Introduction
Prostatakörteln är en heterogen vävnad som består av sekretoriska epitel arrangerade i körtel acini omgiven av fibromuskulär stroma består främst av glatt muskulatur 1. Epitel fack består av fem olika men organiserade celltyper: basala celler, sekretoriska celler, neuroendokrina celler, transitförstärknings celler och stamceller 2. I prostatacancer (PCA), som uppstår från de luminala epitelceller, tillväxten av adenocarcinom orsakar en uppenbar successivt minskade stromala utrymmet 3. Av dessa skäl kommer vävnadsprover har tydliga skillnader i andelen stromala och epitelceller typ baserade på omfattningen av PCa. Dessa skillnader kan leda till snedvridna antaganden om de genexpressionsdata förvärvats från hela vävnader utan hänsyn till mikrodissektion av den önskade celltypen. Därför är det viktigt att avlägsna denna förspänning för att separera celltyper före RNA-extraktion ochgenuttrycksanalys.
Macrodissection eller microdissection kan användas för att fysiskt separera välkaraktäriserade epiteliala områden från den omgivande stroma 4 -6. Macrodissection görs vanligtvis med ett rakblad under ett dissektionsmikroskop och fungerar bra för att separera stora PCa noduler från stroma, men är inte i stånd att avlägsna benigna epitel från omgivande stroma (se exempel av godartad prostata histologi i figur 1). Microdissection med en laser (LCM) är betydligt mer arbetsintensiv än macrodissection, men kan mycket noggrant dissekera godartad epitel 4.
Nya publikationer från vårt labb har visat att RNA kan framgångsrikt utvinns av LCM från antingen formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) biopsier eller fryst vävnad 4,7-9. De stora utmaningarna inom LCM-RNA-extraktion är 1) att noggrant dissekera de önskade områdena i vävnaden, och 2) att bevara RNA integritet under LCM och isoleringsprocessen 4,10. RNA isolerat från rena cellpopulationer kan användas för genuttrycksanalys genom flera metoder inklusive omvänd transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) 7,8, mikromatris 11, och djup -sequencing 12-14.
Målet med detta protokoll är att isolera totalt RNA från LCM prostata epitel från fryst vävnad för nedströms genuttryck analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mänskliga vävnader används för dessa experiment förvärvades via en Institutional Review Board godkänt protokoll och / eller befrielse vid University of Illinois i Chicago.
1. Avsnitt Färsk Fryst Prostate på PEN-slide och på Charged glasskiva
- Dagen före eller ett par timmar innan snitt provet rena verktyg (dvs, borstar, pincett, coplins, blad, PEN-inramade diabilder (om de inte redan RNas gratis), en ETOH säker markör och en penna) och insidan av en RT kryostat med RNas-dekontaminerande lösningen med en sprayflaska och lab-våtservetter.
- Tillåt RNas-dekontaminerande lösning för att sitta i fem minuter innan du torkar bort, skölj med depcH 2 0 att ta bort kvar RNas-dekontaminering lösning och en slutsköljning med 70% EtOH (framställd med depcH 2 0).
Obs: Det är viktigt att upprätthålla en RNas-fri arbetsyta. Alla coplins, verktyg, frysta monteringsmedel, blad och diabilder som används bör endast användas för RNas fritt arbeteoch aldrig använt i en vanlig icke-RNas miljö. Alla instrument måste behandlas med en RNas sanering lösning före varje experiment.
- Tillåt RNas-dekontaminerande lösning för att sitta i fem minuter innan du torkar bort, skölj med depcH 2 0 att ta bort kvar RNas-dekontaminering lösning och en slutsköljning med 70% EtOH (framställd med depcH 2 0).
- Kall kryostat till -24 ° C.
- Placera följande rengjorda RNas gratis instrument inne kryostat svalna minst 30 minuter före snittning: slide Coplin fyllda med 100% etanol, verktyg, små frusna vävnadskassetter och monterings chuck.
- Hämta frusen prostatavävnad från kryoförvaring och plats i en torr-is-fyllda skum hink för transport. Placera vävnad i kryostat till jämvikt till kryostat temperatur i minst 30 minuter.
Obs: Mänskliga prostatavävnad för laser-capture mikro-dissektion kan vara antingen färskfryst eller formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE). De tidsbegränsningar och glaspreparering skiljer sig något mellan vävnadskällor. Här beskriver vi följande steg för frysta sektioner. - Arbete med en vävnad i taget, och spruta fryst monteringsmedium in i Bottom av kassetten och snabbt montera den frusna prostatavävnaden i den frusna monteringsmedium med hjälp av de kylda pincett.
- Placera kassetten med vävnad på kylaggregatet i kryostat för 5 minuter att ställa fryst monteringsmedium.
- Squirt en liten mängd fryst monteringsmedium på chucken och försiktigt trycka monterade vävnadsbottensidan upp på den frusna monteringsmedium. Låt som i kryostaten under 5 min för att tillåta den frusna monteringsmedium för att fullständigt stelna.
- Placera chuck i hållaren och dra åt.
- Lås handtaget i låst läge och placera ett nytt blad på kryostaten. För nedströms molekylära effektmått som inkluderar ett amplifieringssteg (dvs. qPCR) är det lämpligt att använda ett nytt blad för varje patient för att undvika förorening (eller flytta bladet över att använda området av bladet för nästa prov).
- Lås upp handtaget och försiktigt föra vävnaden för hand eller med en fotpedal för att jämna och exponera vävnaden med 50 μm sektioner tills den önskade vävnaden exponering nås.
- Justera kryostat till 5 | im, skär en eller två sektioner och placera dem på laddade objektglas för hematoxylin och eosin (H & E) färgning (se steg 2).
- Placera omedelbart objektglaset i det kalla 100% etanol i 2 min.
- Ta den laddade glasskiva från etanol och låt den torka vid RT innan du fortsätter till H & E färgning (steg 2).
- Placera RT PEN-frame glida på en ram supporter.
- Justera kryostat till 10 pm och placera delar på RT PEN ram diabilder. Ett till fyra sektioner kan vara plats på varje objektglas, beroende på vävnadens storlek.
- Omedelbart störta sliden i det kalla 100% etanol under 2 minuter.
- Ta bort PEN-frame glider ur etanol och lagra bilden i ett bildspel ruta i en exsickator ruta i en -80 ° C frys tills för LCM. Tre dagar är den maximala tiden för optimal RNA återhämtning lagring.
- Fortsätt med steg 2 för endast den laddade glaset glede. Fortsätt med steg 3 för PEN-frame bild.
2. Hematoxylin och Eosin-Y (H & E) Stain för histologisk Mark-up
Obs! Den här om för vävnaden på den laddade objektglas och inte PEN-frame bild för LCM.
- Hydratisera avsnitten på den laddade objektglas doppning av objektglaset genom graderad etanol enligt följande: doppa sliden två gånger i 100% etanol under 3 minuter, två gånger i 95% etanol under 3 minuter, en gång i 70% etanol under 3 min och två gånger i destillerat H2O för 3 min.
- Bered syraalkohollösning: 99 ml 70% etanol + 1 ml 1% HCl och 0,1% natriumvätekarbonatlösning: 0,1 g natriumbikarbonat i 100 ml destillerat H2O
- Doppa bilden i Hematoxylin Gill II (0,4%) under 5 min.
- Tvätta bort överflödig fläck i stadig rinnande vatten H2O under 3 min.
- Doppa bilden 10 gånger i syra alkohol
- Tvätta sliden i rinnande vattenlednings H2O under 3 minuter.
- Doppa bildeni 0,1% natriumbikarbonatlösning för 30-60 sek för att slå den lila färg till blå.
- Tvätta sliden i rinnande vattenlednings H2O under 3 minuter.
- Skölj objektglaset i 95% etanol med 10 dips.
- Doppa bilden i Eosin-Y 2-3 gånger under 15 sekunder totalt.
- Torka bilden genom graderade etanol enligt följande: doppa bilden två gånger i 95% etanol, två gånger i 100% etanol, och två gånger i Xylen (se till att vävnaden verkar klart vilka indikerar grundlig uttorkning).
- Montera bilden med icke-vattenbaserad permanent hårt monteringsmedium och täckglas.
- Låt glid torka 30 minuter.
- Scan bild med någon hela diascanner och skriva ut en stor, högupplöst bild på 8 "x 11" papper.
- Disposition intresseområden (normalt görs av en certifierad patolog) med en markör. Denna uppmärkning är guiden för LCM förfarandet.
3. toluidinblått Färgning av PEN-frame Slides
Obs: Thär sker samma dag som LCM. Använd depcH 2 O vatten för alla lösningar. Slutföra alla steg i RNas-fritt område. Alla coplins måste rengöras med RNas-dekontaminerande lösning.
- Dagen för LCM ta bort PEN-frame diabilder från -80 ° C frys och hydrat av flacka glider in 90% EtOH under 2 minuter sedan 75% EtOH under 2 min.
- Bered 0,5% toluidinblått genom upplösning i biologi klass vatten molekyl sedan filtrera sterilisera genom ett 0,2 pm filter och förvara vid rumstemperatur. Denna lösning kan återanvändas i upp till 6 månader. Obs: Det är mycket rekommenderas att bereda lösningen före som filtreringen kan ta några timmar.
- Fläck prostatavävnaden genom flacka glider in 0,5% toluidinblått för 5-30 sek. Avfärgning vävnaden genom tvättning glider 2 gånger i depcH 2 O för 15 sek, följt av 75% EtOH under 30 sekunder till 3 minuter. Obs: fläcken och avfärgning tider kan justeras för att säkerställa god färgning. Prostata tenderar att över fläcken.
4. Laser-capture Micro-dissektion (LCM)
- Omedelbart före LCM, torr glider på en bild varmare vid 42 ° C under 15 minuter. Torr bara bilden som kommer att behandlas och lagras resten på is tills redo för dem.
- Slå på LCM och datorn i denna ordning, mikroskop makt, laserknappen, laserbrytaren och sedan datorn. Starta laser Microdissection programvaran.
- Använda programvaran för att styra mikroskopet att ladda bilder och uppsamlingsrören. Klicka på "lasta provhållare", laddar bilden med sektionerna på objektglas hållaren med vävnaden nedåt och sätt i diapositivhållaren i rätt kortplats i mikroskopet, och klicka sedan på "Fortsätt".
- Klicka på "avlastningsuppsamlingsrören", etikett och ladda 0,5 ml rör på rör hållaren och sätt det i rätt kortplats i instrumentet. En gånglock är säkrade, tillsätt 35 pl lysbuffert till insamlings mössor och försöker undvika bubblor. Klicka sedan på "OK".
Obs: Om avdunstning är ett problem, späd bufferten enligt följande: 25 ul lysbuffert med 10 pl depcH2O.
- Klicka på "avlastningsuppsamlingsrören", etikett och ladda 0,5 ml rör på rör hållaren och sätt det i rätt kortplats i instrumentet. En gånglock är säkrade, tillsätt 35 pl lysbuffert till insamlings mössor och försöker undvika bubblor. Klicka sedan på "OK".
- I programmet väljer du det läge där bilden har placerats i diapositivhållaren. Välj uppsamlingslocket för att samla LCM provet.
- Visualisera och fokusera bilden genom datorn vid 10X. Använda programvaran för att kalibrera lasern genom att välja "Laser" och sedan "kalibrera". Justera makt, bländare och hastigheten på laser, välja "laser" och sedan "kontroll" för att tillåta laserstråle för att skära område som valts helt och effektivt. Upprepa justeringar tills lasersnitten helt genom vävnaden.
- Använda 8 "x 11" patolog påslag som en guide, använd "rita formen" verktyg för att begränsa de önskade områdena epitheLium i vyn och undvika att samla alla stroma.
Obs: Flera områden kan väljas inom en vy, men inte flytta till en annan vy utan att först skärning genom att klicka på "cut formen" verktyg.- Om ett område inte blir helt skära av lasern använder "flytta och skär" verktyg för att gå över den manuellt. Fortsätt att flytta målet att nya vyer och upprepa laserskärning tills slide är helt dissekeras eller den önskade mängden vävnad har samlats (typiskt 100 godartade körtlar ge 150-500 ng RNA). (se exempel i figur 1 A).
- Försiktigt bort rören från samlingen hållaren och stäng locken, vara uppmärksam på lysbufferten och vävnad i locken. Centrifugera kort för 30 sek för att samla upp vätska och vävnad i botten av röret. Inkubera proverna vid 42 ° C i 30 min och förvara vid -80 ° C tills redo för RNA-isolering.
5. Total RNA isolering med en Filter-baserade Kit och analys Kvalitet
- Tina upp rören på is och bringa volymen av lösningen till 100 ^.
- Pre-väta mikrofilter av ett RNA-isoleringskit genom att applicera 30 pl ofLysis lösning till centrum av filtret och låt det blöta whileperforming de nästa två stegen (minst 5 min).
- Tillsätt 3 il LCM tillsatslösning (medföljer i satsen) till lysatet och blanda genom att vortexa i 5 sekunder. Centrifugera i 30 s för att samla upp vätskan i botten av röret.
- Centrifugera förfuktat filter för ~ 30 sekunder vid högsta hastighet för att avlägsna vätska.
- Lägg 1,25 volymer (i detta fall 129 pl) av 100% etanol till lysatet blandningen försiktigt virvel eller pipett upp och ner. ** Denna metod kommer att återhämta både stora och små RNA-species.
- Ladda provet på den för-vätta mikrofilter, och centrifugera vid 10000 xg i 1 min för att binda RNA till filtret. Tvätta sedan mikrofilter med 180 ul av "tvättlösning 1, R21; Centrifugera vid 10000 xg i 1 min.
Obs: Från denna punkt på alla centrifuge bör göras på 13.000 xg, eller maximal hastighet. - Tvätta filter två gånger med 180 pl av "Tvätta lösningar 2 och 3", respektive enligt anvisningar från satsen protokollet. Centrifugera i 30 sek, sedan kasta flödet genom, och snurra filter för en min för att avlägsna kvarvarande vätska och för att torka filtret.
- Överför filter på en ny kollektion tub.
- Varm elueringslösning till -95 ° C (medföljer kitet).
- Applicera 10 pl förvärmd elueringslösningen till centrum av filtret, stäng locket och lagra under 5 min vid RT. Centrifugera sedan i en minut för att eluera RNA, och upprepa detta steg en gång för erhållande av ~ 20 | il av RNA.
- Utföra behandlingen DNas I för 15 min vid 37 ° C.
- Kvantifiera RNA genom spektrofotometer med absorbans vid 260 nm. Förhållandet av optisk densitet vid våglängder av 260 nm och 280 nm används för att bedöma renheten avRNA (se tabell 1) 15.
6. Gene Expression Analysis
Obs: Genuttryck av långa RNA-species (som mRNA och lncRNAs) visas i Steg 6,1 och korta RNA-species (som mikroRNA) visas i steg 6,2. Olika kit finns tillgängliga för RT-qPCR och mängden RNA som krävs varierar beroende på kit (så lite som 10 ng). RNA-sekvenseringsanalys beskrivs i 6.3.
- Omvänt transkribera (RT) RNA till cDNA blanda 5 | il av 20 ng / ul RNA-prov med 5 | il av RT-huvudblandningen (RT-buffert, dNTP, slumpmässiga primrar, RT-enzymet, RNas-inhibitor). Inkubera reaktionen för 25 minuter vid 25 ° C, därefter 120 minuter vid 37 ° C och 5 min vid 85 ° C.
- Späd RT-reaktionen 1:10 med RNas fritt vatten och använda 2,5 | il per 10 pl qPCR reaktion med primrar eller grundfärg / probuppsättningar för generna av intresse.
Obs! För att underlätta analysen av delvis nedbruten RNA Det är tillrådligt att använda primers for kortare amplikoner (mindre än 100 bp) 16. (tabell 2B)- För mikroRNA expressionsanalys kör RT-reaktionen genom att blanda 5 il 2-10 ng / il RNA-prov med 5 pl av RT huvudblandning.
Obs: varje kommersiellt tillgängliga PCR-baserad mikroRNA detekteringsteknik kräver användning av egna och specifika RT primers.
- För mikroRNA expressionsanalys kör RT-reaktionen genom att blanda 5 il 2-10 ng / il RNA-prov med 5 pl av RT huvudblandning.
- Alternativt eller dessutom till RT-PCR, använder nästa generations sekvensering (RNA-punkter eller små-RNA-punkter) för att kvantifiera olika arter av RNA. Normalt använder 500 ng RNA för detta förfarande (Tabell 3) och utföra förfarandet som anges av tillverkaren och detekteringsinstrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en tidigare studie visade vi användning av LCM att samla epiteliala och stromala vävnader att jämföra uttrycksprofilering av RT-qPCR av mRNA och mikroRNA från frysta och FFPE prostatavävnader från samma patient 4. LCM är tidskrävande, i synnerhet om stora mängder RNA skall samlas in för nästa generations sekvenseringsanalys. Därför är det viktigt att hålla arbetsutrymmet och verktyg RNas-fritt. Det rekommenderas att undersöka kvalitets och cell-specificitet kontroller i RNA uppsamlades (diskuteras mer i detalj i nästa stycke). Figur 1 visar ett målat prostatasektion på en PEN-ram glida under mikroskop före och efter laser fångande godartad epitel .
När provet uppsamlas och RNA är noggrant heras, är det viktigt att bedöma RNA kvalitet och mängd som visas i Tabell 1. Det är inte ovanligt att observera låga 260/280 nm-förhållanden. Koncentrering av RNAförbättra 260/280 nm förhållanden, men det kan också orsaka förlust av små RNA-arter. Förutom kvalitetskontroller, är det viktigt att undersöka cell typspecifika kontroller för att bekräfta specificiteten av laser motivet av vävnaden (figur 1B - C). Till exempel i figur 1B uttrycket av AMACR gen mättes för att bekräfta prostatacancer epitelvävnad jämfört med normal epitelvävnad ,. I figur 1C uttrycket av NKX3.1 bekräftade frånvaron av stroma i LCM-samlas prov. Kvaliteten på RNA i provet kan också compareed till RNA med känd, god kvalitet RNA. RT-qPCR Ct-värdena för RNA som isolerats från LCM-collected- vävnad är i samma storleksordning som RNA samlas in från odlade primära epitelceller, bekräftar kvaliteten på lång och små RNA extraherat (tabell 2). Slutligen, tabell 3 visar att detta RNA är av tillräcklig kvalitet för nästa generations RNA sequencing.
Figur 1: Insamling av godartad epitel, prostatacancer epitel och stroma från human prostata med laser-capture mikro-dissektion (A) prostata biopsi färgades med toluidinblått före och efter LCM-samling av godartad epitel.. (B - C) vävnader som samlats in av LCM från 45 patienter uttrycker lämpliga genmarkörer av cellulär identitet 7. (B) AMACR är en markör för prostatacancer och kan endast detekteras i cancervävnader. (C) NKX3.1 är en markör för epitel och kan inte detekteras i stromala vävnader. Denna siffra är modifierad från Giangreco et al., JSBMB 2015 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: RNA kvalitet och kvantitet från LCM-samlats prostatavävnad.
Tabell 2: RT-qPCR från LCM samlas Prostate godartad epitel.
Tabell 3: RNAseq från LCM-samlats prostatavävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Profilering av genuttryck från prover från människa kan vara en utmaning, inte bara för kvalitet eller kvantitet av vävnad som finns, men även för de olika histologiska enheter som finns i ett givet vävnadsprov. Detta är speciellt utmanande i prostatan där benigna vävnader är till stor del stromala vävnader och områdena cancer saknar stroma. LCM underlättar fysisk separering av prostata stroma och epitel RNA för en mer exakt undertecknandet av de två olika celltyper (Figur 1A). I jämförelse med macrodissection eller hela vävnadsbehandling, kan LCM separera cellavdelningar i godartade vävnader, men är betydligt dyrare och arbetskrävande.
Som i alla teknik finns möjliga fallgropar. Till exempel kan RNA kvalitet vara delvis nedbrutna under den inledande prov upphandling eller under LCM och extraktionsmetod. I det första fallet kan genuttryck uppnås mäta olika kort amplikoner efter qPCR. I det andra fallet bör samvetsgrann RNas gratis behandling av alla de verktyg och material vidtas för att förhindra RNA nedbrytning, samt en noggrann hantering och bearbetning av vävnadssnitt. Dessutom begränsar den tid som spenderas på en bild till mindre än 90 minuter bibehåller RNA kvalitet under insamlingsprocessen. Den största begränsningen av LCM teknik är tillgången till ett LCM instrument och är arbete som krävs för att göra LCM.
Det finns flera typer av laser-capture microdissection mikroskop tillgängliga. Detta protokoll beskriver användning av en LCM som använder laser för att begränsa de områden, som sedan faller in i en samling cap nedan. Denna typ av LCM är idealisk för separation av epitel och stroma i prostatavävnad, som innehåller diskreta multicellulära områden för att samla in, men denna typ av LCM är inte lämplig för isolerings enstaka individuella celler från en vävnad. Till exempel bör detta protokoll inte användas för att samla bosatt makrofagers, neuroendokrina celler eller infiltrerande lymfocyter, som ofta är närvarande som enskilda celler. Det finns andra LCM instrument och metoder som använder en laser för att "skjuta" enstaka celler från vävnad på ett membran lock, vilket underlättar isolering av dessa andra celltyper.
Noggrann kvalitetskontroll och karakterisering av RNA kan inte förbises. Absorbans vid 260 nm är lämpligt för att kvantifiera RNA för RT-qPCR studier (Tabell 1), men för RNA-sekvensering av en färgämnesbaserad metod mer exakt kvantifierar RNA. En annan viktig fråga i RT-qPCR analysen är att undvika eventuell bias från kvarvarande DNA kontaminering. Detta kan åstadkommas genom användning av primers som spänner över introner. Det finns också hög patient heterogenitet i hushållerska genuttryck, därför använda av multipla Hushållerska gener föreslås och vi använder typiskt tre till 5 4,7-9 (Figur 1B - C och Tabell 2).
4. Nästa generations RNA-sekvensering är en effektiv teknik för att kvantifiera uttrycket för både korta och långa RNA-arter. Nästa generations sekvensering kan också upptäckten av nya RNA-arter 13. Lyckligtvis är kostnaden för nästa generations sekvensering minskar.
Sammanfattningsvis möjliggör detta protokoll RNA isolering av homogena populationer av epitelceller eller stromaceller från frusen prostatavävnad. RNA kan användas för ett flertal nedströms analystekniker för att tillhandahålla ett verktyg för noggrann celltyp-specifik genexpression i godartade och sjuka prostatan. Denna typ av data bidrar till kunskaps end förståelse för hur RNA uttryck skiljer sig sjukdomspatologin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4.0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
References
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
- McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
- Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
- Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
- Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
- Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
- Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95 (2010).
- Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165 (2010).
- Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
- Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
- Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
- Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
- Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246 (2014).
