Introduction
غدة البروستاتا هو نسيج غير متجانسة تتكون من ظهارة إفرازية مرتبة في عنيبات غدي محاط عضلي ليفي سدى تتألف أساسا من العضلات الملساء 1. وتتألف المقصورة الظهارية من خمسة أنواع مختلفة من الخلايا ولكن المنظمة: الخلايا القاعدية والخلايا الإفرازية، خلايا الغدد الصم العصبية والخلايا العابر تضخيم والخلايا الجذعية 2. في سرطان البروستاتا (PCA)، الذي ينشأ من الخلايا الظهارية اللمعية، نمو غدية يسبب الانخفاض التدريجي الواضح من المقصورة اللحمية 3. لهذه الأسباب، فإن عينات الأنسجة لديها اختلافات واضحة في نسبة اللحمية ونوع الخلايا الظهارية على أساس مدى محكمة التحكيم الدائمة. هذه الاختلافات يمكن أن يؤدي إلى الافتراضات متحيزة للبيانات التعبير الجيني تم الحصول عليها من أنسجة كاملة دون النظر إلى تسليخ مجهري من نوع الخلايا المطلوبة. لذلك، لإزالة هذا التحيز من الضروري فصل أنواع الخلايا قبل استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير الجيني.
Macrodissection أو تسليخ مجهري يمكن استخدامها لفصل جسديا المناطق الظهارية تتميز جيدا من سدى المحيطة 4 -6. وعادة ما يتم Macrodissection بشفرة حلاقة تحت المجهر تشريح ويعمل بشكل جيد لفصل كبير PCA العقيدات من سدى، ولكنها ليست قادرة على إزالة ظهارة حميدة من المحيط سدى (انظر مثال حميدة الأنسجة البروستاتا في الشكل 1). تسليخ مجهري مع ليزر (LCM) هو أكبر بكثير من العمل المكثف من macrodissection، ولكن يمكن تشريح دقيق للغاية ظهارة حميدة 4.
وقد أظهرت المنشورات الحديثة من مختبرنا أن RNA يمكن استخراجها بنجاح LCM إما جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الخزعات الثابتة الفورمالين أو الأنسجة المجمدة 4،7-9. التحديات الرئيسية في استخراج LCM-RNA هي 1) لتشريح دقيق للمناطق المطلوب من الأنسجة، و2) للحفاظ RNA سلامة خلال (4،10) LCM وعزل العملية. RNA معزولة عن السكان الخلية نقية يمكن استخدامها لتحليل التعبير الجيني عن طريق عدة طرق منها العكسية النسخ PCR الكمي (RT-QPCR) 7،8، ميكروأري 11، و-sequencing عمق 12-14.
والهدف من هذا البروتوكول هو عزل الحمض النووي الريبي مجموع من ظهارة LCM البروستاتا من الأنسجة المجمدة ليحلل المصب التعبير الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على جميع الأنسجة البشرية المستخدمة في هذه التجارب عبر بروتوكول مجلس المراجعة المؤسسية المعتمدة و / أو الإعفاء في جامعة إلينوي في شيكاغو.
1. القسم الطازجة المجمدة البروستاتا على PEN-الشرائح وعلى شريحة زجاجية اتهم
- قبل يوم واحد أو بضع ساعات قبل باجتزاء العينة والأدوات نظيفة (أي فرشاة، ملقط، coplins، شفرات، والشرائح PEN مؤطرة (إن لم يكن بالفعل ريبونوكلياز الحرة)، علامة ETOH آمنة وقلم رصاص) والداخل ل RT ناظم البرد مع ريبونوكلياز تطهير حل باستخدام زجاجة رذاذ ومختبر مناديل.
- السماح حل تطهير ريبونوكلياز على الجلوس لمدة 5 دقائق قبل تمسح، شطف مع depcH 2 0 لإزالة خلفها ريبونوكلياز تطهير الحل وشطف النهائي مع 70٪ ETOH (أعدت مع depcH 2 0).
ملاحظة: من الضروري المحافظة على مساحة خالية من ريبونوكلياز. جميع coplins والأدوات والمجمدة المتوسطة المتزايدة، شفرات والشرائح المستخدمة يجب أن تستخدم فقط لريبونوكلياز العمل الحروتستخدم أبدا في بيئة غير ريبونوكلياز القياسية الحرة. ويجب أن يعامل جميع الصكوك مع محلول تطهير ريبونوكلياز قبل كل تجربة.
- السماح حل تطهير ريبونوكلياز على الجلوس لمدة 5 دقائق قبل تمسح، شطف مع depcH 2 0 لإزالة خلفها ريبونوكلياز تطهير الحل وشطف النهائي مع 70٪ ETOH (أعدت مع depcH 2 0).
- ناظم البرد بارد إلى -24 ° C.
- ضع تنظيف الأدوات ريبونوكلياز حرة بعد داخل ناظم البرد لتبرد 30 دقيقة على الأقل قبل باجتزاء: شريحة coplin المليئة مع الإيثانول بنسبة 100٪، والأدوات، والأشرطة الأنسجة المجمدة الصغيرة وتصاعد ظرف.
- استرداد المجمدة أنسجة البروستاتا من cryostorage ومكان في دلو رغوة مليئة الجليد الجاف للنقل. وضع الأنسجة في ناظم البرد لكي تتوازن إلى ناظم البرد درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: أنسجة البروستاتا البشرية ليزر التقاط الدقيقة تشريح يمكن أن تكون إما طازجة مجمدة أو الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE). لضيق الوقت وإعداد الشرائح تختلف قليلا بين مصادر الأنسجة. نحن هنا وصف الخطوات لأقسام المجمدة. - العمل مع الأنسجة في وقت واحد، وبخ المجمدة المتوسطة المتزايدة في بوتوم الكاسيت وبسرعة جبل أنسجة البروستاتا المجمدة في المتوسط المجمدة تصاعد باستخدام ملقط المبردة.
- وضع الكاسيت مع الأنسجة على المبرد في ناظم البرد لمدة 5 دقائق لتعيين المجمدة المتوسطة المتزايدة.
- بخ كمية صغيرة من المجمدة المتوسطة المتزايدة على تشاك واضغط بعناية الجانب السفلي الأنسجة صعدت على المدى المتوسط المجمدة في تصاعد مستمر. اسمحوا المنصوص عليها في ناظم البرد لمدة 5 دقائق للسماح للمتوسطة المجمدة متزايدة ليصلب تماما.
- ضع ظرف في حامل وتشديد.
- قفل المقبض في وضع القفل ووضع شفرة جديدة على ناظم البرد. بالنسبة لنهايات الجزيئية المصب التي تشمل خطوة التضخيم (أي QPCR) فمن المستحسن استخدام شفرة جديدة لكل مريض لمنع التلوث (أو نقل شفرة على استخدام المجال لنصل للعينة القادمة).
- فتح المقبض ودفع بعناية الأنسجة عن طريق اليد أو مع دواسة القدم لمعادلة وفضح الأنسجة مع 50 μأقسام م حتى تعرض الأنسجة المطلوب هو التوصل إليها.
- ضبط ناظم البرد إلى 5 ميكرون، وقطع واحد أو قسمين ووضعها على شريحة زجاجية اتهم لالهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ (راجع الخطوة 2).
- المكان على الفور الشريحة في البرد الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة.
- إزالة شريحة زجاجية اتهم من الإيثانول واتركها لتجف في RT قبل الشروع في H & E تلطيخ (الخطوة 2).
- وضع RT PEN-إطار الشريحة على مؤيد الإطار.
- ضبط ناظم البرد إلى 10 ميكرون ومكان أقسام على RT PEN إطار الشرائح. يمكن للمرء أن يكون مكان أربعة أقسام على كل شريحة اعتمادا على حجم الأنسجة.
- يغرق فورا الشريحة في البرد الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة.
- إزالة الشرائح PEN-الإطار من الإيثانول وتخزين الشريحة في مربع الشريحة في مربع المجفف في الفريزر -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للLCM. ثلاثة أيام هي فترة التخزين القصوى لاسترداد RNA الأمثل.
- المضي قدما في الخطوة 2 فقط تراجع الزجاج مشحونةه. المضي قدما في الخطوة 3 لPEN-إطار الشريحة.
2. الهيماتوكسيلين ويوزين-Y (H & E) وصمة عار لالنسيجية الأقسام المتابعة
ملاحظة: هذا إذا لالأنسجة على شريحة زجاجية اتهم وليس الشريحة PEN-الإطار لLCM.
- هيدرات المقاطع على شريحة زجاجية اتهم غمس الشريحة من خلال الإيثانول متدرج على النحو التالي: تراجع الشريحة مرتين في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق، مرتين في الايثانول 95٪ لمدة 3 دقائق، مرة واحدة في الايثانول 70٪ لمدة 3 دقائق واثنين مرات في المقطر H 2 O لمدة 3 دقائق.
- تحضير حامض حل الكحول: 99 مل 70٪ من الإيثانول + 1 مل 1٪ حمض الهيدروكلوريك و 0.1٪ محلول بيكربونات الصوديوم: 0.1 ز بيكربونات الصوديوم في 100 مل المقطر H 2 O
- تراجع الشرائح في الهيماتوكسيلين جيل الثاني (0.4٪) لمدة 5 دقائق.
- يغسل وصمة عار الزائدة في المطرد الحنفية H 2 O لمدة 3 دقائق.
- تراجع الشريحة 10 مرات في الكحول الحمضية
- غسل الشريحة في إدارة الصنبور H 2 O لمدة 3 دقائق.
- تراجع الشريحةفي 0.1٪ محلول بيكربونات الصوديوم لمدة 30-60 ثانية لتحويل اللون الأرجواني إلى اللون الأزرق.
- غسل الشريحة في إدارة الصنبور H 2 O لمدة 3 دقائق.
- شطف الشريحة في 95٪ من الإيثانول مع 10 الانخفاضات.
- تراجع الشريحة في أوقات يوزين-Y 2-3 مجموعه 15 ثانية.
- يذوى الشريحة من خلال الإيثانول متدرج على النحو التالي: تراجع الشريحة مرتين في 95٪ من الإيثانول، مرتين في الإيثانول بنسبة 100٪، ومرتين في الزيلين (تأكد تظهر الأنسجة واضحة مما يدل على الجفاف شامل).
- جبل الشريحة مع غير مائي دائم الصعب تصاعد المتوسطة والغطاء زلة.
- السماح بانزلاق الجافة لمدة 30 دقيقة.
- الشريحة المسح الضوئي مع أي جهاز ماسح ضوئي الشريحة بأكملها وطباعة كبيرة، صورة عالية الدقة على 8 "× 11" ورقة.
- المناطق المخطط الفائدة (يتم عادة من قبل الطبيب الشرعي شهادة البورد) مع علامة. هذه العلامات هي دليل لإجراءات LCM.
3. طولويدين الأزرق تلطيخ الشرائح PEN الإطار
ملاحظة: تويتم في نفس اليوم كما LCM. استخدام depcH 2 O المياه لجميع الحلول. استكمال جميع الخطوات في منطقة خالية من ريبونوكلياز. يجب تنظيف جميع coplins مع حل ريبونوكلياز تطهيرها.
- يوم LCM إزالة PEN-إطار الشرائح من -80 ° C الفريزر وهيدرات بسبب الانهيارات جوفاء إلى 90٪ ETOH لمدة 2 دقيقة ثم 75٪ ETOH لمدة 2 دقيقة.
- إعداد 0.5٪ طولويدين الأزرق عن طريق إذابة في الماء الصف البيولوجيا الجزيئية ثم تصفية تعقيم خلال 0.2 ميكرون تصفية وتخزينها في RT. قد يكون هذا الحل إعادة استخدامها لمدة تصل إلى 6 أشهر. ملاحظة: ينصح بشدة لإعداد الحل قبل باسم الترشيح يمكن أن يستغرق بضع ساعة.
- وصمة عار على أنسجة البروستاتا عن طريق غمس بلطف الشرائح في 0.5٪ طولويدين الأزرق لل30/05 ثانية. يزيل اللون الأنسجة عن طريق غسل الشرائح 2 مرات في depcH 2 O لمدة 15 ثانية تليها 75٪ ETOH لمدة 30 ثانية إلى 3 دقائق. ملاحظة: يمكن تعديل وصمة عار ويزيل اللون الأوقات لضمان تلطيخ جيد. البروستاتا يميل إلى أكثر من وصمة عار.
4. الليزر التقاط الجزئي تشريح (LCM)
- مباشرة قبل LCM، شريحة الجافة على شريحة دفئا في 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. الجافة فقط الشريحة التي سيتم تجهيزها وتخزينها الباقي على الجليد حتى جاهزة بالنسبة لهم.
- تشغيل LCM والكمبيوتر في هذا النظام، والسلطة المجهر، والمفتاح ليزر، والتحول ليزر ثم الكمبيوتر. إطلاق برنامج ليزر تسليخ مجهري.
- استخدام برنامج للسيطرة على المجهر لتحميل الشرائح وأنابيب جمع. انقر على "صاحب العينة تفريغ"، تحميل الشريحة مع المقاطع على حامل شريحة المجهر مع الأنسجة أسفل وإدراج حامل الشرائح في الفتحة المناسبة في المجهر، ثم انقر فوق "متابعة".
- انقر على "أنابيب جمع تفريغ"، والتسمية وتحميل 0.5 مل أنابيب على حامل الأنبوب وأدخله في الفتحة المناسبة في الصك. ذات مرةيتم تأمينها والقبعات، وإضافة 35 ميكرولتر من تحلل العازلة للقبعات جمع ومحاولة لتجنب الفقاعات. ثم انقر فوق "موافق".
ملاحظة: إذا تبخر هو المشكلة، تمييع عازلة على النحو التالي: 25 ميكرولتر تحلل العازلة مع 10 ميكرولتر depcH2O.
- انقر على "أنابيب جمع تفريغ"، والتسمية وتحميل 0.5 مل أنابيب على حامل الأنبوب وأدخله في الفتحة المناسبة في الصك. ذات مرةيتم تأمينها والقبعات، وإضافة 35 ميكرولتر من تحلل العازلة للقبعات جمع ومحاولة لتجنب الفقاعات. ثم انقر فوق "موافق".
- في البرنامج، حدد الموضع حيث تم وضع الشرائح في حامل الشرائح. تحديد الحد الأقصى للجمع لجمع العينة LCM.
- تصور والتركيز على الشريحة من خلال الكمبيوتر في 10X. استخدام البرنامج لمعايرة الليزر عن طريق اختيار "الليزر" ثم "معايرة". ضبط السلطة، وفتحة العدسة وسرعة ليزر، واختيار "ليزر" ثم "السيطرة" على السماح لشعاع الليزر لقطع المساحة المحددة تماما وكفاءة. تكرار التعديلات حتى التخفيضات الليزر تماما من خلال الأنسجة.
- باستخدام 8 "× 11" الطبيب الشرعي علامة المتابعة كدليل، واستخدام "رسم شكل" أداة لتطويق المناطق المطلوب من epithelium في طريقة العرض وتجنب جمع أي سدى.
ملاحظة: يمكن تحديد مجالات متعددة ضمن عرض واحد، ولكن لا تنتقل إلى رأي آخر بدون تقطيع الأول عن طريق النقر على "قطع شكل" أداة.- إذا كان المجال لا يحصل معزولة تماما بواسطة الليزر استخدام "التحرك وقطع" أداة ليذهب أكثر من ذلك يدويا. مواصلة التحرك الهدف إلى وجهات جديدة وتكرار القطع بالليزر حتى يتم تشريح شريحة تماما أو تم جمع المبلغ المطلوب من الأنسجة (عادة 100 الغدد حميدة تسفر 150-500 نانوغرام من RNA). (انظر المثال في الشكل 1A).
- إزالة بعناية أنابيب من صاحب جمع وإغلاق القبعات، واضعة في اعتبارها من تحلل العازلة والأنسجة في مباراة دولية. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 30 ثانية لجمع السائل والأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان العينات عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لعزل الحمض النووي الريبي.
5. مجموع العزلة RNA مع الفيلكيت القائم ثالثا وتحليل الجودة
- ذوبان الجليد من الأنابيب على الجليد وتبرزي حجم من الحل إلى 100 ميكرولتر.
- قبل الرطب مرشح الصغير من العزلة عدة RNA عن طريق تطبيق 30 ميكرولتر ofLysis الحل إلى مركز للتصفية والسماح لها لامتصاص whileperforming الخطوتين التاليتين (5 دقائق على الأقل).
- إضافة 3 ميكرولتر من LCM مضافة الحل (المنصوص عليها في عدة) إلى المحللة ومزيج من قبل vortexing لمدة 5 ثانية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
- الطرد المركزي فلتر مبلل قبل ل~ 30 ثانية في سرعة قصوى لإزالة السائل.
- إضافة 1.25 مجلدات (في هذه الحالة 129 ميكرولتر) من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى خليط المحللة، بلطف دوامة أو ماصة صعودا وهبوطا. ** هذه الطريقة سوف يتعافى كلا النوعين RNA الكبيرة والصغيرة.
- تحميل العينة على مرشح الصغيرة المبللة مسبقا، وأجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 1 دقيقة لربط RNA إلى التصفية. ثم يغسل فلتر الجزئي مع 180 ميكرولتر من "غسل الحل 1، R21؛ أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: من ينبغي أن يتم هذه النقطة على كل centrifugations في 13000 x ج، أو الحد الأقصى للسرعة. - غسل تصفية مرتين مع 180 ميكرولتر من "الحلول غسل 2 و 3"، على التوالي وفقا لتوجيهات بروتوكول عدة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية، ثم تجاهل التدفق من خلال وتدور مرشح لمدة 1 دقيقة لإزالة السوائل المتبقية وتجفيف التصفية.
- نقل فلتر لأنبوب المجموعة الجديدة.
- حل الدافئ شطف إلى -95 ° C (المقدمة مع عدة).
- تطبيق 10 ميكرولتر من محلول شطف محمى على مركز للتصفية، أغلق الغطاء وتخزينها لمدة 5 دقائق على RT. ثم الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة إلى أزل الحمض النووي الريبي، وكرر هذه الخطوة لمرة واحدة أن تسفر ~ 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي.
- إجراء العلاج الدناز I لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C.
- تحديد الحمض النووي الريبي التي كتبها الطيف مع الامتصاصية في 260 نانومتر. يتم استخدام نسبة الكثافة البصرية في موجات من 260 نانومتر و 280 نانومتر لتقييم نقاءالحمض النووي الريبي (انظر الجدول 1) 15.
6. جين تحليل التعبير
ملاحظة: التعبير الجيني للأنواع RNA طويلة (مثل من mRNAs وlncRNAs) هو مبين في الخطوة 6.1 والأنواع RNA قصيرة (مثل microRNAs) يظهر في الخطوة 6.2. هي مجموعات المختلفة المتاحة لRT-QPCR وكمية من الحمض النووي الريبي المطلوبة تختلف حسب عدة (أقل من 10 نانوغرام). يوصف تحليل الحمض النووي الريبي التسلسل في 6.3.
- نسخ العكسي (RT) الحمض النووي الريبي إلى [كدنا خلط 5 ميكرولتر من 20 نانوغرام / ميكرولتر عينة الحمض النووي الريبي مع 5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي RT (RT العازلة، وdNTP، الاشعال عشوائية، RT انزيم، ريبونوكلياز المانع). احتضان رد فعل لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية، ثم 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5 دقائق عند 85 ° C.
- تمييع رد فعل RT 01:10 مع ريبونوكلياز المياه مجانا واستخدام 2.5 ميكرولتر في 10 ميكرولتر QPCR رد فعل مع الاشعال أو مجموعات التمهيدي / مسبار للجينات الفائدة.
ملاحظة: لتسهيل تحليل RNA المتدهورة جزئيا ومن المستحسن استخدام بادئات FOص amplicons أقصر (أقل من 100 سنة مضت) 16 (الجدول 2B)- لتحليل التعبير الرنا الميكروي تشغيل رد فعل RT عن طريق خلط 5 ميكرولتر من 2-10 نانوغرام / ميكرولتر عينة الحمض النووي الريبي مع 5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي RT.
ملاحظة: تتطلب مقرها PCR-كل تكنولوجيا الكشف الرنا الميكروي المتاحة تجاريا استخدام الملكية ومحددة الاشعال RT.
- لتحليل التعبير الرنا الميكروي تشغيل رد فعل RT عن طريق خلط 5 ميكرولتر من 2-10 نانوغرام / ميكرولتر عينة الحمض النووي الريبي مع 5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي RT.
- بدلا من أو بالإضافة إلى RT-PCR، استخدم الجيل القادم التسلسل (RNA وما يليها أو الصغيرة RNA وما يليها) لتحديد أنواع مختلفة من الرنا. عادة، استخدم 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لهذا الإجراء (الجدول 3) وتنفيذ طريقة كما هو مبين في الصك الشركة المصنعة والكشف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في دراسة سابقة أثبتنا استخدام LCM لجمع الأنسجة الظهارية واللحمية لمقارنة التنميط التعبير بواسطة RT-QPCR مرنا وmicroRNAs من أنسجة البروستات المجمدة وFFPE من نفس المريض (4). LCM هو مضيعة للوقت، خاصة إذا كمية كبيرة من RNA التي يتعين جمعها لتحليل تسلسل الجيل القادم. لذا، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على مساحة العمل والأدوات ريبونوكلياز الحرة. فمن المستحسن لفحص الجودة وخلايا خصوصية التحكم في الحمض النووي الريبي التي تم جمعها (مناقشتها بمزيد من التفصيل في الفقرة التالية). الشكل 1 يوضح قسم البروستاتا الملون على شريحة PEN الإطار تحت المجهر قبل وبعد التقاط الليزر ظهارة حميدة .
مرة واحدة يتم جمع العينة ويتم استخراج الحمض النووي الريبي بعناية، فمن المهم لتقييم نوعية وكمية RNA كما هو مبين في الجدول 1. ليس من غير المألوف أن نلاحظ انخفاض نسب 260/280 نانومتر. تركيز الحمض النووي الريبي سوفتحسين نسب نانومتر 260/280، ولكنها يمكن أيضا أن يسبب فقدان الأنواع RNA الصغيرة. بالإضافة إلى مراقبة الجودة، من الأهمية بمكان لدراسة الضوابط نوع محدد خلية لتأكيد خصوصية المنطقة التي احتلتها الليزر من الأنسجة (الشكل 1B - C). على سبيل المثال، في الشكل 1B تم قياس التعبير عن AMACR الجينات لتأكيد سرطان البروستاتا الأنسجة الطلائية مقارنة مع الأنسجة الطلائية العادية،. في الشكل 1C التعبير عن NKX3.1 أكد عدم وجود سدى في العينة التي تم جمعها لكم]. ويمكن أيضا أن compareed نوعية الحمض النووي الريبي في العينة إلى RNA من المعروف، وحسن RNA الجودة. قيم RT-QPCR ط م الرنا المعزولة من الأنسجة LCM collected- في نفس النطاق كما RNA جمع من الخلايا الظهارية الأولية مثقف، مؤكدا نوعية RNA طويلة والصغيرة استخراج (الجدول 2). وأخيرا، يبين الجدول 3 أن هذا RNA هو من نوعية كافية للجيل المقبل من RNA sequenciنانوغرام.
الشكل 1: مجموعة من ظهارة حميدة، ظهارة سرطان البروستاتا وسدى من البروستاتا البشرية عن طريق الليزر التقاط الجزئي تشريح خزعة (A) البروستاتا ملطخة طولويدين الأزرق قبل وبعد LCM جمع من ظهارة حميدة. (B - C) الأنسجة التي جمعتها LCM من 45 مريضا تعبر عن علامات الجينات المناسبة الهوية الخلوية 7. (B) AMACR هو علامة على سرطان البروستاتا وغير قابلة للكشف إلا في الأنسجة السرطانية. (C) NKX3.1 هو علامة من الظهارة وليس كشفها في الأنسجة اللحمية. تم تعديل هذا الرقم من Giangreco وآخرون، JSBMB 2015 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: جودة وكمية RNA من أنسجة البروستات التي تم جمعها لكم].
الجدول 2: RT-QPCR من LCM جمعت البروستاتا ظهارة حميدة.
الجدول 3: RNAseq من أنسجة البروستات جمعت لكم].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التنميط الجيني التعبير من العينات البشرية يمكن أن يكون تحديا، ليس فقط بالنسبة للنوعية أو كمية من النسيج المتاحة، ولكن أيضا لمختلف الكيانات النسيجية الموجودة في عينة نسيج معين. هذا هو تحديا من نوع خاص في البروستاتا الذي أنسجة حميدة إلى حد كبير الأنسجة اللحمية ومجالات السرطان هي خالية من سدى. LCM يسهل الفصل المادي بين سدى البروستاتا وظهارة RNA للتوقيع أكثر دقة من اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا (الشكل 1A). بالمقارنة مع macrodissection أو معالجة الأنسجة كله، يمكن LCM فصل المقصورات الخلايا في أنسجة حميدة، ولكن بشكل ملحوظ أكثر تكلفة وعمالة كثيفة.
كما هو الحال في أي تقنية هناك المخاطر المحتملة. على سبيل المثال، يمكن أن نوعية RNA أن يتحلل جزئيا خلال شراء عينة الأولي أو أثناء إجراء LCM والاستخراج. في الحالة الأولى، لا يمكن أن يتحقق التعبير الجيني قياس AMPL قصيرة مختلفةالرموز التي QPCR. في الحالة الثانية، ينبغي أن تؤخذ الدقيق ريبونوكلياز العلاج المجاني لجميع الأدوات والمواد لمنع تدهور RNA، فضلا عن معالجة متأنية وتجهيز أقسام الأنسجة. وعلاوة على ذلك، مما يحد من الوقت الذي يقضيه في شريحة واحدة إلى أقل من 90 دقيقة يحافظ على جودة RNA أثناء عملية جمع المعلومات. أكبر قيود على تقنية LCM هو الوصول إلى أداة LCM وهي العمالة اللازمة للقيام LCM.
هناك عدة أنواع من المجاهر الليزر التقاط تسليخ مجهري المتاحة. يصف هذا البروتوكول استخدام وسيلة LCM يستخدم الليزر لتطويق المناطق التي تقع بعد ذلك في لسقف جمع أدناه. هذا النوع من LCM مثالية لفصل ظهارة وسدى في أنسجة البروستاتا الذي يحتوي على مناطق متعددة الخلايا المنفصلة لجمع، ولكن هذا النوع من LCM غير مناسب لعزل الخلايا الفردية واحدة من الأنسجة. على سبيل المثال، لا ينبغي أن تستخدم هذا البروتوكول لجمع بلعم المقيمين الصورة، خلايا الغدد الصم العصبية أو التسلل الخلايا الليمفاوية، والتي غالبا ما تكون موجودة على شكل خلايا واحدة. هناك صكوك LCM الأخرى والأساليب التي تستخدم الليزر ل"اطلاق النار" واحدة من خلايا الأنسجة على سقف الغشاء، مما يسهل عزل هذه أنواع الخلايا الأخرى.
لا يمكن إغفال مراقبة الجودة الشاملة وتوصيف RNA. الامتصاصية في 260 نانومتر هو مناسب لتحديد RNA للدراسات RT-QPCR (الجدول 1)، ولكن لأسلوب قائم على الأصباغ بشكل أكثر دقة، تسلسل الحمض النووي الريبي RNA الكمي. مسألة هامة أخرى في تحليل RT-QPCR هو تجنب التحيز المحتمل من التلوث DNA المتبقية. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام البادئات التي تمتد إنترونات. وهناك أيضا عدم التجانس المريض عالية في التعبير مدبرة الجينات، وبالتالي استخدام الجينات مدبرة متعددة ويقترح والتي نستخدمها عادة من ثلاث إلى خمس 4،7-9 (الشكل 1B - C والجدول 2).
الصورة = "jove_content"> اختيار طريقة التعبير الجيني التنميط لا يستند فقط على كمية من الحمض النووي الريبي التي تم جمعها ولكن أيضا على نوع من البيانات التي كان أحد يرغب في الحصول على والمقارنة. منتظم RT-QPCR هو أكثر حساسية من الجيل المقبل من تسلسل عميق، ويتطلب كمية صغيرة نسبيا من RNA مما أدى إلى خفض LCM الإجراء مرة و4. الجيل القادم من RNA التسلسل هو أسلوب فعال لقياس التعبير على حد سواء للأنواع RNA القصير والطويل. الجيل التالي من التسلسل كما يسمح اكتشاف أنواع جديدة RNA 13. لحسن الحظ، فإن تكلفة الجيل المقبل من التسلسل آخذ في الانخفاض.
باختصار، هذا البروتوكول يتيح عزل الحمض النووي الريبي من السكان متجانسة من الخلايا الظهارية أو اللحمية من أنسجة البروستات المجمدة. الحمض النووي الريبي يمكن أن تستخدم في العديد من تقنيات التحليل المصب لتوفير أداة لنوع محدد خلية دقيقة التعبير الجيني في البروستاتا الحميدة والمريضة. هذا النوع من البيانات يساهم في معرفةد فهم كيف يختلف التعبير RNA في علم الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4.0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
References
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
- McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
- Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
- Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
- Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
- Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
- Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95 (2010).
- Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165 (2010).
- Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
- Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
- Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
- Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
- Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246 (2014).
