Introduction
De prostaat is een heterogeen weefsel samengesteld uit secretoire epitheel gerangschikt in glandular acini omgeven door fibromusculaire stroma voornamelijk samengesteld uit gladde spieren 1. De epitheliale compartiment omvat vijf verschillende maar georganiseerde celtypes: basale cellen, secretorische cellen, neuro-endocriene cellen, transit versterken en stamcellen 2. Bij prostaatkanker (PCa), die voortvloeit uit de luminale epitheliale cellen, de groei van het adenocarcinoom veroorzaakt een duidelijke geleidelijke afname van het stromale compartiment 3. Daarom zullen weefselmonsters zijn duidelijke verschillen in het aandeel van stromale en epitheliale celtype gebaseerd op de mate van PCa. Deze verschillen kunnen leiden tot vertekende aannames van de genexpressie gegevens van hele weefsels verkregen ongeacht microdissectie van het gewenste celtype. Daarom, om deze bias te verwijderen is het noodzakelijk om celtypen te scheiden voorafgaand aan RNA-extractie engenexpressie analyse.
Macrodissection of microdissectie kan worden fysiek gescheiden goed gekarakteriseerde epitheliale delen van de omliggende stroma 4 -6. Macrodissection wordt meestal gedaan met een scheermesje onder een dissectiemicroscoop en werkt goed voor het scheiden van grote prostaatkanker knobbeltjes stroma, maar niet kan verwijderen goedaardige epitheel van omliggende stroma (zie voorbeeld goedaardige prostaat histologie in figuur 1). Microdissectie met een laser (LCM) aanzienlijk arbeidsintensiever dan macrodissection, maar kan zeer nauwkeurig ontleden goedaardige epitheel 4.
Recente publicaties van ons lab hebben aangetoond dat RNA met succes door de LCM van beide formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) biopten of bevroren weefsel 4,7-9 kan worden gewonnen. De belangrijkste uitdagingen in LCM-RNA-extractie zijn 1) om nauwkeurig ontleden de gewenste gebieden van het weefsel, en 2) te behouden RNA integriteit tijdens de LCM en isolatie proces 4,10. RNA geïsoleerd uit zuivere celpopulaties kunnen worden gebruikt voor genexpressieanalyse door verscheidene werkwijzen zoals reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR) 7,8, microarray 11 en diep -sequencing 12-14.
Het doel van dit protocol is het totaal RNA van LCM prostaat epitheel isoleren uit bevroren weefsel op stroomafwaartse genexpressie analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menselijke weefsels worden gebruikt voor deze experimenten werden verkregen via een Institutional Review Board goedgekeurd protocol en / of ontheffing aan de Universiteit van Illinois in Chicago.
1. Afdeling Fresh Frozen Prostaat op PEN-glijbaan en op Charged Glasplaatje
- De dag voor of een paar uur voor het snijden van het monster, schoon gereedschap (dat wil zeggen, kwast, tang, coplins, messen, PEN-omlijst dia's (indien nog niet RNase gratis), een ETOH veilige markering en een potlood) en de binnenkant van een RT cryostaat met RNase-ontsmetten oplossing met behulp van een spuitfles en lab-doekjes.
- Sta-RNase decontaminatie oplossing te zitten voor 5 minuten voor weg te vegen, spoelen met depcH 2 0 te verwijderen overgebleven RNase-ontsmetten oplossing en een laatste spoeling met 70% EtOH (bereid met depcH 2 0).
Opmerking: Het is essentieel om een RNase-free werkplek te handhaven. Alle coplins, gereedschappen, bevroren montage medium, bladen en slides gebruikt mag alleen worden gebruikt voor RNase vrij werken nooit in een standaard niet-RNase-vrije omgeving. Alle instrumenten moeten worden behandeld met RNase decontaminatie oplossing vóór elk experiment.
- Sta-RNase decontaminatie oplossing te zitten voor 5 minuten voor weg te vegen, spoelen met depcH 2 0 te verwijderen overgebleven RNase-ontsmetten oplossing en een laatste spoeling met 70% EtOH (bereid met depcH 2 0).
- Koel cryostaat tot -24 ° C.
- Plaats de volgende gereinigd RNase-free instrumenten binnen cryostaat minstens 30 minuten afkoelen voordat snijden: slide Coplin gevuld met 100% ethanol, gereedschappen, kleine bevroren weefselcassettes en montage klem.
- Ophalen bevroren prostaatweefsel van cryo en plaats in een droge-ijs gevulde schuim emmer voor transport. Plaats weefsel in cryostaat in evenwicht temperatuur cryostaat gedurende tenminste 30 min.
Opmerking: menselijke prostaat weefsels voor laser-capture micro-dissectie kan zowel vers bevroren of zijn formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE). De tijdsdruk en voorbereiding glijbaan zijn iets anders tussen weefsel bronnen. Hier beschrijven we de stappen voor ingevroren secties. - Werken met een tissue tegelijk en spuit bevroren fixeermiddel in de bottom van de cassette en snel te monteren de bevroren prostaatweefsel in de bevroren montage medium met behulp van de gekoelde pincet.
- Plaats de cassette met weefsel op chiller in cryostaat 5 min op bevroren montage medium in te stellen.
- Squirt een kleine hoeveelheid bevroren montage medium op de boorkop en zorgvuldig druk gemonteerd weefsel onderkant naar boven op de bevroren montage medium. Laat in de cryostaat gedurende 5 min om de bevroren fixeermiddel volledig stollen.
- Plaats de klem in de houder en draai.
- Vergrendelen de hendel in de vergrendelde stand en plaats een nieuw blad op de cryostaat. Voor stroomafwaartse moleculaire eindpunten dat een amplificatiestap omvatten (dwz qPCR) is het raadzaam om een nieuw blad gebruiken voor elke patiënt om contaminatie te voorkomen (of beweegt het blad naar oppervlakte van het blad te gebruiken voor het volgende monster).
- Ontgrendelen van de handgreep en het weefsel voorzichtig vooruit met de hand of met een voetpedaal om zelfs en het weefsel bloot te leggen met 50 μm gedeelten totdat de gewenste belichting weefsel bereikt.
- Pas cryostaat tot 5 urn, gesneden één of twee gedeelten en plaats ze op glasplaatje gebracht voor hematoxyline en eosine (H & E) kleuring (zie stap 2).
- Plaats onmiddellijk de dia in de koude 100% ethanol gedurende 2 minuten.
- Verwijder de geladen glasplaatje uit ethanol en laat het drogen op kamertemperatuur alvorens tot H & E kleuring (stap 2).
- Plaats RT PEN frame dia op een frame supporter.
- Pas cryostaat tot 10 pm en plaats delen op het RT PEN kader dia's. Een tot vier secties kan plaatsvinden op elke dia afhankelijk weefselgrootte.
- Onmiddellijk duik de dia in de koude 100% ethanol gedurende 2 minuten.
- Verwijder de PEN frame dia's uit ethanol en bewaar de dia in een dia doos in een exsiccator doos in een -80 ° C vriezer tot klaar voor LCM. Drie dagen is de maximale bewaartermijn voor een optimale RNA herstel.
- Ga verder met Stap 2 voor alleen de geladen glas gleede. Ga verder met stap 3 voor PEN frame glijbaan.
2. hematoxyline en eosine-Y (H & E) Stain voor histologisch Mark-up
Opmerking: Dit als om het weefsel op de geladen glasplaatje en NIET de PEN-kader glijbaan voor LCM.
- Hydrateren secties in de geladen glasplaatje dompelen van de schuif door gegradeerde ethanol als volgt: dompel de dia tweemaal in 100% ethanol gedurende 3 min, tweemaal in 95% ethanol gedurende 3 minuten, eenmaal in 70% ethanol gedurende 3 min en twee keer in gedestilleerd H 2 O 3 min.
- Bereid zure alcoholoplossing: 99 ml 70% ethanol + 1 ml 1% HCl en 0,1% natriumbicarbonaatoplossing: 0,1 g natriumbicarbonaat in 100 ml gedestilleerd H2 O
- Dompel de dia in Hematoxyline Gill II (0,4%) gedurende 5 minuten.
- Afwassen overtollige vlek in stabiele lopende kraan H 2 O 3 min.
- Dompel de dia 10 keer in zuur alcohol
- Was de dia in stromend leidingwater H 2 O 3 min.
- Dompel de diain 0,1% natriumbicarbonaat oplossing 30-60 seconden de paarsachtige kleur blauw.
- Was de dia in stromend leidingwater H 2 O 3 min.
- Spoel de dia in 95% ethanol met 10 dips.
- Dompel de dia in Eosine-Y 2-3 keer gedurende 15 sec totaal.
- Dehydrateer de schuif door gesorteerde ethanol als volgt: dompel de dia twee keer in 95% ethanol, twee keer in 100% ethanol, en twee keer in xyleen (zorg ervoor dat het weefsel wordt duidelijk welke grondige uitdroging aangeeft).
- Monteer de dia met niet-waterige permanente harde montage medium en dekglas.
- Laat de dia drogen 30 min.
- Grote afbeelding van een hoge-resolutie scan dia met elke hele dia scanner en printen op 8 "x 11" papier.
- Schets aandachtsgebieden (meestal gedaan door een bevoegd patholoog) met een marker. Deze opmaak is de gids voor de LCM procedure.
3. toluïdineblauw kleuring van PEN-kader Slides
Opmerking: Thwordt gedaan op dezelfde dag als het LCM. Gebruik depcH 2 O water voor alle oplossingen. Voltooi alle stappen in RNase-vrij gebied. Alle coplins moeten worden gereinigd met RNase-ontsmetten oplossing.
- De dag van LCM verwijder de PEN-kader slides van -80 ° C vriezer en hydrateren door zachtjes dompelen dia's in 90% EtOH gedurende 2 minuten dan 75% EtOH gedurende 2 minuten.
- Bereid 0,5% toluïdineblauw door oplossen in de moleculaire biologie kwaliteit water vervolgens filteren steriliseren door een 0,2 um filter en bewaar bij kamertemperatuur. Deze oplossing kan worden hergebruikt voor maximaal 6 maanden. NB: Het wordt sterk aangeraden om de oplossing te bereiden voorafgaand aan de filtratie een paar uur kan duren.
- Vlekken op de prostaat weefsel door voorzichtig te dompelen dia's in 0,5% toluïdineblauw voor 5-30 sec. Destain het weefsel door wassen glijdt 2 keer depcH 2 O 15 seconden gevolgd door 75% EtOH gedurende 30 sec tot 3 min. Opmerking: vlek en destain tijd worden ingesteld om een goede kleuring te garanderen. Prostate neiging heeft om te vlek.
4. Laser-capture Micro-dissectie (LCM)
- Onmiddellijk voorafgaand aan LCM, droge dia een dia warmer bij 42 ° C gedurende 15 min. Droog alleen de dia die zal worden verwerkt en bewaar de rust op het ijs totdat klaar voor hen.
- Schakelen LCM en de computer in deze volgorde, microscoop macht, de laser-toets, de laser schakelaar en start de computer. Start de Laser Microdissection software.
- Gebruik de software om de microscoop om de dia's en het verzamelen buizen Load Control. Klik op "unload monsterhouder", laadt de dia met de secties op de microscoop diahouder met het weefsel naar beneden en plaats de houder dia in de juiste sleuf in de microscoop, klik op "doorgaan".
- Klik op "unload collectie buizen", label en laad 0,5 ml buizen op de buis houder en plaats deze in de juiste sleuf in het instrument. Eenscaps zijn beveiligd, voeg 35 ul van Lysis buffer om de collectie caps en proberen te bellen te voorkomen. Klik vervolgens op "OK".
Opmerking: als verdamping is een probleem, verdunnen als volgt de buffer: 25 ul lysisbuffer met 10 ul depcH2O.
- Klik op "unload collectie buizen", label en laad 0,5 ml buizen op de buis houder en plaats deze in de juiste sleuf in het instrument. Eenscaps zijn beveiligd, voeg 35 ul van Lysis buffer om de collectie caps en proberen te bellen te voorkomen. Klik vervolgens op "OK".
- In de software, selecteer de positie waar de dia heeft in de diahouder geplaatst. Selecteer de collectie dop om de LCM specimen verzamelen.
- Visualiseren en de focus van de dia via de computer op 10X. Gebruik de software om de laser te kalibreren door het selecteren van "Laser" en vervolgens "kalibreren". Pas de macht, diafragma en de snelheid van de laser, het selecteren van "laser" dan "control" zodat de laserbundel met de complete en efficiënte geselecteerde gebied snijden. Herhaal aanpassingen totdat de laser snijdt volledig door het weefsel.
- Met behulp van de 8 "x 11" patholoog mark-up als een gids, de "tekenen vorm" instrument om de gewenste gebieden van epithe omschrijvenlium in het uitzicht en vermijd verzamelen elke stroma.
Opmerking: meerdere gebieden kunnen worden gekozen binnen een uitzicht, maar niet verplaatsen naar een andere weergave zonder eerst te snijden door te klikken op de "cut vorm" tool.- Als een gebied niet volledig te snijden door de laser de "bewegen en snijd" tool om handmatig te gaan over. Verplaats de doelstelling nieuwe inzichten en herhaal lasersnijden tot slede volledig ontleed of de gewenste hoeveelheid weefsel is verzameld (typisch 100 benigne klieren op 150-500 ng RNA). (zie voorbeeld in figuur 1A).
- Verwijder voorzichtig buizen uit de collectie houder en sluit de doppen, die bewust van de lysisbuffer en weefsel in de doppen. Kort centrifugeer 30 sec vloeistof en weefsel te verzamelen op de bodem van de buis. Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 30 min en bewaar bij -80 ° C tot klaar voor RNA-isolatie.
5. Totaal RNA isolatie met Fil-ter gebaseerde Kit en Kwaliteit Analyse
- Ontdooi de buizen op ijs en breng het volume van de oplossing tot 100 ul.
- Pre-nat het microfilter van de RNA isolatie kit door toepassing 30 ul ofLysis oplossing naar het midden van de filter en laat het inwerken whileperforming de volgende twee stappen (minimaal 5 min).
- Voeg 3 ul van LCM Bewaarvloeistof (verschaft in de kit) aan het lysaat en door vortexen gemengd gedurende 5 sec. Centrifugeer gedurende 30 seconden om de vloeistof te verzamelen op de bodem van de buis.
- Centrifugeer de pre-bevochtigd filter voor ~ 30 sec op topsnelheid om vloeistof te verwijderen.
- Voeg 1,25 delen (in dit geval 129 pl) van 100% ethanol aan het lysaat mengsel voorzichtig vortex of pipet op en neer. ** Deze methode zal zowel grote als kleine RNA soorten te herstellen.
- Laad het monster op de vooraf bevochtigde microfilter en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut aan het RNA aan het filter binden. Daarna wassen microfilter met 180 gl "wasoplossing 1, R21; Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 min.
Let op: Vanaf dit punt alle centrifugaties moet worden gedaan bij 13.000 xg, of maximum snelheid. - Was filter tweemaal met 180 gl "wasoplossingen 2 en 3", respectievelijk aangegeven door de kit protocol. Centrifugeer 30 sec, gooi dan de stroom door en draai de filter gedurende 1 minuut om resterende vocht te verwijderen en het filter drogen.
- Transfer filter om een nieuwe collectie buis.
- Warm elutieoplossing tot -95 ° C (bij de kit).
- Breng 10 pl voorverwarmde elutieoplossing naar het midden van het filter, sluit de dop en opslaan gedurende 5 min bij RT. Centrifugeer 1 minuut aan het RNA te elueren, en herhaal deze stap eenmaal onder verkrijging ~ 20 pi RNA.
- Voer de DNase I behandeling van 15 minuten bij 37 ° C.
- Kwantificeren RNA door spectrofotometer met absorptie bij 260 nm. De verhouding van de optische dichtheid bij een golflengte van 260 nm en 280 nm wordt gebruikt om de zuiverheid van de beoordelenRNA (zie tabel 1) 15.
6. Gene Expression Analysis
Opmerking: genexpressie van lange RNA soorten (zoals mRNA en lncRNAs) wordt getoond in stap 6.1 en korte RNA soorten (zoals microRNA's) wordt getoond in stap 6.2. Verschillende kits beschikbaar voor RT-qPCR en de hoeveelheid RNA vereist varieert per kit (zo weinig als 10 ng). RNA sequentie analyse wordt beschreven in 6.3.
- Reverse transcriberen (RT) het RNA in cDNA mengen 5 pl 20 ng / pl RNA monster met 5 ui van de RT master mix (RT buffer, dNTP's, willekeurige primers, RT enzym RNase inhibitor). Incubeer het reactiemengsel gedurende 25 min bij 25 ° C, daarna 120 minuten bij 37 ° C en 5 minuten bij 85 ° C.
- Verdun de RT-reactie 1:10 met RNase vrij water en het gebruik van 2,5 ul per 10 ul qPCR reactie met primers of primer / probe-sets voor de genen van belang.
Opmerking: Om de analyse van gedeeltelijk afgebroken RNA vergemakkelijken Het is raadzaam om primers gebruiken for kortere amplicons (minder dan 100 bp) 16. (Tabel 2B)- Voor microRNA expressie analyse uitvoeren van de RT-reactie door het mengen van 5 ul van 2-10 ng / ul RNA-monster met 5 pi van de RT-master mix.
Let op: iedere commercieel verkrijgbare PCR-gebaseerde microRNA detectie technologie vereist het gebruik van eigen en specifieke RT primers.
- Voor microRNA expressie analyse uitvoeren van de RT-reactie door het mengen van 5 ul van 2-10 ng / ul RNA-monster met 5 pi van de RT-master mix.
- Alternatief of in aanvulling op RT-PCR gebruikt next generation sequencing (RNA-seq of klein RNA-seq) verschillende soorten RNA te kwantificeren. Gewoonlijk gebruiken 500 ng RNA voor deze procedure (Tabel 3) en het uitvoeren van de werkwijze zoals aangegeven door de fabrikant en detectie instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een eerdere studie toonde wij het gebruik van LCM op epitheliale en stromale weefsels verzamelen om expressie profilering vergelijken door RT-qPCR van mRNA en microRNAs uit bevroren en FFPE prostaat weefsel van dezelfde patiënt 4. LCM is tijdrovend, met name wanneer grote hoeveelheid RNA te verzamelen voor de volgende generatie sequencing analyse. Daarom is het cruciaal om de werkruimte te houden en gereedschappen RNase-free. Het wordt aanbevolen om de kwaliteit en cel-specificiteit controles in de opgevangen (in meer detail besproken in de volgende paragraaf) RNA onderzocht. Figuur 1 toont een gekleurde prostaat doorsnede op PEN frame dia onder de microscoop voor en na de laser vastleggen goedaardige epitheel .
Nadat het monster wordt genomen en het RNA wordt zorgvuldig gehaald, is het belangrijk om RNA kwaliteit en kwantiteit te evalueren zoals getoond in tabel 1. Het is niet ongewoon lage 260/280 nm verhoudingen observeren. Concentreren van het RNAverbetering van de 260/280 nm verhoudingen, maar het kan ook het verlies van kleine RNA species veroorzaken. Naast kwaliteitscontroles, is het cruciaal om celtype-specifieke controles te onderzoeken om de specificiteit van de laser veroverde gebied van het weefsel (Figuur 1B - C) te bevestigen. Bijvoorbeeld, in figuur 1B de expressie van AMACR gen werd gemeten prostaatkanker epitheelweefsel bevestigen vergeleken met normaal epitheelweefsel ,. In figuur 1C bevestigde de expressie van NKX3.1 de afwezigheid van stroma in de LCM verzamelde monster. De kwaliteit van het RNA in het monster kan ook worden compareed RNA van bekende, goede kwaliteit RNA. RT-qPCR Ct-waarden voor RNA geïsoleerd uit LCM-collected- weefsel in hetzelfde bereik als RNA vanuit gekweekte primaire epitheliale cellen, bevestigt de kwaliteit van lange en kleine RNA geëxtraheerd (tabel 2). Tenslotte Tabel 3 blijkt dat dit RNA van voldoende kwaliteit voor de volgende generatie RNA sequencing.
Figuur 1: Verzamelen van goedaardige epitheel, prostaatkanker epitheel en stroma van menselijke prostaat met laser-capture micro-dissectie (A) prostaatbiopsie gekleurd met toluïdineblauw voor en na LCM-collectie van de goedaardige epitheel.. (B - C) Tissues verzameld door LCM van 45 patiënten uiten juiste gen markers van cellulaire identiteit 7. (B) AMACR is een marker van prostaatkanker en is alleen detecteerbaar in kankerweefsels. (C) NKX3.1 is een marker van epitheel en is niet detecteerbaar in stromale weefsels. Dit cijfer is aangepast van Giangreco et al., 2015 JSBMB 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: RNA kwaliteit en kwantiteit van-LCM verzameld prostaatweefsel.
Tabel 2: RT-qPCR van LCM verzameld Prostaat goedaardige epitheel.
Tabel 3: RNAseq uit-LCM verzameld prostaatweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genexpressie profilering van humane monsters kan lastig zijn, niet alleen voor de kwaliteit of kwantiteit van weefsel mogelijk, maar ook de verschillende zich in een bepaald weefsel specimen histologische entiteiten. Deze Vooral in de prostaat waarin goedaardige weefsels grotendeels stromale weefsels en delen van kanker zijn verstoken van stroma. LCM vergemakkelijkt fysieke scheiding van prostatische stroma en epitheel RNA een nauwkeuriger handtekening van de twee verschillende celtypen (Figuur 1A). In vergelijking met macrodissection of hele weefsel verwerking, kan LCM cel compartimenten te scheiden in goedaardige weefsels, maar is beduidend duurder en arbeidsintensief.
Zoals bij elke techniek er mogelijke valkuilen. Bijvoorbeeld, kan RNA kwaliteit zijn gedeeltelijk afgebroken tijdens de eerste exemplaar inkoop of tijdens het LCM en extractie procedure. In het eerste geval kan genexpressie worden verwezenlijkt meten verschillende korte ampliconen door qPCR. In het tweede geval dient zorgvuldig RNase behandeling van alle instrumenten en materialen worden genomen om RNA degradatie, evenals een zorgvuldige behandeling en verwerking van de weefselsecties te voorkomen. Bovendien, het beperken van de tijd besteed aan de ene dia naar minder dan 90 min onderhoudt RNA kwaliteit tijdens het incassotraject. De grootste beperking van de LCM techniek is de toegang tot een LCM instrument en is de arbeid die nodig is om de LCM te doen.
Er zijn verschillende soorten laser-capture microdissectie microscopen beschikbaar. Dit protocol beschrijft het gebruik van een LCM de laser gebruikt om de gebieden die vervolgens valt in een verzameling cap hieronder omschrijven. Dit type LCM is ideaal voor het scheiden van epitheel en stroma in prostaatweefsel waarin multicellulaire discrete gebieden bevat te verzamelen, maar dit type LCM is niet geschikt voor isolatie enkele afzonderlijke cellen van een weefsel. Zo moet dit protocol niet gebruikt om resident macrofagen verzamelens, neuro-endocriene cellen en infiltrerende lymfocyten, die vaak aanwezig zijn als enkele cellen. Er zijn andere LCM instrumenten en methoden die een laser gebruiken om "te schieten" enkele cellen uit weefsel op een membraan dop, die isolatie van deze andere celtypen vergemakkelijkt.
Grondige kwaliteitscontrole en karakterisering van de RNA niet kan worden over het hoofd gezien. De absorptie bij 260 nm is geschikt RNA voor RT-qPCR studies (tabel 1) te kwantificeren, maar voor RNA-sequencing dye-methode nauwkeuriger kwantificeert het RNA. Een ander belangrijk punt in de RT-qPCR analyse is om mogelijke vertekening van residuele DNA besmetting te voorkomen. Dit kan worden bereikt door het gebruik van primers die introns omvatten. Er is ook hoog patiënten heterogeniteit in huishoudster genexpressie daarom gebruik van meerdere genen huishoudster voorstelt en we gebruiken meestal 3-5 4,7-9 (Figuur 1B - C en tabel 2).
4. De volgende generatie RNA sequentie is een effectieve methode om de expressie gekwantificeerd voor korte en lange RNA species. Next-generation sequencing maakt het ook mogelijk ontdekking van nieuwe RNA soorten 13. Gelukkig is de kosten van de volgende generatie sequencing afneemt.
Kortom, dit protocol maakt RNA isolatie van homogene populaties van epitheelcellen of stromacellen uit bevroren prostaatweefsel. Het RNA kan worden gebruikt voor tal downstream analysetechnieken een instrument voor typespecifieke accurate cel genexpressie in goedaardige en zieke prostaat verschaffen. Dit soort gegevens draagt bij aan een kennisd begrip van RNA-expressie verschilt in ziekte pathologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4.0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
References
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
- McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
- Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
- Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
- Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
- Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
- Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95 (2010).
- Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165 (2010).
- Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
- Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
- Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
- Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
- Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246 (2014).
