Introduction
Prostat bezi, öncelikle düz kas 1 oluşan Fibromusküler stroma ile çevrili glandüler asinüs düzenlenmiş salgı epitel oluşan heterojen bir dokudur. Bazal hücreler, salgı hücreleri, nöroendokrin hücre transit yükselterek hücre ve kök hücre 2: epitelial bölmesi, beş farklı ama organize hücre tiplerinin oluşur. Luminal epithelial hücrelerde ortaya çıkar, prostat kanseri (PCa) 'de, adenokarsinom büyüme stromal bölmesinde 3 arasında belirgin bir aşamalı bir düşüş olur. Bu nedenlerden dolayı, doku örnekleri PCa ölçüde göre stromal ve epitelyal hücre tipinin orantılı olarak belirgin farklılıklar vardır. Bu farklılıklar, istenen hücre tipi mikrodiseksiyon bakılmaksızın tüm dokulardan elde edilen gen ekspresyon verileri yanlı varsayımlar yol açabilir. Bu nedenle, bu önyargı kaldırmak için onu önce RNA ekstraksiyon ve hücre tiplerini ayırmak için esastırgen ekspresyon analizi.
Macrodissection ya mikrodiseksiyon fiziksel çevredeki stroma 4 -6 den iyi karakterize edilmiş epitelyal alanları ayırmak için kullanılabilir. Macrodissection tipik bir mikroskop altında bir jilet ile yapılan ve büyük PCa stromadan nodüller ayırmak için iyi çalışır, ancak stroma çevreleyen benign epitel kaldırma yeteneğine sahip değildir (Şekil 1'de huylu prostat histoloji örneğe bakın). Bir lazer (LCM) ile Mikrodisseksiyonla macrodissection önemli ölçüde daha fazla emek yoğun, ama çok doğru bir iyi huylu epitel 4 incelemek olabilir.
Bizim laboratuardan Son yayınlar RNA başarıyla formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) biyopsi veya dondurulmuş doku 4,7-9 birinden LCM tarafından elde edilebilir olduğunu göstermiştir. LCM-RNA ekstraksiyonu büyük zorluklar R 1) doğru dokuda istenilen alanlarını incelemek için, ve 2) korumak için vardırLCM ve izolasyon işlemi 4.10 sırasında NA bütünlüğü. Saf hücre popülasyonlarının izole RNA ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) 7,8, mikrodizi 11 ve derin -sequencing 12-14 dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle gen ekspresyon analizi için kullanılabilir.
Bu protokolün amacı, aşağı doğru gen ekspresyon analizleri donmuş dokudan LCM prostatik epitel toplam RNA'nın izole edilmesi için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deneyler için kullanılan tüm insan dokuları Chicago'daki Illinois Üniversitesi'nde Kurumsal Değerlendirme Kurulu onaylı protokol ve / veya muafiyet yoluyla elde edildi.
1. Bölüm Taze Donmuş Prostat PEN-slayt üzerine ve Ücretli Cam Slide üzerine
- Bir gün önce veya bir kaç saat numune kesit önce, temiz araçlar (yani, fırça, forseps, coplins, bıçaklar, PEN-çerçeveli slaytlar (değilse zaten RNaz ücretsiz), bir ETOH güvenli işaretleyici ve bir kalem) ve iç Bir sprey şişesi ve laboratuar mendil kullanarak çözüm-dekontaminasyon RNaz RT Kriyostat.
- RNaz dekontaminasyon çözüm silerek önce 5 dakika boyunca oturup çözüm ve (depcH 2 0 ile hazırlanan)% 70 EtOH ile son durulama RNaz-dekontaminasyon üzerinde sol kaldırmak için depcH 2 0 ile durulayın izin verin.
Not: Bir RNaz ücretsiz çalışma alanı korumak için şarttır. Tüm coplins, araçlar, dondurulmuş montaj orta, bıçaklar ve kullanılan slaytlar RNaz ücretsiz iş için yalnızca kullanılmalıdırve standart bir olmayan RNaz ortamda hiç kullanmadım. Tüm enstrümanlar her deneyden önce bir Rnase dekontaminasyon solüsyonu ile tedavi edilmelidir.
- RNaz dekontaminasyon çözüm silerek önce 5 dakika boyunca oturup çözüm ve (depcH 2 0 ile hazırlanan)% 70 EtOH ile son durulama RNaz-dekontaminasyon üzerinde sol kaldırmak için depcH 2 0 ile durulayın izin verin.
- -24 ° C'ye soğutun kriyostat.
- Önce Kesit en az 30 dakika soğumasını kriyostat içinde aşağıdaki temizlenmiş RNaz ücretsiz araçlar yerleştirin: slayt coplin dolu% 100 etanol, araçlar, küçük dondurulmuş doku kaset ve montaj mandren ile.
- Taşınması için bir kuru buz dolu bir köpük halinde dondurulup ve kova yere donmuş prostat dokusunu al. En az 30 dakika boyunca sıcaklık kriyostat denge sağlaması için kriyostat halinde doku yerleştirin.
Not: lazer yakalama mikro diseksiyon İnsan prostat dokuları taze dondurulmuş veya da olabilir parafine gömülü (FFPE) formalin ile fikse. Zaman kısıtlamaları ve slayt hazırlama doku kaynakları arasında biraz farklıdır. Burada donmuş kesitler için adımları açıklar. - Bir seferde bir doku ile Çalışma ve botto içine donmuş montaj orta fışkırtmaKasetin m ve hızlı bir şekilde soğutulmuş forseps kullanılarak dondurulmuş montaj ortama donmuş prostat dokusunu monte edin.
- Dondurulmuş montaj orta ayarlamak için 5 dakika süreyle kriyostat içinde soğutucu üzerine doku ile kaseti yerleştirin.
- Chuck üzerine dondurulmuş montaj orta küçük bir miktar Squirt ve dikkatle dondurulmuş montaj ortamına kadar monte doku alt tarafı basın. 5 dk dondurulmuş montaj orta tamamen katılaşmaya izin vermek için kriyostat ayarlanır edelim.
- Tutucu içine aynasını yerleştirin ve sıkın.
- Kilitli pozisyonda kolu kilitleyin ve kriyostat üzerine yeni bir bıçak yerleştirin. Amplifikasyon aşamasını içerir aşağı moleküler uç noktaları için (yani, qPCR) bu bulaşmayı önlemek (veya sonraki numune için bıçak alanı kullanabilirsiniz üzerinde bıçağı taşımak) her hasta için yeni bir bıçak kullanılması tavsiye edilir.
- Kolu kilidini ve dikkatle eşitlemek için elle veya bir ayak pedalı ile doku ilerlemek ve 50 mikron ile doku maruzistenen doku maruz kadar m bölümleri ulaşılır.
- 5 um Kriyostat ayarlayın, bir veya iki bölümleri kesmek ve hematoksilen ve eozin (H & E) boyama için ücret cam slayt üzerine yerleştirin (Adım 2).
- Hemen 2 dakika süreyle soğuk% 100 etanol içine slayt yerleştirin.
- Etanol tahsil cam slayt çıkarın ve H & E boyama (Adım 2) geçmeden önce oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- Bir çerçeve destekçisi RT PEN-çerçeve slayt yerleştirin.
- RT PEN çerçeve slaytlar üzerine 10 mikron ve yer bölümlerine Kriyostat ayarlayın. Bir dört bölümler doku büyüklüğüne bağlı olarak her bir slayt üzerine bir yer olabilir.
- Hemen 2 dakika süreyle soğuk% 100 etanol içine slayt dalma.
- Etanol PEN-frame slaytları çıkarın ve LCM için hazır olana kadar -80 ° C derin dondurucuda bir desiccator kutusunda bir slayt kutusuna slayt saklayın. Üç gün Optimal RNA kurtarma için maksimum depolama süresidir.
- Tahsil cam kaydırdı SADECE Adım 2 ile devam edine. PEN-frame slayt için Adım 3 ile devam edin.
2. Hematoksilen Eozin ve-Y (H & E) histolojik Mark-up için Leke
Not: Bu yüklü cam slayt doku ve DEĞİL LCM PEN-çerçeve slayt için eğer.
- Aşağıdaki gibi derecelendirilmiştir etanol ile slayt daldırma yüklü cam slayt bölümleri hidrat: 3 dakika için iki% 70 etanol içinde bir kez 3 dakika boyunca, 3 dakika süre ile kayıcı% 95 etanol içinde iki kez% 100 etanol içinde iki kez daldırma 3 dakika boyunca damıtılmış H 2 O zamanlar.
- 99 ml% 70 etanol + 1 mi% 1 HCI ve% 0.1 sodyum bikarbonat çözeltisi: 100 ml içinde 0.1 g sodyum bikarbonat damıtılmış H2O asidi alkolü çözeltisi hazırlayın
- 5 dakika boyunca hematoksilin Gill II (% 0.4) slayt batırın.
- 3 dakika sürekli çalışan musluk H 2 O aşırı leke yıkayın.
- Kayıcı asit alkol 10 kez batırın
- 3 dakika boyunca musluk H 2 O çalışan slayt yıkayın.
- Slayt Dip% 0.1 sodyum bikarbonat çözeltisi içinde 30-60 sn mavi mor renge dönüşür için.
- 3 dakika boyunca musluk H 2 O çalışan slayt yıkayın.
- 10 dips% 95 etanol içinde slayt durulayın.
- 15 saniye toplam Eozin-Y 2-3 kez slayt batırın.
- Aşağıdaki gibi kademeli etanol ile slayt dehydrate: Ksilen slayt% 95 etanol içinde iki kez,% 100 etanol içinde iki kez ve iki kez daldırma (doku kapsamlı dehidratasyon gösterir açıkça göründüğünden emin olun).
- Sulu olmayan kalıcı sabit montaj orta ve kapak kayma ile slayt monte edin.
- 30 dakika boyunca slayt kurumasını bekleyin.
- Herhangi bir tam slayt tarayıcı ile tarama slayt ve 8 "x 11" kağıt üzerine bir büyük, yüksek çözünürlüklü görüntü yazdırmak.
- Ilgi Anahat alanları işaretleyici ile (genellikle bir kurul onaylı patolog tarafından yapılır). Bu biçimlendirme LCM prosedürü için kılavuzdur.
PEN-frame Slaytlar 3. Toluidine Mavi Boyama
Not: ThLCM olarak AYNI GÜN yapılır edilir. Tüm çözümler için depcH 2 O su kullanın. RNaz ücretsiz alan tüm adımları tamamlayın. Tüm coplins RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile temizlenmelidir.
- LCM gün 2 dakika süreyle daha sonra 2 dakika süreyle% 90 EtOH içine yavaşça daldırma slaytlar tarafından% 75 EtOH -80 ° C derin dondurucuda ve hidrat gelen PEN-frame slaytları çıkarın.
- Daha sonra oda sıcaklığında 0.2 um'lik bir filtreden ve mağaza sterilize filtre moleküler biyoloji sınıfı su içinde eritilmesi ile% 0.5 toluidin mavisi hazırlayın. Bu çözelti, en fazla 6 ay süreyle yeniden kullanılabilmektedir. Not: Bu son derece öncesinde filtrasyon birkaç saat sürebilir olarak solüsyonu hazırlamak için tavsiye edilir.
- Yavaşça 5-30 saniye boyunca% 0.5 toluidin mavisi içine slaytlar batırarak prostat dokusunu Leke. Yıkama ile doku 3 dakika için 30 saniye için% 75 EtOH, ardından 15 saniye boyunca depcH 2 O 2 kez slaytlar destain. Not: Leke ve destain süreleri iyi boyama sağlamak için ayarlanabilir. Prostat leke üzerinde eğilimindedir.
4. Lazer yakalama Mikro diseksiyon (LCM)
- LCM, 15 dakika boyunca 42 ° C 'de sıcak bir slayt kuru slayt hemen önce. Işlenmiş ve onlar için hazır olana kadar buz üzerinde kalan saklamak olacak Kuru, sadece slayt.
- LCM ve bilgisayar bu sırada, mikroskop gücü, lazer tuşu, lazer anahtarı ve ardından bilgisayarı açın. Lazer Diseksiyon yazılımını başlatın.
- Slaytlar ve toplama tüpleri yüklemek için mikroskop kontrol etmek için yazılımı kullanın. Daha sonra "Devam" butonuna tıklayınız, "boşaltma numune tutucu" üzerine tıklayın aşağı bakacak şekilde doku ile mikroskop lamı sahibinin üzerine bölümleri ile slayt yüklemek ve mikroskopta uygun yuvaya slayt tutucu takın.
- "Boşaltma toplama tüpleri", etiketin üzerine tıklayın ve tüp tutucu üzerine 0.5 ml tüpler yüklemek ve enstrüman uygun yuvaya takın. bir Zamanlarkapaklar toplama kapaklar Lizis tampon 35 ul ekleyin ve kabarcıkları önlemek için deneyin, güvencesindedir. Daha sonra "Tamam" a tıklayın.
Not: 25 ul lizis tamponu 10 ul depcH2O ile: buharlaşma bir sorun varsa, aşağıdaki gibi tampon sulandırmak.
- "Boşaltma toplama tüpleri", etiketin üzerine tıklayın ve tüp tutucu üzerine 0.5 ml tüpler yüklemek ve enstrüman uygun yuvaya takın. bir Zamanlarkapaklar toplama kapaklar Lizis tampon 35 ul ekleyin ve kabarcıkları önlemek için deneyin, güvencesindedir. Daha sonra "Tamam" a tıklayın.
- Yazılımda, slayt slayt tutucuya yerleştirildi konumu seçin. LCM numune toplamak için toplama kapağı seçin.
- Görselleştirmek ve 10X de bilgisayar aracılığıyla slayt odaklanır. Ardından "kalibre" "Laser" seçerek lazer kalibre etmek için yazılımı kullanın. Lazer ışını tamamen ve verimli seçilen alanı kesmek için izin lazerin güç, diyafram ve hız, seçme "lazer", sonra "kontrol" ayarlayın. Tamamen doku içinden lazer kesim kadar ayarlamalar tekrarlayın.
- Bir kılavuz olarak 8 "x 11" patolog mark-up kullanarak, epithe istenilen alanlarını sınırlamak için "şekil çizmek" aracını kullanıngörünümünde Lium herhangi bir stroma toplama önlemek.
Birden alanlar tek bir görünümde içinde seçilebilir, ancak "şeklinde kesmek" aracını tıklayarak ilk kesme olmadan başka görünüme hareket etmiyor: Not.- Bir alan tamamen lazerle kesilmiş olsun yoksa manuel üzerine gitmek için "hareket ve kesim" aracını kullanın. Yeni görüşlere hedefi hareketli Devam ve slayt tamamen disseke edilir veya doku istenilen miktarda tahsil edilene kadar lazer kesim tekrarlayın (tipik olarak 100 huylu bezleri RNA 150-500 ng verim). (Şekil 1A örneğe bakın).
- Dikkatle kapaklar lizis tamponu ve doku dikkatli olmak, tahsilat sahibinin tüpleri kaldırmak ve kapaklarını kapatın. Kısaca tüpünün dibinde sıvı ve doku toplamak 30 sn için santrifüjlenir. RNA izolasyonu için hazır olana kadar -80 ° C'de 30 dakika ve mağaza 42 ° C'de inkübe edin.
Bir Fil ile 5. Toplam RNA izolasyonuter bazlı Takımı ve Kalite Analizleri
- Buz üzerinde tüpler dışarı çözülme ve 100 ul çözümün ses getirmek.
- Filtrenin merkezine 30 ul ofLysis Çözüm uygulayarak RNA izolasyon kiti, mikro filtre önceden ıslak ve sonraki iki adımı (en azından 5 dakika) whileperforming bekletin.
- Lizat (kitte sağlanan) LCM katkı maddesi çözeltisi 3 ul ilave edin ve 5 saniye için vorteks ile karıştırılır. Tüpün altındaki sıvıyı toplamak için 30 saniye boyunca santrifüjleyin.
- Sıvıyı çıkarmak için en yüksek hızda 30 saniye ~ için önceden ıslatılmış filtre santrifüj.
- Yukarı ve aşağı yavaşça, lizat karışımına girdap ya da pipet% 100 etanol (bu durumda 129 ul) 1.25 hacimleri ekleyin. ** Bu yöntem, büyük ve küçük RNA türleri hem de kurtaracaktır.
- 1 dk filtreye RNA bağlamak için 10.000 xg'de önceden ıslatılmış mikro filtre üzerine numuneyi ve santrifüj yükleyin. Daha sonra yıkama solüsyonu 1, R ", 180 ul mikro filtre yıkama21; 1 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj.
Not: Tüm santrifüj bu nokta 13.000 xg veya maksimum hızda yapılmalıdır seçin. - Kit protokol tarafından yönlendirildiği gibi yıkayın sırasıyla "Yıkama çözümlerinin 2 ve 3" 180 ul ile iki kez filtre. Santrifüj bakiye akışkan maddeyi ortadan kaldırmak ve kurutun 30 sn için, daha sonra akış atmak ve 1 dakika boyunca filtreyi dönerler.
- Yeni bir koleksiyon tüpüne filtreyi aktarın.
- (Takım ile birlikte verilme), -95 ° C'ye kadar sıcak Elüsyon çözeltisi.
- Filtrenin merkezine önceden ısıtılmış yıkama çözeltisi 10 ul uygulayın, kapağını takın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca muhafaza edin. Daha sonra RNA elüte etmek için 1 dk için santrifüj ve ~ RNA 20 ul elde etmek için bu adımı bir kez tekrarlayın.
- 37 ° C'de 15 dakika boyunca DNaz I tedavi gerçekleştirin.
- 260 nm'de absorbans ile spektrofotometre ile RNA ölçmek. 260 nm ve 280 nm dalga boylarında optik yoğunluk oranı saflığını değerlendirmek için kullanılırRNA 15 (Tablo 1).
6. Gen İfadesi Analizi
Not: (mRNA ve lncRNAs gibi) uzun bir RNA türünün gen ekspresyonunu Aşama 6.1 ve kısa RNA türünün (mikroRNA gibi) gösterilir aşama 6.2'de gösterilmiştir. Farklı kitleri RT-qPCR için kullanılabilir ve gerekli RNA miktarı (10 ng kadar az) kiti göre değişir. RNA sekans analizi, 6.3 tarif edilmektedir.
- Arka uyarlamak (RT) 5 RT ana karışımı ul (RT tampon maddesi, dNTP'ler, rastgele primerler, RT enziminin, RNaz inhibitörü) ile 20 ng 5 ul / RNA örnek ul karışım cDNA'ya RNA'nın. 37 ° C'de, sonra 120 dakika 25 ° C'de 25 dakika boyunca reaksiyon inkübe ve 85 ° C 'de 5 dak.
- RNaz içermeyen su ile RT reaksiyonu 1:10 seyreltin ve ilgi genleri için primer ya da primer / prob setleri ile 10 ul qPCR reaksiyon başına 2.5 ul kullanın.
Not: kısmen bozulmuş RNA analizini kolaylaştırmak için bu fo primerler kullanılması tavsiye edilirr kısa amplikonlar (az 100 bp) 16. (Tablo 2B)- MicroRNA ifade analizi için RT usta karışımı 5 ul 2-10 ng 5 ul / RNA örnek ul karıştırılarak RT reaksiyonu çalıştırın.
Not: her biri ticari olarak temin edilebilen PCR bazlı mikroRNA algılama teknolojisi, özel ve özel bir RT primerleri kullanılmasını gerektirir.
- MicroRNA ifade analizi için RT usta karışımı 5 ul 2-10 ng 5 ul / RNA örnek ul karıştırılarak RT reaksiyonu çalıştırın.
- Alternatif olarak veya RT-PCR ilave olarak, RNA farklı türler ölçmek için yeni nesil dizilimi (RNA seq veya küçük RNA seq) kullanın. Genellikle, bu prosedür (Tablo 3) RNA 500 ng kullanımı ve üretimi ve tespit aracı ile gösterildiği gibi yöntemi gerçekleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir önceki çalışmada aynı hastadan 4 dondurulmuş ve FFPE prostat dokularından mRNA ve microRNA RT-qPCR ifade profilleme karşılaştırmak epitel ve stromal doku toplamak için LCM kullanımını gösterdi. LCM RNA büyük miktarda nesil sekans analizi için toplanacak olan, özellikle de zaman alıcıdır. Bu nedenle, çalışma alanı tutmak için çok önemlidir ve araçları ücretsiz RNaz. (Bir sonraki paragrafta daha ayrıntılı olarak ele) toplandı RNA kaliteli ve hücre-özgüllük kontrolleri incelemek için tavsiye edilir. Şekil 1 önceki ve lazer yakalama huylu epitelyum sonra bir mikroskop altında PEN-frame sürgü üzerinde bir lekeli prostat kesiti göstermektedir .
Örnek toplanır ve RNA dikkatli bir şekilde ekstrakte edilir sonra, Tablo 1 'de gösterildiği gibi, RNA kalitesini ve miktarını değerlendirmek için önemlidir. Düşük 260/280 nm oranlarını gözlemlemek için nadir değildir. RNA olacak Yoğunlaştırıcı260/280 nm oranlarını geliştirmek, ancak aynı zamanda, küçük RNA türünün kaybına neden olabilir. Kalite kontrol ek olarak, dokunun (- Cı Şekil 1B) lazer ele alan özgüllüğünün doğrulanması için hücre tipine özgü kontrol incelemek için çok önemlidir. Örneğin, Şekil 1 B 'de AMACR geninin ifadesi normal epitel doku ile karşılaştırıldığında prostat kanseri epitel doku teyit etmek için ölçülmüştür ,. Şekil 1c'de NKX3.1 ekspresyonu LCM-toplanan numune içinde stroma olmadığını göstermektedir. Örnekteki RNA kalitesini de bilinmektedir, kaliteli RNA RNA compareed edilebilir. RNA ekstre edildi, uzun ve küçük RNA (Tablo 2) kalitesini teyit kültürlenmiş birincil epitel hücrelerinden toplanan olarak LCM-collected- dokusundan izole RNA'lar için RT-qPCR Ct değerleri, aynı aralığındadır. Son olarak, Tablo 3 bu RNA nesil RNA sequenci için yeterli kalitede olduğunu gösterirng.
Şekil 1: lazer yakalama mikro diseksiyon ile insan prostat benign epitel, prostat kanseri epitel ve stroma toplanması öncesinde ve iyi huylu epitel LCM-toplandıktan sonra toluidin mavisi ile boyandı (A) prostat biyopsisi.. (B - C) 45 hastadan LCM tarafından toplanan dokular hücresel kimlik 7 uygun gen işaretleri ifade. (B) AMACR prostat kanseri bir göstergesi olan ve kanser dokularında sadece tespit edilebilir. (C) NKX3.1 epitel bir göstergesi olan ve stromal dokularda tespit değildir. Bu rakam Giangreco ve diğ., 2015 JSBMB 7 modifiye edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: LCM-Toplanan prostat dokusundan RNA kalitesi ve miktarı.
Tablo 2: RT-qPCR LCM toplanan Prostat huylu epitelden.
Tablo 3: LCM-Toplanan prostat dokusundan RNAseq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İnsan örneklerden gen ekspresyonu kalitesi veya uygun bir doku miktarı için değil, aynı zamanda, belirli bir doku numunesinde mevcut olan çeşitli histolojik kişiler için değil, sadece zor olabilir. Bu iyi huylu dokular büyük ölçüde stromal doku ve kanser alanlardır stroma yoksun olduğu prostat özellikle zordur. LCM, iki farklı hücre tipleri (Şekil 1A) daha doğru bir imza prostat stroma ve epitel RNA fiziksel olarak ayrılmasını kolaylaştırır. Macrodissection veya bütün doku işleme kıyasla, LCM huylu dokularda hücre bölmelerini ayırmak, ancak önemli ölçüde daha pahalı ve emek yoğundur olabilir.
Herhangi bir tekniği mümkün tuzaklar vardır. Örneğin, RNA kalitesi ilk numune alımı sırasında ya da LCM ve çıkarma işlemi sırasında kısmen bozulmuş olabilir. İlk durumda, gen ifadesi farklı kısa AMPL ölçüm elde edilebilirqPCR simgeler. İkinci durumda, tüm araç ve malzemenin vicdanlı RNaz ücretsiz tedavi RNA bozulmasını yanı sıra doku kesitlerinin dikkatli taşıma ve işleme önlemek için alınmalıdır. Ayrıca, en az 90 dakika bir slayttan harcanan zaman sınırlayıcı toplama işlemi sırasında RNA kalitesini korur. LCM tekniğinin en büyük sınırlama, bir LCM enstrüman erişim ve LCM yapmak için gerekli emektir.
Lazer yakalama mikrodiseksiyon mikroskoplar çeşitli türleri vardır. Bu protokol daha sonra aşağıda koleksiyonu kapağa düşer alanları sınırlayan için lazer kullanan bir LCM kullanımını tarif eder. LCM Bu tür toplamak için ayrı ayrı çok-hücreli alanlar içeren, prostat dokusu içinde epitel ve stroma ayrılması için idealdir, ama LCM bu tip dokudan izole tek tek tek hücreler için uygun değildir. Örneğin, bu protokol, yerleşik makrofajlar toplamak için kullanılmamalıdırs, nöroendokrin hücre ya da genellikle tek bir hücre olarak mevcut olan, İnfiltrasyon yapan lenfositler,. Bu hücre tiplerinin izolasyonu kolaylaştıran bir zara kapak üzerine doku tek hücreler "ateş" bir lazer kullanan diğer LCM alet ve yöntem mevcuttur.
Kapsamlı kalite kontrol ve RNA karakterizasyonu göz ardı edilemez. 260 nm'de abzorbans, RT-qPCR çalışmalar (Tablo 1) için RNA miktarını belirlemek için uygundur, fakat RNA-sequencing daha doğru bir boya dayalı bir yöntem için RNA miktarını belirler. RT-qPCR analizinde diğer önemli konu artık DNA kontaminasyonu potansiyel önyargı kaçınmaktır. Bu intron kapsayan primerler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Orada kahya gen ekspresyonu, yüksek hasta heterojenlik nedenle, birden çok kahya genlerinin kullanımı, aynı zamanda ileri sürülmektedir ve tipik olarak üç 4,7-9 beş kullanımı (Şekil 1B - C ve Tablo 2).
4 azaltılması RNA göreceli olarak küçük bir miktar gerektirir. Yeni nesil dizileme RNA hem kısa hem de uzun RNA türlerinin ifadesini ölçmek için etkili bir tekniktir. Yeni nesil dizileme ayrıca yeni RNA türlerinin 13 keşif verir. Neyse ki, yeni nesil dizileme maliyet azalmaktadır.
Özetle, bu protokol, dondurulmuş prostat dokusu epitel ya da stromal hücrelerin homojen popülasyonları RNA izolasyonu sağlar. RNA selim ve hastalıklı prostat doğru hücre tipine spesifik gen ifadesi için bir araç sağlamak için çok sayıda alt-analiz teknikleri kullanılabilir. Bu tip veriler bilgi An katkıdaRNA ifade hastalığı patoloji nasıl farklı d anlayışı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrane 4.0 mm slides | Leica | 11600289 | |
| Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
| Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
| Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
| 0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
| Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
References
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
- McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
- Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
- Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
- Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
- Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
- Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
- Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95 (2010).
- Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165 (2010).
- Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
- Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
- Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
- Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
- Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246 (2014).
