden standaard betreffende stimulus en temporele resolutie, worden de arena gebruikt voor eenmalig dieren en derhalve tijdrovend te verkrijgen steekproef noodzakelijk maten voor statistische analyse. Verscheidene andere benaderingen zijn recentelijk ontwikkeld dat een efficiënte acquisitie van hoge-resolutie gedragsgegevens in combinatie met een goed gedefinieerde stimulus regeling mogelijk maken. Deze omvatten zonder toezicht 3D-volgen van meerdere azijn vliegen in een windtunnel in combinatie met een nauwkeurige 3D-model van de geur pluim 5 25 en de Flywalk paradigma 26.
In Flywalk, zijn 15 individuele vliegen gelegen in kleine glazen buisjes en continu bewaakt door een overhead camera onder rood licht. Geuren worden toegevoegd aan een continue luchtstroom van 20 cm / sec en reis door de glazen buizen met een constante snelheid. De luchtstroom wordt bevochtigd door het door 250 ml flessen met gedestilleerd water (luchtbevochtigers) voordat de geur afgiftesysteem. De flies' posities worden opgeslagen in een vierkant gebied van belang (ROI) omvat de meeste van de lengte van de geur buizen (met uitzondering van de buitenranden van de buizen (ongeveer 5 mm aan elke kant) wanneer de vliegen niet kan bewegen verder omhoog of wind) rond de tijd van geur presentatie (figuur 1A, B). Fly identiteiten worden constant gehouden door het volgsysteem throughout het experiment op basis van de Y-posities (gebruikte glazen buis grenzen). Geur stimulering wordt bereikt met een multi-component stimulus inrichting waarbij het voorleggen van maximaal 8 enkele geuren en alle mogelijke mengsels daarvan 26,29 (Figuur 1B) mogelijk maakt. Tijdens een proef wordt bestuurd door een computer regelen van de geur afgiftesysteem en het verzamelen van temperatuur en vochtigheid informatie (computer 1, figuur 1C). Deze computer stuurt ook een datalogger (start / stop opname) op een tweede computer die continu tracks vliegen posities bij 20 frames per seconde (computer 2). Vliegen posities, geur klep staat (dwz tijd-punt van de klep opening), geur ID, temperatuur en vochtigheid rond geur stimulatie cycli worden aangemeld bij de computer 2. Op deze manier informatie over de geur en vliegen posities worden gesynchroniseerd en geëxporteerd als CSV-bestanden die kunnen verder worden verwerkt en met behulp van aangepaste geschreven analyseroutines geanalyseerd. Omdathet hele systeem computergestuurd, zonder menselijke tussenkomst nodig tijdens een experimentele sessie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De bouw en de technische details van Flywalk zijn beschreven elders 26 (in geval van problemen van de oprichting van deze set-up, nadere informatie kan worden verkregen bij MK). Hier richten we ons op gedetailleerde instructies over de afhandeling van het paradigma die zullen helpen om betrouwbare resultaten te verkrijgen.
1. Fly Handling
- Achterste vliegt in lage tot gemiddelde dichtheid culturen aan voedsel medium 27 onder een 12 uur: 12 uur licht: donker regime bij 23-25 ° C en 70% relatieve vochtigheid. Daartoe laat 20-30 nieuw opgedoken volwassen vliegen te reproduceren in een grote food flacon voor 1 week, dan gooi volwassen vliegen en wachten tot nakomelingen te ontstaan.
- Verzamel 30-40 nieuw opgedoken (leeftijd <24 uur) volwassen vliegen en ouder ze op in een nieuwe flacon met voedsel medium 27 voor 3-5 dagen.
- Vierentwintig uur vóór de start van de gedragsexperiment: 30-40 Breng alle eerder verzamelde 3-5 d oud (zie 2.2) vliegt in nieuw vial met een vochtige rubber schuim stekker of een vochtige tissue papier met behulp van een aspirator.
OPMERKING: Niet vliegen met behulp van CO 2 verdoven.
2. Voorbereiding van de Flywalk Setup
- Gebruik 250 ml flesjes als luchtbevochtigers. Vul luchtbevochtigers met 100 ml gedestilleerd water.
- Bereid geur flacons.
- Bereid 500 pi 10 -3 verdunningen zuivere geuren ethylacetaat, ethyl butyraat, isopentylacetaat en 2,3-butaandion in oplosmiddel minerale olie.
- Bevestig twee kogels per geur flacon. Merk op dat terugslagkleppen zorgen voor uni-directional alleen luchtstroom. Daarom sluit terugslagkleppen op zodanige wijze dat de lucht de flacon kan invoeren aan de ene zijde en laat het aan de andere kant.
- Verwijder het deksel van een 200 pi PCR-reactiebuis. Pipetteer 100 ul van elke verdunning geur in een afzonderlijke reactiebuis en plaats de buizen in afzonderlijke flesjes geur. Ook bereiden een geur flesje met alleen het oplosmiddel minerale oil.
- Goed af, de geur flacons door het sluiten van hen met behulp van roestvrij staal pluggen en rubberen afdichtingen.
- Sluit de 5 geur flacons (4 bevat geuren en 1 minerale olie) om de geur afgiftesysteem. Zorg ervoor om ze te verbinden in de juiste stroomrichting. Een verkeerde aansluiting zal niet alleen het gevaar geplande experiment, maar kan ook verontreinigen het afgiftesysteem.
- Controleer op lekkage door het afdichten van de uitlaat van de mengkamer van de stimulus apparaat. Zorg ervoor dat alle luchtstromen voordat de stimulus apparaat nu geleidelijk dalen tot nul. Zo niet, controleer op lekken die nu kunnen worden geïdentificeerd door het sissende geluid van de lucht het verlaten van het systeem.
- Zorgvuldig overdragen 15 individuele vliegen tot 15 individuele glazen buizen met behulp van een aspirator en dicht glazen buizen aan beide zijden met behulp van de bijbehorende adapters.
Let op: Omdat het systeem hermetisch wordt afgesloten voor een succesvolle experimenten, ervoor te zorgen dat adapters passen glazen buisjes straken er rekening mee dat glazen buizen tijdens deze stap kan breken. Zorg om verwondingen te voorkomen door het dragen van beschermende handschoenen en een veiligheidsbril. - Sluit de glazen buizen aan de Flywalk setup en vanaf hier op, wacht tenminste 15 minuten voor aanvang van het experiment te laten vliegen om wennen aan de nieuwe omgeving.
- Na het bevestigen van glazen buizen: controleer de uitlezing van de downstream digitale flowmeters op computer 1 als de 16 luchtstromen na de glazen buizen toe te voegen aan de luchtstroom in het systeem. Kijk ook op de computer 1, indien de vochtigheid tussen 60% en 80%.
- Ontwerp stimulus protocol besturen van de volgorde en timing van geur stimuli gepresenteerd aan de vliegen. Gelijktijdig krijgen bijvoorbeeld de beschreven gegevens, aanwezig 4 geuren en de controle (minerale olie) afzonderlijk en alle mogelijke ternaire en quaternaire mengsels van de geuren voor 40 keer per stuk. Stel pulsduur tot 500 msec in een interstimulus interval van 90 sec en willekeurig stimulus volgorde.
- Schakel de light bron (LED-cluster; λ = 630). Zorg ervoor dat voldoende licht voor efficiënte tracking verschaffen zonder dat de temperatuur in de glazen buizen.
- Opzetten van een gebied van belang van het volgsysteem door het slepen van een frame over het te bewaken gebied zodanig dat alle 15 glazen buisjes opgenomen en ongeveer 5 mm van de randen van de buizen worden uitgesloten.
- Instellen 14 evenwijdige scheidingslijnen tussen individuele buizen in het volgsysteem door het veranderen van de Y-posities in het bijbehorende script individuele houden vliegt identificeerbaar gedurende het experiment. Zorg ervoor dat ze te positioneren zodanig dat er altijd een glazen buis tussen twee dergelijke scheidingslijnen, omdat slechts een vlieg worden bijgehouden tussen elk stel van twee lijnen.
- Zorg ervoor dat cameraparameters op zodanige wijze dat op een betrouwbare manier vliegt bijgehouden gedurende de glazen buizen. Als vliegen verloren aan de randen van het gebied van belang, te verhogen helderheid of versterking van de tracking software. Vermijd mechanische trillingen van het volgsysteem. Volg het gebruik van commerciële software volgens het protocol van de fabrikant.
- Begin experiment door het starten van de stimulus-protocol. Record flies' XY-coördinaten bij 20 fps (frames per seconde) en log in combinatie met de status geur klep in tekstbestanden.
3. Data Analysis
Opmerking: De volgende stappen van de gegevensanalyse worden geautomatiseerd met behulp van aangepaste geschreven routines geprogrammeerd R. Door deze stappen is cruciaal voor zinvolle resultaten Toch zal in een stap voor stap manier gepresenteerd krijgen. De ruwe gegevens van de analyse CSV-bestanden met gesynchroniseerde gegevens over geur klepstatus, aantal impulsen in het experiment en 15 fly x-posities in cm op een gemeenschappelijke tijdas één geur stimulatiecyclus. Aangepaste code voor data-analyse kan worden geleverd op aanvraag.
- Open CSV-bestand, vinden de tijd-punt van de klep opening aangegeven door een chaNSE in de kolom die de status van de klep.
- Bereken de lineaire functie van geur positie van de vorm
f (t) = s * t + i
waarin t de tijd in de stimuleringcyclus, s de windsnelheid (hier 20 cm / sec) en het snijpunt i kan worden berekend met de tijdpunt de geur komt de buizen op positie 0 (ventielopening Delay). - Vind het tijdstip waarop geur en vliegen x-positie kruisen voor elke vliegen en stel dit keer-punt op 0. Opmerking: Op deze manier vlieg posities zijn afgestemd op elk individual's ontmoeting met de geur.
- Uitsluiten vliegen zitten aan de randen van de regio van belang.
- Bereken snelheid van X-posities door het verdelen verplaatsing langs de x-as door het tijdsinterval (100 msec) en herhaal procedure voor elke stimulatiecyclus.
- Om de time gangen verkrijgen zoals getoond in figuur 2E berekent gemiddelde snelheid tijdsverloop voor elke vliegen en geur en uit die de gemiddelde tijdsverloop van een bepaalde geur.
- Om nettoverplaatsing verkrijgen zoals getoond in figuur 3C berekenen nettoverplaatsing binnen 4 seconden nadat de geur puls voor elke gebeurtenis het bijhouden en daarna de gemiddelde nettoverplaatsing per vlieg en geur.
4. Reiniging Procedure
- Schone glazen buizen
- Verwijder vliegen en adapters van glazen buizen en genieten glazen buizen in wasmiddel.
- Spoel glazen buizen onder stromend gedestilleerd water en droog ze met behulp van perslucht.
- Heat glazen buizen bij 200 ° C gedurende 8 uur.
- Clean Geur Delivery System
- Verwijder alle geur flacons en leidingen van de centrale mengkamer.
- Verwijder slang adapters van de mengkamer.
- Clean mengkamer door het te spoelen met het laboratorium reinigingsmiddel en oplosmiddelen (bijvoorbeeld ethanol, aceton). Voer de volgende stappen in het kader van het laboratorium motorkap.
- Droge mengkamer behulp van perslucht en verwarm bij 200 ° C gedurende 8 uur.
- Schoon Geur Flesjes en keerkleppen
- Verwijder staal plug (teruggooi rubberen pakking) en keerkleppen van geur flacons en geniet van alle componenten in het laboratorium reinigingsmiddel.
- Ultrasone trillingen componenten in een ultrasoon bad en spoel ze af met gedestilleerd water.
- Reinig alle onderdelen behalve terugslagkleppen met ethanol en aceton. Voer de volgende stappen in het kader van het laboratorium motorkap.
- Droge componenten met behulp van perslucht en verwarm ze bij 200 ° C gedurende 8 uur.
- Clean terugslagkleppen aan de binnenzijde door spoelen ze met ethanol en aceton met een spuit (interessant stroomrichting). Voer de volgende stappen in het kader van het laboratorium motorkap dragen laboratorium bril. Omdat aceton aanvallen rubber onderdelen, direct droog terugslagkleppen door spoelen ze met perslucht.
- Verwijder overblijvende geuren door pulserende lucht door terugslagkleppen voor meerdere dagen. Gebruik een incubator bij 60 ° C en een 1 sec lucht op / 1 sec lucht uit regeling voor deze reiniging stap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Omdat vliegen zich vrij binnen de glazen buizen verdelen geur pulsen en de geur puls loopt door de glazen buizen met een constante snelheid vliegt ondervindt de geur op verschillende tijdstippen, afhankelijk van hun x-positie ten tijde van de stimulatie. Hierdoor worden de aanzetten van de wind trajecten opgeroepen door een 500 msec puls van een aantrekkelijke 10 -3 verdunning ethylacetaat vertraging van ongeveer 1 sec voor vliegen aan het einde van de wind glasbuizen vergeleken met die van vliegen zitten dichterbij de wind eindigen bij een windsnelheid van 20 cm / sec en 20 cm glazen buis length (Figuur 2A). Correctie voor het verschil in tijd geur ontmoeting voor elk individu op basis van de x-positie ten tijde van geur voorstelling laat zien dat reactie vertragingen richting ethylacetaat consistent individuen (Figuur 2B).
Dienovereenkomstig, de gemiddelde upwind traject zonder correctie voor odor reizen vertraagd ongeveer 0,5 sec in vergelijking met het gemiddelde traject van correctiemiddelen (figuur 2C; correctiecurven het moment dat de geur moet de wind uiteinde van de glazen buis werd gedurende beide trajecten voeren). Bovendien, de gecorrigeerde gemiddelde wind traject voor een geur puls geeft ook een steilere helling (een hogere loopsnelheid) dan ongecorrigeerde één (figuur 2D). Vergelijkbaar met de waarnemingen van één geur puls, met weglating van de correctie voor geur reizen leidt tot een verhoogde vertraging en lagere respons amplitude in een volledige dataset uit twee experimentele sessies (dwz 30 vliegen) met 40 presentaties geur pulsen elk (figuur 2E) .
Herhaalde stimulatie met 500 msec pulsen aantrekkelijke 10 -3 verdunningen van ethyl butyraat (ETB), isopentylacetaat (IAA), ethylacetaat (ETA) en 2,3-butaandion (BEDN) opwekt wind pieken bij odof ontmoeting uitgehongerd vrouwelijke vliegt, terwijl stimulatie met het oplosmiddel minerale olie (MOL), geen of slechts een zwakke reacties oproept. Mechanische stimulatie alleen eerder aangetoond dat toegenomen beweging induceren in eenzelfde paradigma 28. Echter, omdat de geur stimulatie in de Flywalk paradigma verandert niets aan de totale luchtstroom en de toegenomen beweging is meestal afwezig in de controle situatie met behulp van MOL, deze upwind pieken weerspiegelen echte geur reacties. Bedoel responstijd-cursussen worden gestereotypeerd over individuen (Figuur 3A) en geur-specifieke in latency, amplitude en duur (figuur 3A, B). Reacties op ethylacetaat weer een scherpe begin, hoge amplitude en een korte duur. Daarentegen reacties 2,3-butaandion meestal vertonen een enigszins latere leeftijd, een lagere amplitude en een langere duur. Ethylbutyraat en isopentylacetaat wekken vergelijkbaar temporele dynamiek ethylacetaat, maar reacties zijn lager in amplitude. CorresponDingly, alle 4 de geuren uitlokken een hoger upwind verplaatsing binnen 4 seconden na geur ontmoeting dan doet het oplosmiddel en negatieve controle minerale olie (Figuur 3C).
Met dezelfde 4 lokmiddelen werd eerder aangetoond dat binaire mengsels van lokstoffen minstens zo aantrekkelijk als het aantrekkelijker mengsel bestanddeel 29. Hier wordt deze constatering uitgebreid met het testen van alle mogelijke ternaire mengsels en de volledige mix van alle 4 lokstoffen. Net als bij de vorige vaststelling met binaire mengsels, al deze complexe mengsels minstens zo aantrekkelijk als de meest aantrekkelijke enkele verbinding (Figuur 4A). De meest aantrekkelijke mengsels zijn die welke zowel ethylacetaat en 2,3-butaandion. Antwoorden op deze 3 blends niet significant van elkaar en ook de reactie kinetiek grote overeenkomsten vertonen (Figuren 4A, B). Daarentegen weglaten ethylacetaat uit het volledige blend leidt tot een vermindering van de maximale snelheid wind, terwijl weglating van 2,3-butaandion verkort de respons (Figuur 4C). Omdat ethylacetaat lokt korte hoge amplitude respons, terwijl 2,3-butaandion lokt reacties van lagere amplitude, maar langere duur (figuren 3B, 4D), deze waarnemingen doen denken aan onze eerdere bevindingen, dat de reacties time-opleidingen in de richting van mengsels van lokstoffen neiging om volgt een optimale respons tijdsverloop ontstaan uit blend constituerende responstijd-cursussen 29. In deze dataset het optimum van 4 lokmiddelen kunnen worden samengesteld op basis van de reactietijd gangen richting ethylacetaat en 2,3-butaandion. Ethylbutyraat en / of isopentylacetaat nodig naast de maximale loopsnelheid waargenomen in reacties bij het volledige mengsel (figuur 4D) te bereiken. Vandaar dat de toename van de complexiteit mengsel 2-3 of 4 componenten verhoogt de aantrekkelijkheid van het mengsel even verder dan wat zou worden verwacht van de vorige observatie, dat de reacties in de richting van mengsels van lokstoffen vertegenwoordigen een optimale van de reacties in de richting mengsel bestanddelen. Toch is de algemene conclusie dat bestanddeel Valence is geconserveerd in geur mengsels blijft ook geldig voor deze meer complexe mengsels 29.
Figuur 1. Principe en de lay-out van de Flywalk setup. (A) Schematische tekening van het principe. Geel vierkant: geur stimulus bewegen door de buis en dat resulteert in de wind beweging van de vlieg; zwart object: camera aan gedragsreacties volgen. (B) Schematische voorstelling van de luchtstroom door de setup met houtskool gefilterde lucht wordt bevochtigd en verdeeld in 8 kanalen, voordat de geur levering systeem 26,30. Blow-up Figuur: 1, drie-weg magneetventiel pas ing de luchtstroom, hetzij door middel van een lege flacon (c; compenserende flow) of via een flacon met de geur bron (o; geur flow); 2, terugslagkleppen luchtstroom beperken ene richting en verontreiniging te voorkomen; mengkamer: custom-built doos, dat de lucht verzamelt van alle magneetventielen en transfers te splitsen-up board, waar de lucht wordt gesplitst 15 glazen buisjes gevuld met individuele vliegen en 1 tube uitgerust met temperatuur en vochtigheid sensoren. Opmerking: debietregelaars en debietmeters na glazen buizen garanderen identiek stroming in alle buizen. Blauwe vierkant geeft regio van belang (ROI) van het volgsysteem. (C) Schematische voorstelling van de informatiestroom tussen het bijhouden van de camera, het bijhouden van de computer, en de geur levering systeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OAD / 53.394 / 53394fig2.jpg "/>
Figuur 2. Procedure van en de ratio van gegevensanalyse. (A) Individuele vliegt ontmoeten de geur op verschillende plaatsen en dus verschillende tijden. Linker paneel: Schema van mogelijke posities vliegen bij de geur switching valve. Rechter paneel: Ruwe data van x-posities van 15 vliegen rond de presentatie van een 500 msec puls van een 10 -3 verdunning van ethylacetaat. Opmerking upwind loopt van individuele vliegen op verschillende tijdstippen, afhankelijk van hun x-posities. Linker gestippelde lijn: tijd van geur klep schakelen. Geur ontmoeting van individuele vliegen wordt verschoven door een systeem-intrinsieke vertraging voor de geur van de glazen buizen (d) en de windsnelheid (w) te bereiken. Daarom wordt geur ontmoeting afzonderlijk berekend voor elke fly basis van de x-positie. Rechtsonder: uitgelijnd x-posities van de 15 vliegen (grijs) en de gemiddelde x-positie (vet zwart). (B) dezelfde gegevens als in A, maar gecorrigeerd voor vertraging en windsnelheid. BottOM: uitgelijnde x-posities van de 15 vliegen (grijs) en het gemiddelde na correctie X-positie (vet rood). (C) Vergelijking van de gemiddelde stand van bovenwinds 15 vliegen opgewekt door een 500 msec puls ethylacetaat met en zonder correctie voor geur reizen. Merk op dat de ongecorrigeerde (zwarte) sporen wordt gecorrigeerd voor de vertraging, maar niet te geur reizen. (D) Gemiddelde upwind snelheid van 15 vliegen opgewekt door een 500 msec puls ethylacetaat met en zonder correctie voor geur reizen. Gestippelde lijnen geven de snelheid berekend uit upwind vooruitgang waarden getoond in C, dikke lijnen geven upwind snelheid na het effenen van het gebruik van een 1 e orde 9-punts Savitzky-Golayfilter. (E) Ongefilterde betekenen upwind snelheid en zonder correctie voor geur reizen voor 30 vliegen en 40 pulsen van ethylacetaat elk (dwz een complete dataset). Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.
. Figuur 3. Voorbeeld antwoorden voor 10 -3 verdunningen van 4 aantrekkelijke geuren (A) Kleur-gecodeerde gemiddelde responstijd-cursussen van 30 individuele vliegt tot 500 msec pulsen van 4 lokstoffen en het oplosmiddel minerale olie (MOL; ETB: ethylbutyraat; IAA: isopentylacetaat; EtA: ethylacetaat; BEDN: 2,3-butaandion). Elke rij vertegenwoordigt de gemiddelde respons tijdsverloop van een individu vliegen. Elke vlieg werd gepresenteerd met elke geur voor 40 keer en - omdat de vliegen worden toegestaan om vrij te verspreiden en kan de regio van belang van het volgsysteem te verlaten - betekenen responstijd cursussen worden berekend op basis van alle volledige trajecten per fly (n = 7-39 trajecten per vlieg en geur). Gele balk vertegenwoordigt de geur puls. (B) Reactietijd-cursussen tot 4 lokstoffen en het oplosmiddel minerale olie (n = 30 vliegt; gemiddelde+/- Sem). (C) Netto wind verplaatsing binnen 4 seconden nadat geur ontmoeting (dezelfde gegevens als in (A) en (B), n = 30 vliegen). Gevulde dozen geven statistisch significante upwind beweging ten opzichte van de negatieve controle minerale olie (p <0,05; Wilcoxon signed rank test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Reacties richting ternaire en quaternaire mengsels van lokstoffen. (A) Netto upwind verplaatsing voor 4 lokstoffen en alle ternaire en quaternaire mengsels daarvan naargelang van hun gemiddelde respons. Verschillende letters geven statistisch significante verschillen tussen reacties (p <0,05; Kruskal-Wallis rank sum-test en post hoc Wilcoxon signed rank test; n = 30vliegt). Hieronder zwarte doos aangeeft mengsels die ethylacetaat en 2,3butanedione. (B) Reactietijd-cursussen van mengsels die ethylacetaat en 2,3-butaandion (gemiddelde +/- SEM, n = 30 vliegen). Opmerking vergelijkbare reactie-kinetiek. (C) Vergelijking van de responstijd-cursussen van mengsels zonder ethylacetaat of 2,3-butaandion en reactie kinetiek opgeroepen door de volledige mix (gemiddelde +/- SEM, n = 30 vliegen). Opmerking lagere amplitude zonder ETA en kortere reactietijd zonder BEDN. (D) Vergelijking van de optimale tijd-cursus (onderbroken) opgebouwd uit EtA (rood) en BEDN (groen) en de volledige mix. Shadings geven delen van het tijdsverloop verklaard door verschillende mengsel bestanddelen. Merk op dat in een eerdere studie werd aangetoond dat reacties bij binaire mengsels van lokmiddelen kunnen worden voorspeld uit een optimale tijdsverloop aangemaakt op basis van het mengsel afzonderlijk tijd gangen 29. Deze optimale tijd-cursus voor ETA en BEDN wordt weergegeven als eenstippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de Flywalk systeem lijkt eerder verfijnd op het eerste gezicht, een keer up and running is het eenvoudig te gebruiken en levert zeer robuuste resultaten. Om de consistentie van het geproduceerde de bioassay resultaten wijzen kan worden gezegd dat de representatieve resultaten hier opgegeven waarden werden bijna 2 jaar na een aantal van de in een eerdere studie 29 met een gewijzigde opstelling met een nieuwe tracking software en lichtbron resultaten. Toch is de lokstof reacties zijn - ondanks de iets hogere respons amplitudes - vergelijkbaar met de eerder gepubliceerde betreffende hun dynamiek.
Er zijn een aantal cruciale aspecten die moeten worden overwogen in het bijzonder met het oog op resultaten van hoge kwaliteit met behulp van Flywalk verkrijgen. Belangrijkste is dat vocht niet tijdens een experiment dalen tot onder 60%. Een typische experimentele sessie duurt ongeveer 8 uur. Redelijk-sized vrouwelijke CS wild-type vliegt uitgehongerd voor 24 uur voor de ex-periment gemakkelijk overleven gedurende tenminste 12 uur in de experimentele opstelling ontvangen luchtvochtigheid hoog genoeg is. Om problemen met betrekking tot de vochtigheid is het raadzaam om een vochtsensor te installeren in een lege glazen buis (figuur 1B) en te vermijden dat debietregelaars in de luchtstroom ergens tussen bevochtigers en glazen buizen te voorkomen. Het is absoluut noodzakelijk gegevenskwaliteit het systeem hermetisch is afgedicht. De luchtstromen verlaat het systeem na de glazen buizen moeten vatten om de luchtstroom het systeem binnenkomen. De meeste mislukte experimenten kan worden toegeschreven aan lekken in het systeem grote zorg moet worden genomen voorafgaand aan het experiment om te verzekeren dat het systeem luchtdicht. Tenslotte, zoals bij elke opstelling gebruikt olfactorische onderzoek, een van de belangrijkste dagelijkse problemen te voorkomen. Meeste onderdelen in contact komt met de geuren van glas, staal, teflon of PEEK en kan derhalve worden verwarmd tot ten minste 200 ° C, wat voldoende is om de meeste o verwijderendors behalve die met een bijzonder hoog kookpunt zoals lange keten feromonen. Omdat keerkleppen bevatten rubberdelen zij niet zo hoog te verwarmen en derhalve zijn de belangrijkste bron van besmetting daarom een bijzondere reinigingsprotocol werd ontwikkeld voor hen. Niettemin is het raadzaam om bij welke geuren een bepaalde terugslagklep is in contact komen houden. In geval van twijfel over de netheid vervangen.
Als compromis tussen gebonden assays en cohort experimenten Flywalk heeft natuurlijk ook een aantal nadelen ten opzichte van andere werkwijzen. Het paradigma is zeer efficiënt bij het gedrag ten opzichte van een veelheid van verschillende stimuli moet worden beoordeeld en vergeleken. Met name omdat de responstijd-loop van de 15 personen die slechts een puls van een bepaalde geur lijkt sterk op responstijd-cursussen verkregen in een volledige dataset (dwz 30 vliegen en 40 presentaties elk; figuren 2D, 2E bijvoorbeeld de hedonistische waardigheid van slechts één geur moet worden onderzocht. Ook de tijdsresolutie van visuele volgsystemen vaak lager dan die van de snelste bioassays zoals aangebonden vlucht of loopband. De kortste reactie vertragingen gerapporteerd in Drosophila-geur geleide gedrag ver beneden 100 msec na geur ontmoeting aangebonden paradigma 20,23 en dus binnen een tijdsvenster dat niet kan worden opgelost bij de analyse van de gegevens bij 10 Hz vallen. Echter, lokstof reacties in Flywalk beginnen meestal binnen de eerste 100-300msec (Figuur 3B), die goed is in lijn met de stijging van de wind vertragingen waargenomen in vrij vliegende vliegen 5. Het blijft dan ook worden nagegaan of dit verschil in reactie vertragingen in tethered paradigma ten opzichte van windtunnel en Flywalk wordt veroorzaakt door verschillen in ruimtelijke en / of temporele resolutie in visuele volgen paradigma of door een hogere staat van opwinding vliegen in de tethered situatie.
Samengevat, Flywalk is een no-choice bioassay, die de zeer gecontroleerde stimulus presentatie van aangebonden assays combineert met de efficiency van cohort experimenten regelmatig gebruikt in Drosophila neuroethology. Omdat dezelfde set van individuen kunnen worden aangevochten met een veelheid aan verschillende stimuli, zijn bijzondere kracht ligt in de statistische power bij het vergelijken van de reacties in de richting van verschillende stimuli. Daarnaast is het gebruik van het feit dat de stijging vliegt bovenwinds op ontmoeting van een aantrekkelijke geur en op deze manier ontkoppelt geur evaluatievan geurbron lokalisatie zonder de noodzaak voor een verloop als een directionele cue. Het moet dan ook bij uitstek geschikt om de optogenetische toolbox in Drosophila exploiteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Daniel Veit voor technische bijstand en Pedro Gouveia bij Electricidade Em Pò (electricidadeempo.net) voor het aanpassen van de tracking software voor onze eisen. We danken ook Tom Retzke voor ondersteuning tijdens het filmen proces. Deze studie werd ondersteund door het Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D.
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M.
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
