Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

RNAi-medieret Kontrol af aflatoksiner i Peanut: metode til at analysere Mykotoksin Produktion og transgenekspression i Peanut / Published: December 21, 2015 doi: 10.3791/53398
Automatic Translation
1, 1, 1
1National Peanut Research Laboratory, United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service

Summary

Vi demonstrere en metode til analyse af aflatoksiner og transgen ekspression i peanut frø, der indeholder RNA-interferens signaler til silencing aflatoksin-syntese gener i svampen Aspergillus flavus. RNAi-medieret kontrol af mykotoksiner i planter er ikke blevet rapporteret tidligere.

Abstract

Organisationen af ​​De Forenede Nationers Levnedsmiddel- og Landbrugsorganisation anslår, at 25% af afgrøder i verden er forurenet med aflatoksiner. Det repræsenterer 100 millioner tons fødevarer bliver ødelagt eller omdirigeret til ikke-konsum hvert år. Aflatoksiner er stærke kræftfremkaldende stoffer normalt akkumuleret af svampene Aspergillus flavus og A. parasiticus korn, nødder, rodfrugter og andre landbrugsprodukter. Silencing af fem aflatoxin-syntese gener ved RNA-interferens (RNAi) i jordnøddeplanter blev anvendt til at kontrollere aflatoksin akkumulering efter inokulering med A. flavus. Tidligere fandtes ingen metode til at analysere effektiviteten af ​​RNAi i de enkelte peanut transgene begivenheder, da disse normalt producerer få frø og traditionelle metoder til store markforsøg under aflatoksin-befordrende betingelser var ikke en mulighed. I marken, sandsynligheden for at finde naturligt forurenet frø ofte 1/100 til 1/1,000. Desuden er aflatoksinforureningen ikke jævnt fordelt. Vores metode bruger nogle frø pr transgen begivenhed, med små stykker forarbejdede for real-time PCR (RT-PCR) eller små RNA-sekventering, og for at påvise aflatoksin ophobning af ultra-performance væskekromatografi (UPLC). RNAi-udtrykkende peanut linjer 288-72 og 288-74, viste op til 100% reduktion (p≤0.01) i aflatoksin B 1 og B 2 sammenlignet med kontrollen, der akkumuleret op til 14.000 ng. G -1 af aflatoksin B 1, når inokuleret med aflatoxigenic A. flavus. Som reference, de samlede aflatoksiner tilladte til konsum i USA maksimale er 20 ng. G -1. Denne protokol beskriver anvendelsen af ​​RNAi-medieret styring af aflatoksiner i transgene peanut frø og metoder til evaluering. Vi mener, at dens anvendelse i avl af peanut og andre afgrøder vil bringe hurtige fremskridt på dette vigtige område af videnskab, Medicin og human ernæring, og vil bidrage væsentligt til den internationale indsats for at styre aflatoksiner og potentielt andre mykotoksiner i de store afgrøder.

Introduction

Ca. 4,5 milliarder mennesker er kronisk udsat for aflatoksiner 1, de mest magtfulde kræftfremkaldende stoffer er kendt i naturen 2. Disse mykotoksiner forurener 25% af fødevareafgrøder i verden 3, herunder majs, kassava, ris, nødder, korn og krydderier. 4.. Aflatoksiner årsag forkroebling hos børn 5, svække immunsystemet 6, er til stede i 58% af hepatocellulære-karcinomer i menneskelige biopsier 7,8, og dræbe hundredvis af mennesker i løbet af periodiske udbrud af aflatoksikose 9,10. Aflatoksiner er polyketid-afledte mykotoksiner normalt produceret af Aspergillus flavus og A. parasiticus; aflatoksiner B 1 og B2 fremstilles ved A. flavus, mens A. parasiticus producerer også G 1 og G2. Den kemiske struktur af disse forbindelser og et chromatogram, der viser deres separation ved UPLC er vist i figur 1.

Figur 1
Figur 1. Aflatoksiner og RNAi indsætte Top:. Kemiske struktur (venstre) og eksempel på kromatogram (til højre) af de fire mest almindelige polyketid-afledte aflatoksiner: B 1, B 2, G 1 og G 2, produceret af Aspergillus parasiticus, A . flavus producerer B 1 og B 2 Nederst: Skematisk af genfragmenter i RNAi konstruere p5XCAPD bruges til peanut transformation, tal under pile er gen-fragment accessionsnumre i Aspergillus flavus genomet;. PIV2: kartoffel intron; BP: basepar; RT_5X_1 og RT_5X_2:. Realtids-PCR-primer sites Klik her for at se en større version af dette tal.

Økonomiske tab i eksporten som følge af aflatoksiner i jordnødder alene overstige $ 450 mio dollars, hvis beregnet på grundlag af 4 ng. G -1 grænse for aflatoksin tilladt til konsum i EU 11. Aflatoksiner har været kendt i 60 år 12; Men selvom mange landbrugspraksis blev udviklet for at afbøde deres virkning, herunder anvendelse af andre svampestammer 13,14, findes der ingen ensartet metode til kontrol, og resistente plantesorter er ikke tilgængelige. Test plante kimplasma for resistens over for aflatoksiner er særlig vanskelig, fordi selv under gunstige forhold for patogen invasion, mykotoksin akkumulation er uforudsigelig, og følger ikke en normalfordeling. Således eksperimenter kræver normalt store plantning områder, hundreder af frø og flere prøver af 100-1,700 g for at reducere variation i data 15,16.

RNA-interferens varopdaget i 1998 17; og fordelene ved "tavshed" er ved at blive undersøgt i en række nye applikationer, f.eks., i menneskelige behandlingsformer mod brystkræft 18, levercancer 19, myeloid leukæmi 20, og i plantebeskyttelse mod insekter 21 og nematoder 22 metastatisk. I planter, kan RNA-interferens signalerne celle til celle, med små interfererende RNA (siRNA) og høj molekylvægt RNA er ansvarlig for den systemiske posttranskriptionel gendæmpning 23,24, selv inde svampepatogener, der er i tæt kontakt med plantevært 25. Effektiviteten af RNAi om plante-medieret inaktivering af svampe--patogen gener er blevet beskrevet i få plante pathosystems, for disse, visuel undersøgelse af symptomer i de overjordiske dele af planter (blade) tilladt sygdom kvantificering, dvs. oomycete Bremia i salat 26 , Puccinia i hvede Fusarium i banan 28. Meget vanskeligere er at evaluere RNAi effektivitet til at styre mykotoksiner i planter, især aflatoksiner i jordnødder som bladene viser ingen symptomer på infektion, organerne invaderet (frø) er under flere inches af jord, forekomsten af ​​infektion er uforudsigelig, og kun kemisk Analysen kan bestemme tilstedeværelsen af ​​aflatoksiner. Desuden har hver transgen begivenhed i peanut producerer normalt få frø (4-6 per plante); derfor, traditionelle test for en no-aflatoksin ophobning træk i store parceller, varig hele beskæring sæsoner, og bruge hundredvis af frø ikke er mulig. Fremgangsmåde beskrives her at analysere på mindre end en uge, RNAi peanut frø til tilstedeværelsen af ​​transgen og for en ikke-aflatoksin ophobning træk, der kun bruger få frø.

Protocol

1. Molekylær konstruere og Peanut Transformation

  1. Kombiner DNA-fragmenter af fem A. flavus gener, AFL2G_07223 (aflS eller aflJ), AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), AFL2G_07731 (pes1) og AFL2G_05027 (aflatoksin efflukspumpen, aflep). Til dette skal du bruge følgende primere og ultramers: DIR-1, Short-kat1-R, DIR-2-omvendt, Short-DIR2-R, DirAll-Nco-Rv og DirAll-BamEco-Fw, tabel 1.
    1. Gør DIR-1 dobbeltstrenget af 5 PCR-cykler (25 pi reaktion 95 ° C 2 min, efterfulgt af 5 cyklusser ved 94 ° C 45 sek, 55 ° C 30 sek, 68 ° C 15 sek) ved hjælp af DNA-polymerase ifølge producentens instruktioner og primer Short-kat1-R for at efterlade en 3 'udhæng CCCGT. Gentag disse trin for at gøre DIR-2-inverteret dobbelt streng ved hjælp af primer Short-DIR2-R for at efterlade en 3 'overhæng ACGGG supplement til DIR-1.
    2. Ligere to 199 bp fragmeNTS med T4 DNA-ligase ifølge producentens anvisninger. PCR amplificere det resulterende 393 bp fragment som angivet i 1.1.1 under anvendelse af primere DirAll-CACC-Fw og DirAll-Nco-Rv (tabel 1), og klone produktet under anvendelse af standardteknikker ind pENTR1A at gøre plasmid p2 + 4ENTR.
    3. Rekombinere p2 + 4ENTR ind pCAPD 29 (NCBI Accession: KC176455.1) under anvendelse af LR CLONASE II enzymblanding ifølge producentens instruktioner for at gøre plasmid p5XCAPD, og omdanne den til Escherichia coli DH5a under anvendelse af standardteknikker efterfulgt af delvis sekventering. Bemærk: Den komplette RNAi-insertet er vist i tabel 1.
  2. Transform Agrobacterium-stamme C58C1 30 med plasmid p5XCAPD som tidligere rapporteret 30, og bruge den resulterende bakterie at omdanne jordnøddeplanter som følger:
    1. Vokse ved 30 ° C Agrobacterium huser p5XCAPD, bruge til dette, 50 ml LB-suppe suppleret med 500pg ml -1 streptomycin, 25 pg ml -1 gentamicin, 10 ug ml -1 kanamycin og ryste kulturen ved 250 rpm, indtil den når en OD 260.
    2. Høste Agrobacterium cellerne ved centrifugering (6.000 xg) i 10 minutter, resuspender i 50 ml AB minimalt medium 31 med 100 pM acetosyringon i 1 time, og plads i bakteriesuspensionen eksplantaterne fra 10-14 dage gamle kimplanter Exp27-1516, runner -type peanut avlslinie. Blot tørre eksplantaterne på 3MM trækpapir efter 30 min, og placere dem på shoot-induktion medium (SIM) [MS salt 32, 3% saccharose, 20 uM benzylaminopurin (BAP), 10 uM thidiazuron (TDZ), pH 5,8, 0,3 % gellangummi] uden antibiotika i mørke i tre dage.
    3. Gør væv udvælgelse og regenerering som rapporteret før 33. Flyt væv til SIM (500 pM cefotaxim og 100 uM kanamycin) til skuddannelse, med bi-ugentlige overførsler i 2 måneder. Så stedekspanderende skud på shoot-forlængelse medium (SEM) [5 pM BAP, 1 pM gibberellinsyre (GA3)], hver anden uge i flere måneder.
    4. Placer enkelte skud, 2 cm i størrelse, i root-induktion medium (RIM) [1/2 MS, 1,5% saccharose, 5 uM α-naphthalen-eddikesyre (NAA), 2,5 uM indol-smørsyre (IBA)], derefter akklimatisere kimplanter og overføre dem til drivhuset.

2. Identifikation af Peanut Planter huser RNAi til Silence aflatoxin Synthesis Gener

  1. Brug anlæg mini kit i en robot arbejdsstation med 200 pi eluering ifølge producentens instruktioner til at udtrække DNA fra unge blade af jordnøddeplanter, der er underkastet processen med transformation (som tidligere beskrevet) med RNAi konstruktion p5XCAPD (figur 1), der har som rygrad plasmid pCAPD 29 for gendæmpning.
  2. Screen DNA prøver ved single-rør indlejret PCR (STN-PCR) som beskrevet tidli-gere 34 til at detektere den selekterbare markør NPTII og RNAi indsætte fra p5XCAPD. Klonisk forplanter fra nedskæringer (3-4 noder) PCR positive planter til at producere tilstrækkelige frø til test i denne første generation.
    1. Brug fire 2-folds fortyndinger af DNA (50-100 ng pi -1 før fortynding) i alle STN-PCR-reaktioner. For NPTII, bruger eksterne primere PCAPD 5714F: 5'-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3 'og PCAPD 6446R: 5'-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3', og interne primere PCAPD 5730F: 5'-ACTGGGCACAACAGACAATC-3 'og PCAPD 6249R: 5'-ATATTCGGCAAGCAGGCATC- 3 '.
    2. Til påvisning af RNAi indsætte i STN-PCR-reaktioner anvender eksterne primere 35S-PDSFw: 5'-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3 'og DirAll-Nco-Rv: 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3', og interne primere Probe_5027_Fw: 5'-gtatttgtgaccatgtttctg-3 'og Probe_7228_Rv: 5'-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3'.
  3. Harvest peanut bælg fra STN-PCR-positive planter og Den con kontrolsystemer planter dyrket under de samme betingelser. Afgørende skridt: Sørg for, at kontrol planter dyrkes i de samme betingelser og samme sæson som RNAi planter. Vand blast bælg med en højtryksrenser ved lav intensitet eller skrab med hånden for at fjerne exocarp, bestemme farven på den mesocarp ved at placere bælg på en løbetid bord og separate bælg i grupper (gul, orange, brun og sort) 35 (figur 2).

Figur 2
Figur 2. Fremstilling af peanut bælg til analyse. Venstre: Forskellige peanut størrelser findes ved høst som peanut er en ubestemt vækst plante; Center: placere peanuts i metal kurv til vandtryk fjernelse af exocarp, højre: modenhed grupper efter mesocarp farve på en peanut profil bord (gul, orange, brun og sort).98fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Eksperimentel opsætning

  1. Fjern skrog, proces gul og brune frø separat. Beregn antallet af frø til brug i eksperimentet henhold til tabel 2. Bemærk, at mindst tre frø stykker (1 frø stykke = halv cotyledon) pr peanut linje og dato prøvetagning er forpligtet til statistisk analyse og reducere standardafvigelsen.
Navn Sekvens
DIR-1 5'
GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT
CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG
TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC
ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCACGCATC
ACTTGGGGTACCCGT-3 '
Short-kat1-R 5'-Phos-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3 '
DIR-2-inverteret 5'GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG
TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGCCTGGACGGATAG
TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG
AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG
CTGTTGATAGACGGG-3 '
Short-DIR2-R 5'-Phos-CTATCAACAGCAACACAACC-3 '
DirAll-CACC-Fw 5'-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 '
DirAll-Nco-Rv 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3 '
DirAll-BamEco-Fw 5'-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 '
Komplet RNAi indsats 5'GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT
CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC / GTATTTG
TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC
ATTCCCCAGATCACGGACGAAT / CCCCTGCATCTACGCGCACGCAT
CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT
GCG / GCTCAATCAAGGCAACTCTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG
GATTTTGTTCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA / GGCCACGG
TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG
TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3 '

. Tabel 1. oligonukleotider og ultramers anvendes til at bygge RNAi konstruere p5XCAPD Phos: phosphoryleret 5'-enden; "/" Adskiller de fem genfragmenter anvendes; Komplet RNAi insert: sekvensen anvendt som 2 inverterede gentagelser til dannelse p5XCAPD.

  1. Placer hele peanut frø i et enkelt lag, så de dækker bunden af ​​en steril bægerglas. Tilføj 75% ethanol / vand (v / v) opløsning til at dække frøene og derefter tilføje et lige så stort volumen af ​​den samme opløsning. Inkuber ved stuetemperatur i 30 sek og derefter skylles med sterilt deioniseret vand (SDW).
  2. Tilsæt 2% hypochlorit til bægerglasset, der indeholder ethanol behandlede frø som følger: Tilsæt nok 2% hypochloritopløsning at dække frøene, hvorefter der tilsættes et lige så stort volumen af ​​den samme opløsning og inkuberes i 5 minutter. Afgørende skridt: Skyl grundigt tre gange med et volumen på SDW svarende til 5 gange mængden af hypochlorit anvendt (Figur 3).

Figur 3
Figur 3. Eksperimentel opsætning. Top: Surface sterilisering af peanut frø før og efter hypochlorit, fjernelse af frøskaller (TESTA), Mellemøsten: fjernelse af embryo og tæt visning af embryo, derefter skæres cotyledon i halve, Nederst: halv kimblade i sterilt destilleret vand, duppe på steril absorberende papir, buler på vandet agar og placering af halv kimblade (skåret side opad) på agaroverfladen. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Tillad overfladeaktive steriliserede frø at indsuge nedsænket i SDW i 2 timer. Placer frøene på et sterilt petriskål, fjerne frøskaller med en pincet, adskille kimbladene, og med en skalpel flytte embryoner. Note:Embryoner kan kasseres eller anvendes til at regenerere nye anlæg.
  2. Skær hver kimblad i halve ved hjælp af en skalpel. For at undgå dehydrering, holde de udskårne stykker frø i sterilt vand, indtil alle frøene behandles.
  3. Har fremstillet Petriskåle indeholdende sterilt vand agar (1,5% agar / vand; w / v), én for hver tre frø stykker. Lav små buler i agar med pincet, kort skamplet det overskydende vand af frø stykker på sterile papirservietter, og derefter placere frø stykker (skåret ansigt opad) på vandet / agarplader.
  4. Fra en frisk kultur af Aspergillus flavus aflatoxigenic NRRL 3357 i Czapek agarmedium dyrket ved 25 ° C i 10 dage, fremstille en suspension af 50.000 sporer per pi SDW, optalt med et hæmocytometer.
  5. Placer 2 ul af sporesuspensionen på de afskårne overflader af hver halve cotyledon stykke undgå afstrømning på siderne, for at sikre sporerne blive udsat for frøet væv, der huser RNAi (figur 4).

    Figur 4
    Figur 4. Podning og inkubation til aflatoksinanalyser. Top: Halvdelen cotyledon, podning med sporesuspension, og Aspergillus flavus mycelievækst på halv cotyledon efter 24 timers inkubation Nederst: venstre:. Inkubation af 48 timer på 1,5% agar; centrum: inkubation i 72 timer på 1,5% agar; højre:. eksempel på forkert forsøgsopstilling, inkubation i 72 timer på 0,5% agar Klik her for at se en større version af dette tal.

    1. Inkuber petriskåle indeholdende inokulerede og ikke-inokulerede halve kimblade ved 30 ° C i mørke indtil prøveudtagning.

    4. Stikprøver af aflatoxin Analyse og Gene Expression

    1. Indsamle prøver itredobbelte ved 24, 48 og 72 timer (valgfrit 96 timer) inkubation, både for RT-PCR og til aflatoksinanalyser, hver gentagelse er ét stykke (halv kimblad). Pluk prøver tilfældigt forskellige plader på hver dato prøveudtagning. Ved hjælp af et væv, blidt fjerne agar og overskydende svampesporer før placere frø stykker i hætteglas eller reagensglas.
    2. Til aflatoksinanalyser, placere hver gentagelse (i ét stykke) i et 4 ml hætteglas med skruelukke og opbevares ved -80 ° C. Bemærk: På grund af den kemiske stabilitet af aflatoksiner, kan prøverne opbevares i denne tilstand i flere måneder (i de nuværende eksperimenter normalt 1-2 måneder).
    3. For RT-PCR sted hver gentagelse (i ét stykke) i allerede forberedt 2 ml formaling rør indeholdende to rustfrit stål kugler (2,5 mm i diameter) og tre zirconium perler (2 mm i diameter).
    4. Umiddelbart fryse (helst i flydende kvælstof) alle prøver og holde dem ved -80 ° C indtil forarbejdning.

    5. Aflatoxin Analyse af Individuelle Half Cotyledon Pieces

    1. Brug A. flavus podet prøver til denne analyse. Bring prøver til stuetemperatur i ca. 30 min, add fire bind (normalt 2-3 ml; w / v) methanol (holde rekord for senere beregninger), lukke hætterne, og inkuber O / N (~ 16 timer) i mørke uden omrøring.
    2. Placer en fritte i en matchende 1,5 ml propylen minisøjle, tilsættes 200 mg grundlæggende Al 2 O 3 og cap det med en anden fritte som beskrevet tidligere 36; derefter placere en Ultra-High Performance Liquid Chomatographer (UPLC) autoprøveudtagningshætteglas i kolonnen tæt nok til at undgå mulig fordampning af eluatet.
    3. I en engangs glas reagensglas (brug ikke plastik), placere 0,5 ml af methanol ekstrakt opnået i trin 4.1, tilsættes 0,5 ml acetonitril, bland med pipette og anvende 0,5 ml af blandingen i kolonnen forberedt i trin 4.2. Tillad eluering i autoprøveudtagningshætteglas af tyngdekraften (gælder ikke tryk). Eluering tager normalt 2-4 min, tæt the hætteglasset umiddelbart anvendelse af en UPLC kompatibel hætte med septa. Opbevar hætteglassene ved stuetemperatur og analysere dem samme dag på en UPLC.
    4. Til adskillelse af aflatoksiner, sted autosampler indeholdende prøve eluater og autosampler med aflatoksin standarder (B 1 og B 2 ved brug af A. flavus) i en UPLC instrument udstyret med en matchende UPLC Kvartær Solvent Manager UPLC Sample Manager UPLC Fluorescent Detector, og en C18 2,1 mm x 50 mm, 1,7 um kolonne.
      1. Brug en isokratisk mobil fase bestående af vand / MeOH / CH3CN (64:23:13, v / v / v) blanding ved strømningshastighed på 0,30 ml min-1. Anskaf kromatogrammer der sikrer en stabiliseret baseline adskillelse for nøjagtig beregning af aflatoksin koncentration, i henhold til producentens anvisninger 37.
      2. Bekræfte identiteten af aflatoksiner ved at opnå deres masse-spektrale data og sammenligne dem med offentliggjorte data 38. Brug en ipå trap massespektrometer udstyret med en ESI interface og tilhørende software i henhold til producentens anvisninger.
    5. Bestem koncentrationer af aflatoksiner ved henvisning til kalibreringskurver opnået ved at injicere forskellige mængder af tilsvarende kommercielle standarder for aflatoksiner B 1, B 2, G 1 og G 2 som foreslået af UPLC fabrikanten og bestemmes af softwaren 37.
    6. Sted frø stykker allerede ekstraheret med methanol, i individuelle hætteglas til O / N (~ 16 timer) lyofilisering for at bestemme deres tørvægt. Derefter beregner aflatoksin koncentrationen i ng. G -1 af tørvægt stykke frø.
    7. Til analyse af data, konvertere aflatoxin resultater at logge (ng. G -1 +1), efterfulgt af Tukey test for gennemsnitlige sammenligninger.

    6. genekspression, RT-PCR behandling af prøver

    1. Tag 2 ml slibning rør indeholdering prøver fra -80 ° C fryser, og umiddelbart (uden optøning) male dem i en perlemølle homogenisator ved 3.100 rpm i 40 sek, derefter gå videre til RNA-ekstraktion under anvendelse af Trizol ifølge producentens anvisninger.
    2. Forbered cDNA fra hver prøve ved anvendelse af 1 ug RNA og lige store mængder af oligo dT og tilfældige hexamerer, at en 1: 8 fortynding af cDNA og bruge 2 pi per reaktion i RT-PCR (som tidligere beskrevet 39).
      1. Til påvisning af ekspression af RNAi insert brug primere: RT_5X_1_105F: 5'GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3 ', RT_5X_1_232R: 5'-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3'; og RT_5X_2_95F: 5'-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3 ', RT_5X_2_229R: 5'-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3'.
      2. Til påvisning af ekspression af den selekterbare markør NPTII, brug primere: RT_NPTII_1_6871F: 5'-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3 ', RT_NPTII_1_7004R: 5'-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3'. Brug husholdning genet Actin for standardisering, og primere: Actin-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG; Actin-Rv: CCAAGGCAACATATGCAAGCT 40.
    3. Analyser resultater efter Delta-delta K T metode 41 standardiseret for Actin udtryk. Repræsenterer resultaterne som fold forøgelse i forhold til kontrollen.

Representative Results

Plasmid p5XCAPD blev lavet som et derivat af pCAPD 29, og brugte det til at transformere peanut planter; Denne vektor bærer omvendte gentagelser af fem små fragmenter, 70-80 bp hver, af aflatoksin-syntese-generne fra A. flavus adskilt af en intron (figur 1). Fragmenter af AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (aflS eller aflJ), AFL2G_05027 (aflatoksin efflukspumpen, aflep), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), og AFL2G_07731 (pes1) blev anvendt til konstruktionen, numre på figur 1 svarer til A . flavus genom annotation i BROAD Institute, Cambridge, MA, og litteraturen 42. I alt 99 peanut linjer blev regenereret efter at gå gennem transformationsprocessen, 50 var PCR-positive for NPTII opdaget af STN-PCR, og 33 linjer var PCR-positive og produceret frø. Kun syv PCR positive linjer blev klonalt formeres og testet af Present fremgangsmåde til aflatoksin ophobning, alle syv viste mellem 60% og 100% mindre aflatoksin ophobning end kontrollen. Her viser vi resultaterne af to af disse syv linjer. Som individuelle transgene begivenheder normalt producerer nogle frø blev en metode udviklet til at bruge et minimum antal frø, mens du stadig være i stand til at gøre parametrisk statistisk analyse. Et rutediagram af prøvefremstilling og forsøgsopstilling er vist i figur 5 og tabel 1. Selvom den første generation af transgene frø er typisk hemizygote, forventes det, at celle-til-celle og systemisk bevægelse af små interfererende RNA (siRNA), der genereres gennem RNA-interferens bør give aflatoksin-syntese lyddæmpning i hele planten.

Figur 5
Figur 5. Skematisk rutediagram af metoden til at analysere effektiviteten af RNAi i tavshed Aspergillus aflatoxin-syntese gener i peanut frø. Grafisk repræsentation af arbejdsgangen, når de behandler peanut prøver til genekspression eller aflatoksinanalyser. Klik her for at se en større version af dette tal.

RNAi peanut linjer 288-72 og 288-74 viste tilstedeværelsen af NPTII selekterbare maker, når testet ved STN-PCR, er gel sektioner vist i figur 6 (øverst), originale billeder er tilgængelige fra forfatterne efter anmodning. Plasmid pCAPD blev ikke brugt som en kontrol transformation, da det koder inverterede gentagelser af to gener CMR (chloramphenicolresistens) og CCDB (toksin) af ukendt effekt på planter. PCR-negativ peanut linie 288-9 og andre, som gik gennem revitalisering proces, og blev dyrket i de samme betingelser som RNAi linjer, blev brugt som negativ conkontrol.

Figur 6
. Figur 6. Påvisning af transgene og Real Time udtryk for RNAi insert Top: Single-rør, nested PCR påvisning af transgene peanut linjer RNAi-288-72 og RNAi-288-74, positive planter. Kontrol: W (vand), PP (positiv plante), MM (Master mix), s (plasmid p5XCAPD); fraktioner 1/2 1/4 1/8 1/16 repræsenterer 2-folds fortyndinger af DNA Bottom:. Real-Time PCR påvisning af ekspression af RNAi indsætte (primersæt: RT_5X_1, RT_5X_2, som i figur 1, på umodne ( gul) og modne (brun) kimblade af transgene linjer ved 24 og 48 hr inkubation, grå linje: C T = 1. histogrammer repræsenterer de midler og standard fejlsøjler (T) af tre biologiske prøvermed tre tekniske gentagelser. Den relative kvantificering af RNAi insert blev normaliseret i forhold til husholdning gen Actin som en intern kontrol og sammenlignende fold udtryk for transgen beregnet som beskrevet i 5.2.2, og 5.3. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at teste effektiviteten af anlægget-host RNAi-medieret potentiale styring af aflatoksin ophobning, blev friskhøstede konidier af Aspergillus flavus NRRL 3357 anvendes på snitfladen af halve kimbladene hvorfra embryoner og frøskal var blevet fjernet (fig 3, 4). A. flavus NRRL 3357, for hvilken genomet er blevet sekventeret og var grundlag for at designe p5XCAPD, blev venligst stillet til rådighed af Dr. Horn på USDA-ARS-NPRL. Den resulterende fungal invasion af halv kimblad efter 24, 48 og 72 timer ved 30 ° C er show n i figur 4. Prøver af inokulerede halv kimblade blev opsamlet ved 24, 48, 72, 96 timer af inkubation og analyseret for de vigtigste fire aflatoksiner B 1, B 2, G 1 og G 2 under anvendelse UPLC og bekræftet ved LC-MS ; Resultaterne er vist i figur 6. Aflatoxin koncentrationer blev bestemt ved anvendelse af en offentliggjort fremgangsmåde med modifikationer 36. Ved 96 timers inkubation, kimbladene begynder at gå i opløsning på grund af svampeinfektion. RNAi linje 288-72 udstillet betydeligt lavere niveauer af aflatoksiner end kontrol på alle prøveudtagning datoer i umodne kimblade og i de fleste prøveudtagning datoer i de modne dem. RNAi linje 288-74 viste signifikant lavere niveauer af aflatoksiner på de fleste datoerne for prøvetagningen. Signifikansniveauer af Tukey test er angivet med en asterisk i grafikken i figur 7.

g7.jpg "/>
. Figur 7. aflatoksiner B 1 og B2 i halve peanut kimblade efter inkubation (24, 48, 72 og 96 timer) med Aspergillus flavus Control: frø af 288-9 ikke-transgen linje; RNAi: frø fra RNAi-288-72 og RNAi-288-74, transgene for RNAi p5XCAPD til tavshed fem aflatoxin-syntese gener. (A) Aflatoksin B 1 i modne frø (brun); (B) Aflatoksin B 2 modne frø; (C) Aflatoxin B 1 i umodne frø (gul) og (D) aflatoxin B2 i umodne frø. Middelværdier med de tilsvarende standardfejllinjer (T) af dobbeltbestemmelser biologiske prøver er repræsenteret. Statistisk signifikante forskelle Tukey test *: P ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001.s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Samlet, RNAi-288-72 viste under hele eksperimentet (24 til 96 timers inkubation), en -100% reduktion i aflatoxin B 2 94%, og en -100% reduktion i aflatoxin B 1 90% sammenlignet med kontrollen. RNAi-288-74 viste en -100% reduktion 63% i aflatoxin B 2 og 60% -100% reduktion i aflatoxin B 1, figur 7.

Primere anvendt til Real-Time PCR påvisning af ekspression af RNAi indsatsen er vist i figur 1. Peanut-frø kimbladene blev analyseret uden embryoner, at fjerne deres naturlige forsvar og være i stand til at opdage den potentielle effekt af RNAi på området mest udsat for fungal invasion, kimbladene. Ekspression af RNAi indsatsen påvist i umodne kimblade (gul) af linje 288 til 74 af primer sæt RT_5X_1 var fire gange over C T (figur 1, 6). Ekspression af RNAi insert blev ikke påvist i modne kimblade ved 24 timer, eller på modne eller umodne kimblade ved 48 timers inkubering, figur 6 (nederst).

Peanut Linje Tidspunkt for prøvetagning Prøver til RT-PCR Prøver for aflatoksin analyse (podet) Nsortjord af frø
(ikke podede)
Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3
RNAi (gul) 24 timer 1 1 1 1 1 1 4,5
48 timer 1 1 1 1 1
72 timer 1 1 1 1 1 1
Kontrollere 24 timer 1 1 1 1 1 1 4,5
(gul) 48 timer 1 1 1 1 1 1
72 timer 1 1 1 1 1 1

Tabel 2. Eksempel på små-sample setup til at analysere genekspression og aflatoksin ophobning i RNAi peanut frø. Komplet analyse af udtryk og aflatoksiner for én årgang (dvs.., Gul), med tre prøveudtagning (24, 48 og 72 timer) , i tre eksemplarer, ville kræve 4,5 frø, hver nummer et i tabellen udgør halvdelen cotyledon.

Discussion

Plant-host RNAi-medieret inaktivering af gener i svampepatogener er påvist 27,43, men der er ingen publikationer, der viser muligheden for RNAi-medieret kontrol med mycotoxin akkumulering i planter. Én begrænsende faktor for disse undersøgelser i peanut var manglen på en metode til at vurdere en no-aflatoksin ophobning fænotype i de enkelte planter, som blade viser ingen symptomer upon svampeinfektion af underjordiske bælg. Desuden har de ikke-normalfordelt ophobning af aflatoksiner, og behovet for store prøver til kemisk analyse 15,16 hindret kvantificering af potentielle RNAi effekt på en enkelt plante. Metoden præsenteres her består af 72 timer forsøg under anvendelse af fem frø til at udføre tre 24 h-interval prøvetagninger i tre eksemplarer (tabel 1, figur 7). Sammenlignet med den typiske aflatoksinanalyser, der kræver ikke mindre end 100 g frø, vores metode er særligt velegnet til individual transgene begivenheder peanut planter, som oprindeligt producerer ikke mere end to eller tre bælg.

RNA-medieret dæmpning af aflatoksin syntese er blevet påvist ved genetisk transformation af Aspergillus flavus og A. parasiticus. Da aflR er en vigtig regulator af aflatoksin produktion i A. flavus og A. parasiticus 44,45, bliver det et interessant mål for RNA-medieret inaktivering i planter. Imidlertid har genetiske variationer i aflR påvist blandt Aspergillus arter 46 og disse genetiske varianter kunne undslippe silencing hvis der ikke er perfekte sekvens matcher med RNAi signal frembragt i planteværten. Således aflR var et af de mål for tavshed i vektor p5XCAPD, men var ikke den eneste. Inverterede gentagelser af aflR genet indført i A. flavus og A. parasiticus ved omdannelse resulterede i at lukke munden og minimal eller ingen produktion af aflatoksiner 47 (McDonald et al., 2005b). Også silencing AFLD gen forhindret aflatoksin produktion med op til 98% i A. flavus og A. parasiticus i direkte transformation 48. For at øge sandsynligheden for succes i vores system blev peanut transformeret med inverterede gentagne fragmenter af fem gener involveret i aflatoksin produktion i A. flavus. Her er det vist, at brug af p5XCAPD, der er målrettet til at lukke munden på flere gener i aflatoksin syntesevejen, 90% -100% lavere niveauer af aflatoksin B 1 og B 2 blev opnået på linje 288-72, og 60-100% lavere niveauer akkumuleret i line 288-74 sammenlignet med kontrollen, når halvdelen kimbladene blev podet med A. flavus, figur 4, 7. Vigtigst er det, denne metode påvises statistisk signifikante forskelle i aflatoxin ophobning af linjer 288-72, 288-74 vs. kontrol under hele forsøget ved anvendelse af parametrisk statitics, figur 7. I betragtning af den lille stikprøve, er det vigtigt at fremhæve behovet for at bruge en kraftfuld metode til at opdage aflatoksiner, blev disse eksperimenter analyseret af UPLC som har en høj opløsning, fem gange højere ydeevne og tre gange højere følsomhed end HPLC 49.

Ekspression af RNAi insertet i 288-74 blev kun fundet i umodne kimblade (gul) ved 24 timers inkubation. RNAi insert blev ikke detekteret ved RT-PCR på modne kimblade af 288-74 på 24 timer, eller på en årgang på 48 timer, figur 6. Det samme fænomen blev observeret i andre RNAi transgene peanut linjer (Arias, RS, 2015 upubliceret), hvor normalt RNAi udskrifter kun blev fundet på umodne kimblade på 24 timer. RNA-prøver blev behandlet med DNAse inden cDNA-syntese, data blev normaliseret til niveauet af actin ekspression og ingen tegn på DNA-kontaminering blev observeret. Skulle DNA har været til stede i prøverne, bør deter blevet påvist i de 48 timers prøver så godt, men konsekvent det var ikke tilfældet. Ekspression under kontrol af 35S-promotoren er ikke altid ensartet; Det kan blive påvirket af miljøforhold 50, vævstype og udviklingsstadiet 51,52. Samtidig, i vejen for RNA-interferens, kan hastigheden af mRNA forfald og hastigheden af siRNA henfald variere betydeligt 53. Det er muligt, at den hurtige nedbrydning af mRNA ved mekanismen af ​​RNA-interferens kunne have forhindret mRNA detektion ved 48 timers inkubation. Uanset om fravær af udtryk på 48 timer var på grund af lave 35S-promotor drevet transskription eller til hurtig nedbrydning af dsRNA ved Dicer mangler at blive besvaret. Således ville detektering af små RNA'er af high throughput sekventering give et bedre indblik i de processer, der finder sted via RNAi 54 i disse forsøg. Men da RNA nedregulering spreder systemisk, hovedsageligt gennem Phloem fra photosynthader kilder til saccharose dræn (i dette tilfælde peanut frø) 55, undertrykkelse af aflatoxin-syntese kan forekomme i frø uden lokal udtryk for RNAi indsatsen. Megen forskning mangler at blive gjort for at bestemme tærskelværdien af ​​små interfererende RNA (siRNA'er) er nødvendige for at forhindre, at aflatoksin ophobning i frø. Det er vigtigt at understrege, at både mRNA ekspression af RNAi konstruktion (figur 6), og akkumulering af aflatoksiner B 1 og B2 (figur 7) viste forskellige resultater for umodne (gul) vs. moden (brun) kimbladene. Peanut planter har ubestemmelig vækst, det vil sige, de præsenterer ved høst en række løbetider bælg, figur 2. Desuden frø fra forskellige løbetider grupper er forskellige i deres kemiske sammensætning, f.eks., 2,4% saccharose i umodne frø, og 1,9% i modne frø under samme markforhold 56,57. Således at forstå den faktiske efficiency af RNA-medieret kontrol af aflatoksin ophobning, er det vigtigt at analysere modenhed grupper hver for sig.

En naturlig forsvar for peanut frø er produktion af phytoalexiner, som varierer i mangfoldigheden af forbindelser, der produceres og deres relative mængder afhængigt af modenhed af frø og miljøforhold 58-61, og det er særligt højere i embryoner end kimblade 62. Embryoner har også signifikant højere koncentrationer af nukleinsyrer, både DNA og RNA end kimbladene (Arias RS, upublicerede). Som peanut frø modnes, ændringer i deres fysiologi og kemiske sammensætning forekomme 63. Phenoliske antioxidanter i peanut testa danner kondenserede tanniner med fungistatisk aktivitet 64; det er også tydeligt i den mesocarp farve, der afspejler etaper løbetid, gul til sort 35, da dens indhold af tanniner og phenolforbindelser stiger med løbetiden 65. Således tilstedeværelsen af ​​tESTA eller embryoner i forsøget på grund af deres antimikrobielle egenskaber, kunne have begrænset svampevækst og dermed overvurderet effekten af ​​RNAi lyddæmpning derfor blev de fjernet. Også fjernelse af TESTA og embryoner hjælper begrænse kilder til variation i analysen, da den halve cotyledon der bærer embryo vil have flere phytoalexiner og mere RNA indhold.

Ud over analyse ved modenhed grupper og fjernelse af Testa embryo i disse eksperimenter, er det vigtigt at påpege nogle flere observationer: a) selvom resultaterne er vist i op til 96 timers inkubering, anbefales det at anvende ikke mere end 72 hr at opnå ensartede resultater, som frø bliver nedbrudt af 96 timer; og b) henviser til halv kimblade fra samme frø, selvom udvalgt tilfældigt, udgør ikke perfekt uafhængige stikprøver, RT-PCR og aflatoksin ophobning inden transgene begivenheder viste minimale variation mellem frø. Også en nøjagtig fungal spore noget, podevolumens af 2 pi, og anvendelse af sporer på snitfladen af ​​kimbladene undgå dryp på siderne er vigtigt at sørge for de spirede sporer er udsat for plantevævet. Vand / agar på pladerne bør være på 1,5% (w / v), blødere agar forårsager afstrømning af sporer, som vist på det sidste billede i figur 4 (nederst). Skal frø ledighed fra et bestemt transgen begivenhed begrænses, kan prøveudtagningen ske i to eksemplarer i stedet for tredobbelte opnå lignende resultater (dvs. figur 7); dog vil tredobbelte prøver at reducere standardafvigelsen. Den eneste begrænsning ved denne metode er, at det kræver en meget følsomt system (UPLC) for aflatoksin påvisning / kvantificering, men samtidig reducerer dette sandsynligheden for at overvurdere effekten af ​​RNAi bør aflatoksiner ikke påvises ved mindre følsomme metoder.

Afslutningsvis denne metode giver for første gang en pålidelig metode til at undersøgevirkningen af ​​RNAi i kontrollen med aflatoksiner. Reducere den tid til et eksperiment fra en hel beskæring sæson til mindre end en uge, vil denne metode uhyre fremskynde forskningen i RNAi-peanut / Aspergillus pathosystem mod afbødning og / eller eliminering af aflatoksiner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primers, oligonucleotides DNA Technologies, Coralville, IA, USA n/a
Dneasy Plant Mini Kit Qiagen, Valencia, CA 69106
Czapek Dox agar medium Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA CM0095
Agar Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA BP 1423
Freezer -80 °C n/a n/a
Aluminum Oxide, Al2O3 Fisher Scientific A941
SPE Reservoirs 1.5 ml Grace Davison Discovery Scientific 210011
Frits for 1.5 ml SPE reservoir Grace Davison Discovery Scientific 211401
Autosampler vials Waters Corporation, Milford, MA 186005221
Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1 mm x 50 mm, 1.7 mm column Waters Corporation, Milford, MA
Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software Thermo Electron Corp., San Jose, CA
Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A6636; A9887; A0138; A0263
Systat Software 12.2 SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA
Trizol reagent Invitrogen, CA 15596-018
SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix Invitrogen, CA 11752-050
ABI 7500 Real-Time PCR Lifetechnologies, Grand Island, NY 4406984
Luria Broth-Miller Fisher Scientific R453642
pENTR1A Invitrogen, CA A10462
LR Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11791-020
T4 DNA Ligase NEB Biolabs M0202L
Gelrite Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1919
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406
QIAcube robot workstation Qiagen, Valencia, CA 9001292
Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin Goldbio, St. Louis, MO cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen, CA 11304-029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, J. H., et al. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. The American Journal of Clinical Nutrition. 80, 1106-1122 (2004).
  2. American Association for Cancer Research: AACR. An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20. Cancer Research. 40, 1-12 (1980).
  3. Turner, P. C. The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth. Scientifica. , (2013).
  4. Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells. Toxins (Basel). 5, 1447-1461 (2013).
  5. Gong, Y. Y., et al. Determinants of aflatoxin exposure in young children from Benin and Togo, West Africa: the critical role of weaning. International Journal of Epidemiology. 32, 556-562 (2003).
  6. Eaton, D. L., Groopman, J. D. The toxicology of aflatoxins: human health, veterinary, and agricultural significance. , Academic Press. (1994).
  7. Murugavel, K. G., et al. Prevalence of aflatoxin B1 in liver biopsies of proven hepatocellular carcinoma in India determined by an in-house immunoperoxidase test. Journal of Medical Microbiology. 56, 1455-1459 (2007).
  8. Wang, J. S., et al. Hepatocellular carcinoma and aflatoxin exposure in Zhuqing Village, Fusui County, People's Republic of China. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 10, American Association for Cancer Research. 143-146 (2001).
  9. Azziz-Baumgartner, E., et al. Case-control study of an acute aflatoxicosis outbreak, Kenya, 2004. Environmental Health Perspectives. 113, 1779-1783 (2005).
  10. Lye, M. S., Ghazali, A. A., Mohan, J., Alwin, N., Nair, R. C. An outbreak of acute hepatic encephalopathy due to severe aflatoxicosis in Malaysia. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 53, 68-72 (1995).
  11. Villers, P. Aflatoxins and safe storage. Frontiers in Microbiology. 5, 158 (2014).
  12. Kensler, T. W., Roebuck, B. D., Wogan, G. N., Groopman, J. D. Aflatoxin: A 50-year odyssey of mechanistic and translational toxicology. Toxicological Sciences. 120, S28-S48 (2011).
  13. Dorner, J. W., Cole, R. J., Wicklow, D. T. Aflatoxin reduction in corn through field application of competitive fungi. Journal of Food Protection. 62, 650-656 (1999).
  14. Cotty, P. J., Bhatnagar, D. Variability among atoxigenic Aspergillus flavus strains in ability to prevent aflatoxin contamination and production of aflatoxin biosynthetic-pathway enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2248-2251 (1994).
  15. Whitaker, T. B. Standardisation of mycotoxin sampling procedures: an urgent necessity. Food Control. 14, 233-237 (2003).
  16. Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots. Peanut Science. 31, 59-63 (2004).
  17. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  18. Rafael, D., et al. EMT blockage strategies: Targeting Akt dependent mechanisms for breast cancer metastatic behaviour modulation. Current Gene Therapy. , (2015).
  19. Li, G., Chang, H., Zhai, Y. P., Xu, W. Targeted silencing of inhibitors of apoptosis proteins with siRNAs: a potential anti-cancer strategy for hepatocellular carcinoma. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention: APJCP. 14, 4943-4952 (2013).
  20. Koldehoff, M. Targeting bcr-abl transcripts with siRNAs in an imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patient: challenges and future directions. Methods in Molecular Biology. 1218, 277-292 (2015).
  21. Zhang, J., et al. Pest control. Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids. Science. 347, 991-994 (2015).
  22. Ajjappala, H., Chung, H. Y., Sim, J. S., Choi, I., Hahn, B. S. Disruption of prefoldin-2 protein synthesis in root-knot nematodes via host-mediated gene silencing efficiently reduces nematode numbers and thus protects plants. Planta. 241, 773-787 (2015).
  23. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annual Review of Genetics. 41, 305-330 (2007).
  24. Vazquez, F., Hohn, T. Biogenesis and biological activity of secondary siRNAs in plants. Scientifica. , Hindawi Publishing Corporation. (2013).
  25. Tinoco, M. L. P., Dias, B. B. A., Dall'Astta, R. C., Pamphile, J. A., Aragao, F. J. L. In vivo trans-specific gene silencing in fungal cells by in planta expression of a double-stranded RNA. BMC Biology. 8, (2010).
  26. Govindarajulu, M., Epstein, L., Wroblewski, T., Michelmore, R. W. Host-induced gene silencing inhibits the biotrophic pathogen causing downy mildew of lettuce. Plant Biotechnology Journal. , (2014).
  27. Yin, C., Jurgenson, J. E., Hulbert, S. H. Development of a host-induced RNAi system in the wheat stripe rust fungus Puccinia striiformis f. sp. tritici. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24, 554-561 (2011).
  28. Ghag, S. B., Shekhawat, U. K., Ganapathi, T. R. Host-induced post-transcriptional hairpin RNA-mediated gene silencing of vital fungal genes confers efficient resistance against Fusarium. wilt in banana. Plant Biotechnology Journal. 12, 541-553 (2014).
  29. Filichkin, S. A., et al. Efficiency of gene silencing repeats vs. transitive RNAi in Arabidopsis: direct inverted vectors. Plant Biotechnology Journal. 5, 615-626 (2007).
  30. Sciaky, D., Montoya, A. L., Chilton, M. D. Fingerprints of Agrobacterium Ti Plasmids. Plasmid. 1, 238-253 (1978).
  31. Clark, D. J., Maaloe, O. DNA Replication and Division Cycle in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 23, 99-112 (1967).
  32. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plantarum. 15, 473-497 (1962).
  33. Srinivasan, T., Kumar, K. R. R., Kirti, P. B. Establishment of efficient and rapid regeneration system for some diploid wild species of Arachis. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 101, 303-309 (2010).
  34. Gomes, A. L. V., et al. Single-tube nested PCR using immobilized internal primers for the identification of dengue virus serotypes. Journal of Virology Methods. 145, 76-79 (2007).
  35. Williams, E. J., Drexler, J. S. A non-destructive method for determining peanut pod maturity. Peanut Science. 8, 134-141 (1981).
  36. Sobolev, V. S., Dorner, J. W. Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography. Journal of AOAC International. 85, 642-645 (2002).
  37. Empower Software, Getting Started Guide. , Waters Corporation. Milford, MA. Available from: http://sites.chem.colostate.edu/diverdi/C431/experiments/high%20pressure%20liquid%20chromatography/references/Empower%20getting%20started%2071500031203rA.pdf (2002).
  38. Biselli, S., Hartig, L., Wegner, H., Hummert, C. Analysis of Fusarium. toxins using LC-MS-MS: Application to various food and feed matrices. LC GC North America. 23, 404-413 (2005).
  39. Arias, R. S., Sobolev, V. S., Orner, V. A., Dang, P. M., Lamb, M. C. Potential involvement of Aspergillus flavus laccases in peanut invasion at low water potential. Plant Pathology. 63, 353-363 (2014).
  40. Dang, P. M., Chen, C. Y., Holbrook, C. C. Evaluation of five peanut (Arachis hypogaea) genotypes to identify drought responsive mechanisms utilising candidate-gene approach. Functional Plant Biology. 40, 1323-1333 (2013).
  41. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C-T method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
  42. Amaike, S., Keller, N. P. Aspergillus flavus. Annual Review of Phytopathology. 49, 107-133 (2011).
  43. Nowara, D., et al. HIGS: Host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis. Plant Cell. 22, 3130-3141 (2010).
  44. Woloshuk, C. P., et al. Molecular characterization of aflR, a regulatory locus for aflatoxin biosynthesis. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2408-2414 (1994).
  45. Price, M. S., et al. The aflatoxin pathway regulator AflR induces gene transcription inside and outside of the aflatoxin biosynthetic cluster. FEMS Microbiology Letters. 255, 275-279 (2006).
  46. Ehrlich, K. C., Montalbano, B. G., Cotty, P. J. Sequence comparison of aflR from different Aspergillus. species provides evidence for variability in regulation of aflatoxin production. Fungal Genetics and Biology. 38, 63-74 (2003).
  47. McDonald, T., Brown, D., Keller, N. P., Hammond, T. M. RNA silencing of mycotoxin production in Aspergillus and Fusarium species. Molecular Plant Microbe Interactions. 18, 539-545 (2005).
  48. Abdel-Hadi, A. M., Caley, D. P., Carter, D. R., Magan, N. Control of aflatoxin production of Aspergillus flavus. and Aspergillus parasiticus. using RNA silencing technology by targeting aflD. (nor-1) gene. Toxins (Basel). 3, 647-659 (2011).
  49. Swartz, M. E. Ultra performance liquid chromatography (UPLC): An introduction: Separation Science Redefined. LCGC North America. , Suppl ement 8. 8-14 (2005).
  50. Maghuly, F., Khan, M. A., Fernandez, E. B., Druart, P., Watillon, B., Laimer, M. Stress regulated expression of the GUS-marker gene (uidA) under the control of plant calmodulin and viral 35S promoters in a model fruit tree rootstock: Prunus incisa x serrula. Journal of Biotechnology. 135, 105-116 (2008).
  51. de Mesa, M. C., Santiago-Doménech, N., Pliego-Alfaro, F., Quesada, M. A., Mercado, J. A. The CaMV 35S promoter is highly active on floral organs and pollen of transgenic strawberry plants. Plant Cell Reports. 23, 32-38 (2004).
  52. Sunilkumar, G., Mohr, L., Lopata-Finch, E., Emani, C., Rathore, K. S. Developmental and tissue-specific expression of CaMV 35S promoter in cotton as revealed by GFP. Plant Molecular Biology. 50, 463-474 (2002).
  53. Groenenboom, M. A. C., Maree, A. F. M., Hogeweg, P. The RNA silencing pathway: The bits and pieces that matter. PLoS Computational Biology. 1, 155-165 (2005).
  54. Zhao, D., Song, G. Q. High-throughput sequencing as an effective approach in profiling small RNAs derived from a hairpin RNA expression vector in woody plants. Plant Science: an International Journal of Experimental Plant Biology. 228, 39-47 (2014).
  55. Kamthan, A., Chauduri, A., Kamthan, M., Datta, A. Small RNAs in plants: recent development and application for crop improvement. Frontiers in Plant Science. 6, 208 (2015).
  56. Manda, A., Bodapati, P. N., Rachaputi, N. C., Wright, G., Fukai, S. Aflatoxins and their relationship with sugars in peanut (Arachis hypogaea L). 4th International Crop Science Congress, 2004, , Available from: http://www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/5/1/3/625_manda.htm (2004).
  57. Uppala, S. S. Factors affecting pre-harvest aflatoxin contamination of peanut (Arachis hypogaea L). , Auburn University. (2011).
  58. Sobolev, V. S. Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56, 1949-1954 (2008).
  59. Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55, 2195-2200 (2007).
  60. Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57, 62-68 (2009).
  61. Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia. 105, 117-128 (1989).
  62. Sobolev, V. S. Production of phytoalexins in peanut (Arachis hypogaea) seed elicited by selected microorganisms. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 1850-1858 (2013).
  63. Basha, S. M. M., Cherry, J. P., Young, C. T. Changes in free amino acids, carbohydrates, and proteins of maturing seeds from various peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars. Cereal Chemistry. 53, 586-596 (1976).
  64. Lansden, J. A. Aflatoxin inhibition and fungistasis by peanut tannins. Peanut Science. 9, 17-20 (1982).
  65. Yen, G. C., Duh, P. D., Tsai, C. L. Relationships between antioxidant activity and maturity of peanut hulls. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 41, 67-70 (1993).

Tags

Environmental Sciences RNA-interferens Lyddæmpningsplader jordnød frø transgene,
RNAi-medieret Kontrol af aflatoksiner i Peanut: metode til at analysere Mykotoksin Produktion og transgenekspression i Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev,… More

Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem. J. Vis. Exp. (106), e53398, doi:10.3791/53398 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter