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Chemistry

तेल emulsions में पानी: जल विरोधी पिगमेंट के साथ पानी में घुलनशील क्लोरोफिल बाध्यकारी प्रोटीन के संयोजन के लिए एक नई प्रणाली

Published: March 21, 2016 doi: 10.3791/53410
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science, 2Migal-Galilee Research Institute

Summary

यह पांडुलिपि हाइड्रोफोबिक पिगमेंट है कि पानी में तेल emulsions पर आधारित है के साथ पानी में घुलनशील प्रोटीन के संयोजन के लिए एक सरल और उच्च throughput विधि का वर्णन है। हम पुनः संयोजक पानी में घुलनशील-क्लोरोफिल के चार वेरिएंट बाध्यकारी प्रोटीन (WSCPs) की ब्रेसिका पौधों ई में व्यक्त के साथ देशी Chlorophylls की विधानसभा में विधि के प्रभाव को प्रदर्शित कोलाई।

Abstract

Chlorophylls (Chls) और bacteriochlorophylls (BChls) प्राथमिक सहकारकों कि संश्लेषक प्रकाश कटाई और इलेक्ट्रॉन परिवहन के लिए बाहर ले रहे हैं। उनकी कार्यक्षमता गंभीर रूप से बड़े और विस्तृत multisubunit transmembrane प्रोटीन परिसरों के भीतर अपने विशिष्ट संगठन पर निर्भर करता है। आदेश आणविक स्तर कैसे इन परिसरों सौर ऊर्जा रूपांतरण की सुविधा में समझने के लिए, इसे समझने के लिए प्रोटीन-वर्णक, और वर्णक वर्णक बातचीत, और उत्साहित गतिशीलता पर उनके प्रभाव के लिए आवश्यक है। इस तरह समझ पाने का एक तरीका यह निर्माण और सरल पानी में घुलनशील पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ Chls के परिसरों का अध्ययन कर रहा है। हालांकि, पानी में घुलनशील प्रोटीन में lipophilic Chls और BChls को शामिल मुश्किल है। इसके अलावा, वहाँ कोई सामान्य विधि है, जो हाइड्रोफोबिक पिगमेंट के साथ पानी में घुलनशील प्रोटीन की विधानसभा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम एक सरल और उच्च throughput पानी में तेल emulsions पर आधारित प्रणाली है, जो गधा सक्षम बनाता का प्रदर्शनहाइड्रोफोबिक Chls के साथ पानी में घुलनशील प्रोटीन की विधानसभा। नई विधि Chl एक साथ पानी में घुलनशील क्लोरोफिल Brassicaceae पौधों (WSCP) के बंधन प्रोटीन की पुनः संयोजक संस्करणों कोडांतरण द्वारा मान्य किया गया था। हम Chl के सफल विधानसभा ई व्यक्त WSCP की एक का उपयोग कर कच्चे lysates का प्रदर्शन कोलाई सेल, जो Chl प्रोटीन बातचीत और विधानसभा प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए उपन्यास पानी में घुलनशील Chl बाध्यकारी प्रोटीन के लिए एक आनुवंशिक स्क्रीन प्रणाली के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और।

Introduction

ऐसे chlorophylls (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) और carotenoids के रूप में हाइड्रोफोबिक पिगमेंट संश्लेषक प्रतिक्रिया केन्द्रों और प्रकाश कटाई प्रोटीन है कि इलेक्ट्रॉन परिवहन, ऊर्जा और प्रकाश को पकड़ने और हस्तांतरण बाहर ले जाने में प्राथमिक सहकारकों हैं। प्रतिक्रिया केन्द्रों और Chl बाध्यकारी प्रकाश कटाई परिसरों का सबसे transmembrane प्रोटीन होते हैं। गैर oxygenic संश्लेषक हरे-सल्फर जीवाणु 1,2 के Fenna-मैथ्यू ओल्सन (FMO) प्रोटीन, और dinoflagellates 3 ​​की peridinin-Chl प्रोटीन (पीसीपी) पानी में घुलनशील प्रकाश कटाई प्रोटीन की असाधारण उदाहरण हैं। पानी में घुलनशील क्लोरोफिल बाध्यकारी प्रोटीन (WSCPs) Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae की और Amaranthaceae पौधों 4, 5 एक और अनूठा उदाहरण हैं, फिर भी FMO और पीसीपी के विपरीत, ये न तो प्रकाश कटाई में है और न ही प्राथमिक संश्लेषक प्रतिक्रिया में से किसी में शामिल कर रहे हैं और उनके सटीक बनावटsiological कार्यों अभी तक स्पष्ट नहीं 5-8 कर रहे हैं। उनकी उच्च Chl-बंधन आत्मीयता Chls के क्षणिक वाहक और Chl डेरिवेटिव 9,10 के रूप में एक सुझाव समारोह के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। वैकल्पिक रूप से, यह धारणा थी WSCP क्षतिग्रस्त कोशिकाओं में Chls सफाई में एक भूमिका निभाता है और Chl प्रेरित photooxidative नुकसान 7,11-13 खिलाफ की रक्षा करता है। अभी हाल ही में यह सुझाव एक protease अवरोध के रूप में उस WSCP कार्यों और शाकाहारी प्रतिरोध के दौरान एक भूमिका निभाता है के रूप में अच्छी तरह से फूल विकास 14 के दौरान कोशिका मृत्यु को नियंत्रित करता था। WSCPs उनकी photophysical गुणों के अनुसार दो मुख्य वर्गों में बांटा जाता है। प्रथम वर्ग (कक्षा मैं, उदाहरण के लिए। बथुआ से) रोशनी पर photoconversion गुजरना सकता है। कक्षा ब्रेसिका पौधों, कि photoconversion 5,10 से गुजरना नहीं है से द्वितीय WSCPs, आगे वर्ग IIa में (उप-विभाजित किया जाता है (उदाहरण के लिए।, ब्रेसिका गोभी, Raphanus सैटाईवस से) और IIb जैसे।, Lepidium virginicum से Lepidium virginicum से वर्ग IIb WSCP की संरचना 2.0 एक संकल्प 8 पर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा हल किया गया था। यह एक सममित homotetramer जिसमें प्रोटीन एक हाइड्रोफोबिक कोर के रूप में पता चलता है। प्रत्येक सबयूनिट बांधता एक भी Chl जो core.This साधारण सभी Chl व्यवस्था बाध्यकारी और Chl प्रोटीन परिसरों की विधानसभा के अध्ययन के लिए WSCPs बनाता है एक संभावित रूप से उपयोगी मॉडल प्रणाली के भीतर चार पैक निकट Chls की एक तंग व्यवस्था में यह परिणाम है, और पड़ोसी Chls का प्रभाव और व्यक्तिगत Chls के वर्णक्रम और इलेक्ट्रॉनिक गुणों पर प्रोटीन वातावरण। इसके अलावा, यह कृत्रिम Chl बाध्यकारी प्रोटीन है कि कृत्रिम संश्लेषक उपकरणों में प्रकाश कटाई मॉड्यूल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के निर्माण के लिए टेम्पलेट्स प्रदान कर सकता है।

क्योंकि परिसरों पौधों से शुद्ध हमेशा Chl एक के विभिन्न संयोजनों के साथ tetramers की एक विषम मिश्रण होते हैं मूल निवासी WSCPs के कठोर पढ़ाई के संभव नहीं हैंऔर Chl ख 9। इस प्रकार, इन विट्रो में Chls साथ recombinantly व्यक्त WSCPs संयोजन के लिए एक विधि के लिए आवश्यक है। इस Chls की नगण्य पानी घुलनशीलता जो यह बस जलीय समाधान में पिगमेंट के साथ पानी में घुलनशील apoproteins मिश्रण से इन विट्रो में जटिल इकट्ठा करने के लिए असंभव बना देता है द्वारा thylakoid झिल्ली के साथ apoproteins 15 प्रदर्शन किया गया मिश्रण से चुनौती दी है। इन विट्रो विधानसभा, लेकिन इस विधि thylakoids में देशी Chls वर्तमान तक सीमित है। श्मिट एट अल। recombinantly ई में एक हिस्टडीन टैग प्रोटीन व्यक्त करने से फूलगोभी (CaWSCP) से WSCP के साथ कई Chl और BChl डेरिवेटिव कोडांतरण पर रिपोर्ट कोलाई एक नी आत्मीयता स्तंभ पर यह immobilizing और डिटर्जेंट 11 में solubilized Chl डेरिवेटिव शुरू। सफलतापूर्वक ए से पुनः संयोजक WSCPs के पुनर्गठन थालिअना 6, और ब्रसेल्स स्प्राउट्स (BoWSCP), जापानी जंगली मूली (RshWSCP) एकडी वर्जीनिया pepperweed (LvWSCP) एक समान विधि द्वारा भी सूचित किया गया।

यहाँ, हम एक उपन्यास, WSCP साथ Chls कि टैगिंग की आवश्यकता नहीं है कोडांतरण या प्रोटीन immobilizing के लिए सामान्य, सरल तरीका मौजूद है। यह खनिज तेल में पानी में घुलनशील apoproteins के अपने जलीय समाधान से इमल्शन की तैयारी पर निर्भर करता है। प्रोटीन की मात्रा इस प्रकार अनुपात 16 के लिए पानी में तेल (डब्ल्यू / ओ) बहुत उच्च सतह के साथ microdroplets में समझाया जाता है। हाइड्रोफोबिक सहकारकों फिर तेल में भंग कर रहे हैं और आसानी से तेल चरण से बूंदों में पेश कर रहे हैं। हम WSCP apoproteins के कई वेरिएंट recombinantly ई में व्यक्त की संयोजन के लिए विधि का उपयोग पर रिपोर्ट Chl एक साथ कोलाई। हम WSCP-overexpressing जीवाणु जो उपन्यास Chl बंधनकारी प्रोटीन के विकास के लिए एक स्क्रीनिंग प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के कच्चे lysate से विधानसभा प्रदर्शित करता है।

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Protocol

1. Chl एक स्टॉक समाधान तैयारी

  1. महत्वपूर्ण कदम: क्लोरोफिल की तैयारी के लिए सभी कदम एक रासायनिक हुड में, हरे रंग का प्रकाश (520 एनएम) या अंधेरे में आदेश के तहत photodamage कम करने के लिए प्रदर्शन करना। हमेशा भंडारण के लिए पिगमेंट ठंड से पहले नाइट्रोजन या आर्गन जोड़ें। सुनिश्चित करें कि सभी सॉल्वैंट्स विश्लेषणात्मक ग्रेड रहे हैं।
  2. Lyophilized spirulina platensis कोशिकाओं या thylakoid झिल्ली में केवल Chl एक अन्य युक्त साइनोबैक्टीरीयम कोशिकाओं के बारे में 5 मिलीग्राम वजन और एक मोर्टार और मूसल का उपयोग कर इसे कुचलने।
  3. एक गिलास स्तंभ पर कुचल कोशिकाओं लोड और carotenoids हटाने के लिए आदेश में के बारे में 50-100 मिलीग्राम 100% एसीटोन के साथ धो लो। eluted नारंगी / हरी अंश त्यागें।
    नोट: जब तक हरी अंश elute करने के लिए शुरू होता है नारंगी अंश एसीटोन के 100 मिलीलीटर के साथ eluted नहीं है, तो एसीटोन के साथ कोशिकाओं को धोने के लिए जारी।
  4. 100% मेथनॉल के साथ एक्सचेंज एसीटोन और हरे रंग के अंश Chl एक युक्त इकट्ठा। eluted Fract की मात्राआयन 50-100 मिलीग्राम के बीच भिन्न हो सकते हैं। शुरुआत में, eluted अंश एक गहरे हरे रंग है, जो क्षालन के अंत में हरे रंग पीला में बदलता है। eluted अंश का रंग हरे रंग पीला में बदल जाता है जब क्षालन बंद करो।
  5. एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर जब तक निकालने के लिए पूरी तरह से सूखा है मेथनॉल लुप्त हो जाना। समाधान के लिए गर्मी लागू नहीं है; यह सुनिश्चित करें कि बाष्पीकरण के पानी से स्नान तापमान 30 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं है।
    नोट: वाष्पीकरण के समय मेथनॉल अंश की मात्रा सुखाया जा रहा है पर निर्भर करता है और 10-60 मिनट के बीच भिन्न हो सकते हैं। यह पूरी तरह से निकालने सुखाने के लिए महत्वपूर्ण है।
  6. Diethyl ईथर (5-10 के बारे में एमएल) की एक छोटी मात्रा में सूखे निकालने से पिगमेंट भंग, और रूई के माध्यम से फिल्टर। सुनिश्चित करें कि पिगमेंट पूरी तरह से छानने से पहले आकाश में भंग कर रहे हैं।
  7. Diethyl ईथर लुप्त हो जाना जब तक पूरी तरह से सूखे पिगमेंट (10-30 मिनट) कर रहे हैं।
    नोट: शुष्क पिगमेंट के साथ पर्ज किया जा सकता है और कम से नाइट्रोजन या आर्गन के तहत रखा -20 डिग्री सेल्सियस, आगे की प्रक्रिया जब तक अंधेरे में।
  8. छोटी से छोटी मात्रा 100% मेथनॉल (लगभग 1 एमएल) के संभावित में सूखे पिगमेंट भंग भले ही सब कुछ नहीं है पूरी तरह से निलंबित कर दिया है। समाधान के लिए एसीटोन के 4 मिलीलीटर जोड़ें, और व्यवस्था पूरी तरह से पिगमेंट भंग करने के लिए धीरे गिलास झटका।
  9. एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, पर DEAE के एक स्तंभ 100% एसीटोन में equilibrated sepharose धीरे नमूना लोड।
  10. Elute carotenoids (एक नारंगी-पीले रंग के बैंड) 100% एसीटोन के साथ। 1 वी / वी एसीटोन / मेथनॉल मिश्रण: फिर, 3 के साथ Chl एक (हरा बैंड) elute।
    नोट: एसीटोन और एसीटोन / मेथनॉल मिश्रण की मात्रा DEAE की मात्रा स्तंभ पर लोड sepharose करने के लिए लगभग बराबर है।
  11. Eluent 17 के रूप में 2 क्लोराइड / एन-हेक्सेन / isopropanol / मेथनॉल (वी / वी) मिश्रण: 25: 5 Chl एक 68 का उपयोग कर पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा एक पवित्रता की जाँच करें।
  12. एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर विलायक लुप्त हो जाना जब तक Chl एक पूरी तरह से सूखा है (1060 मिनट)।
    नोट: शुष्क Chl एक नाइट्रोजन या आर्गन साथ पर्ज जा सकता है और अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर आर्गन वातावरण के तहत संग्रहीत।
  13. 100% इथेनॉल के 2-4 मिलीलीटर में सूखे Chl एक फिर से भंग द्वारा Chl एक शेयर समाधान तैयार है।
    नोट: 663 एनएम पर Chl एक के विलुप्त होने के गुणांक 74400 सेमी -1 एम -1 (83.3 सेमी -1 (मिलीग्राम / एमएल) -1) इथेनॉल में है। एक ठेठ शेयर समाधान 25 मिमी (23 मिलीग्राम / एमएल) के एक एकाग्रता के लिए इसी 1,860 के एक आयुध डिपो होनी चाहिए। एक पायस Chl के 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त एक बनाम साथ एक मिश्रण में जैविक चरण के 5 मिलीलीटर, और जलीय चरण के परिणाम के 1 मिलीलीटर में WSCP के 1 मिलीग्राम से युक्त करने के लिए इस शेयर का 20 μl जोड़ना WSCP।

2. पायस की जैविक चरण तैयारी

नोट: पायस की जैविक चरण खनिज 4.5% से युक्त (v / v) स्पैन 80 तेल से बना है, और 0.4% (वी / वी) के बीच 80।

  1. टी के एक 50 मिलीलीटर ट्यूब 0.2 ग्राम वजन80 समझना, अवधि 80 वर्ष की 1.8 ग्राम, और खनिज तेल की 38 ग्राम। अच्छी तरह मिक्स सभी घटकों और बर्फ पर शांत हो जाओ।
    नोट: जैविक चरण एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है।

3. पायस के जलीय चरण तैयारी

नोट: पायस के जलीय चरण या तो शुद्ध WSCP, या WSCP overexpressing बैक्टीरिया के कच्चे तेल निकालने की रचना की जा सकती है।

  1. शुद्ध WSCP युक्त एक जलीय चरण की तैयारी।
    1. 0.3-0.6 के आयुध डिपो तक 37 डिग्री सेल्सियस पर लेग माध्यम का 1 एल में WSCP प्लाज्मिड 12 युक्त कोलाई बैक्टीरिया बढ़ने BL21।
    2. 1 मिमी IPTG जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित। प्रेरण के बाद 12-16 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया बढ़ने।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 5000 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट बैक्टीरिया।
    4. बर्फ पर बफर और sonicate बंधन में गोली (30 सेकंड, 15 सेकंड से दूर, पांच बार) भंग। गोली की 250 मिलीलीटर की centrifugation से प्राप्त करने के लिए बफर के 10 मिलीलीटर का प्रयोग करेंप्रोटीन overexpressing कोशिकाओं के साथ लेग माध्यम।
      नोट: शोधन विधि पर निर्भर करता है, बाध्यकारी बफर फॉस्फेट बफर, पीएच 7.2 या 50 मिमी Tris, पीएच 7.5, 500 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA 100 मिमी की रचना की जा सकती है।
    5. नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12,000 XG पर सेल lysate स्पिन।
    6. आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा WSCP शुद्ध। टैग WSCP के लिए जुड़े हुए पर निर्भर करता है, निर्माता निर्देशों का पालन प्रोटीन शुद्धि के लिए उचित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर पुनः संयोजक प्रोटीन शुद्ध।
    7. पायस तैयारी के लिए, 50 मिमी में शुद्ध WSCP फॉस्फेट बफर, पीएच 7.8 का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि अंतिम प्रोटीन पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल राशि बफर के 1 मिलीलीटर प्रति 0.5-1.0 मिलीग्राम है।
  2. WSCP साथ कच्चे तेल की बैक्टीरियल lysate युक्त एक जलीय चरण की तैयारी।
    1. आयुध डिपो 0.3-0.6 तक 37 डिग्री सेल्सियस पर लेग माध्यम के 250 मिलीलीटर में प्लाज्मिड व्यक्त WSCP युक्त कोलाई BL21 कोशिकाओं को विकसित।
    2. साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित1 मिमी IPTG और बैक्टीरिया रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ता है।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 5000 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट बैक्टीरियल कोशिकाओं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12,000 XG पर 1-2 50 मिलीलीटर मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर पीएच 7.8, sonicate (30 सेकंड, 15 सेकंड बंद, तीन बार) और सेंट्रीफ्यूज में गोली भंग।
    5. 50 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर पीएच 7.8 से 0.875 मिलीग्राम के साथ सतह पर तैरनेवाला की 0.125 मिलीग्राम के मिश्रण से पायस के जलीय चरण की तैयारी।

पायस में Chl एक साथ WSCP की 4. विधानसभा

  1. एक कांच की शीशी में तेल-surfactant मिश्रण के 5 मिलीलीटर स्थानांतरण और बर्फ पर इसे शांत। pipetting से पहले, सत्यापित करें कि सभी जैविक चरण के घटकों को अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं और वहाँ surfactants और खनिज तेल के बीच कोई चरण जुदाई है।
  2. जैविक चरण के 5 मिलीलीटर के लिए धारा 3 में के रूप में तैयार ठंडा जलीय चरण के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. बर्फ पर 9500 rpm पर 2 मिनट के लिए एक ऊतक homogenizer का उपयोग दोनों चरणों को मिला लें।
  4. महत्वपूर्ण कदम: पर इस स्तर से आदेश photodamage कम करने के लिए हरे रंग का प्रकाश (520 एनएम) के तहत सभी आगे कदम प्रदर्शन करते हैं। 25 मिमी Chl एक शेयर समाधान के 20 μl जोड़े पायस (खंड 1.13 देखें)। flicking और कांच की शीशी inverting द्वारा फैलाने। सुनिश्चित करें कि समान रूप से Chl पायस में वितरित किया जाता है सुनिश्चित करें।
  5. अंधेरे में बर्फ पर 1-2 घंटे के लिए पायस सेते हैं।
  6. आदेश में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब और अपकेंद्रित्र पायस हस्तांतरण जैविक चरण से पायस और अलग पानी की बूंदों को तोड़ने के लिए है।
    नोट: विधानसभा सफल होता है, कम जलीय चरण एक हरे रंग होना चाहिए।
  7. ऊपरी तेल चरण निपटाने और खनिज तेल के 1 मिलीलीटर जोड़ें। भंवर से या ट्यूब को अच्छी तरह से flipping द्वारा pelleted पायस के साथ अच्छी तरह मिक्स खनिज तेल। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर नमूना स्पिन। जलीय और खान को अलग करने के लिए एक स्पष्ट meniscus जब तक इस चरण को दोहराएँअल तेल चरणों, किसी भी मध्यवर्ती पायस के बिना प्राप्त की है।
  8. एक रासायनिक हुड में इस कदम को पूरा करें। बाद जलीय और खनिज तेल के चरण स्पष्ट रूप से अलग हो रहे हैं, खनिज तेल को हटाने और पानी संतृप्त Diethyl ईथर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। भंवर और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर नमूना नीचे स्पिन। इस कदम दो बार दोहराएँ।
  9. दूसरे centrifugation के बाद, Diethyl ईथर हटाने और ट्यूबों हुड में 5-20 मिनट के लिए खुला छोड़ दें।
  10. अंत में, एक desalting स्तंभ पर WSCP / Chl एक जटिल युक्त जलीय चरण लोड और बफर आगे के प्रयोगों के लिए उपयुक्त साथ elute।
    नोट: प्रोटीन पीएच (6.0-7.5) के एक विस्तृत रेंज में phosphate- और Tris बफ़र्स में स्थिर है। नमूना 4 डिग्री सेल्सियस से एक महीने के लिए प्रकाश से संरक्षित पर संग्रहित किया जा सकता है।

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Representative Results

संयोजक WSCP apoproteins प्रोटोकॉल पिछले अनुभाग में वर्णित के अनुसार डब्ल्यू / हे इमल्शन में Chl एक साथ इकट्ठे हुए थे। प्रोटोकॉल या तो शुद्ध WSCPs, या lysates कोलाई कोशिकाओं WSCP overexpressing (चित्रा 1) युक्त जलीय चरणों का उपयोग कर लागू किया गया था। प्रोटोकॉल सरल, तेज है और एक ऊतक homogenizer को छोड़कर किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है।

Absorbance और Chl की सीडी स्पेक्ट्रा चार पुनः संयोजक WSCP वेरिएंट, अर्थात् RshWSCP, CaWSCP, BoWSCP और LvWSCP की एक परिसरों चित्रा 2 में दिखाया जाता है ये संबंधित मूल निवासी परिसरों 10,18 की पहले से सूचना दी स्पेक्ट्रा के लिए बैंड आकार और स्थिति में समान हैं, 19। ये परिणाम स्पष्ट रूप से पता चलता है कि WSCP / Chl डब्ल्यू / हे पायस प्रणाली में पुनर्गठन परिसरों मूल निवासी परिसरों जैसा दिखता है।

कोलाई कोशिकाओं WSCPs व्यक्त करने का कच्चे lysates पायस के जलीय चरण के रूप में इस्तेमाल किया गया। बैक्टीरिया है कि WSCPs व्यक्त नहीं किया की lysates नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। Chl एक साथ WSCP के सकारात्मक विधानसभा आसानी से जलीय चरण के हरे रंग से मनाया जाता है, लेकिन केवल WSCP की lysates कोशिकाओं को व्यक्त (चित्रा 3) में। इन lysates युक्त बूंदों अलग Chl confocal खुर्दबीन छवियों में एक प्रतिदीप्ति की सुविधा है। इसका मतलब है कि WSCP / Chl परिसरों के सफल विधानसभा पानी की बूंदों, जो डब्ल्यू / हे पायस आधारित स्क्रीनिंग सिस्टम के लिए आधार हो सकता है में सीधे पता लगाया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: विधानसभा डब्ल्यू / हे emulsions में Chls साथ WSCP (ए। कोलाई सेल lysates WSCP व्यक्त होता है के साथ मिश्रित है। जब पायस तैयार है, Chls पायस करने के लिए जोड़ रहे हैं। पुनर्गठन के बाद, पानी की बूंदों centrifugation द्वारा जैविक चरण से अलग हो रहे हैं। (बी) डब्ल्यू / हे पायस प्रणाली Chls साथ WSCPs के सकारात्मक पुनर्गठन के लिए तेजी से और उच्च throughput प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। WSCP / Chl परिसर के प्रतिदीप्ति सीधे एक confocal खुर्दबीन से पानी microdroplets से पता लगाया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: absorbance और WSCP / Chl की सीडी स्पेक्ट्रा एक परिसर में चार की Apoproteins।WSCP वेरिएंट Chl एक के 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त के साथ पुनर्गठन किया गया। Absorbance के स्पेक्ट्रा (क) सामान्यीकृत LvWSCP (लाल) के लिए BoWSCP (काला), CaWSCP (हरा), और RshWSCP (नीला) और 663nm के लिए 673nm पर 1 के लिए गए थे। एक ही सामान्य बनाने कारकों सीडी (ख) के लिए लागू किया गया था। 16 से अनुमति के साथ Reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और WSCP / Chl जटिल विधानसभा के दृश्य स्क्रीनिंग (ए) ई के एसडीएस पृष्ठ। पहले और डब्ल्यू / हे इमल्शन में Chl एक साथ पुनर्गठन के बाद कोलाई BL21 सेल lysates। लेन 1: WSCP प्लाज्मिड बिना BL21 कोशिकाओं, 2 लेन: WSCP पीएलए के साथ BL21 कोशिकाओंIPTG से प्रेरण बिना स्मिड, 3 लेन: WSCP प्लाज्मिड IPTG साथ प्रेरित साथ BL21 कोशिकाओं। लेन 4, 5 और 6 गलियों 1, 2 और 3 के रूप में एक ही नमूने हैं, क्रमशः, लेकिन पायस के जैविक चरण से पानी चरण की जुदाई के बाद। प्रत्येक नमूने की छोटे aliquots एक एसडीएस प्रोटीन जेल पर चलाए जा रहे थे। लेन एम: प्रोटीन आकार मार्कर। नमूने के पहले और चरण जुदाई के बाद के चित्र प्रत्येक लेन के शीर्ष पर दिखाए जाते हैं। (बी) के तेल चरण में Chl एक साथ तैयार डब्ल्यू / हे बूंदों के confocal खुर्दबीन छवियों। बाईं छवि पर बूंदों किसी भी प्रोटीन शामिल नहीं किया था सही छवि पर उन जबकि WSCP प्रोटीन होता है। प्रतिदीप्ति 682 एनएम पर नजर रखी थी। 16 से अनुमति के साथ Reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमारा लक्ष्य हाइड्रोफोबिक पिगमेंट के साथ पानी में घुलनशील क्लोरोफिल बाध्यकारी प्रोटीन की विधानसभा के लिए एक नया सामान्य प्रणाली विकसित करने के लिए किया गया था। यहाँ यह दिखाया गया है कि नए पुनर्गठन डब्ल्यू / हे पायस पर आधारित प्रणाली एक सामान्य दृष्टिकोण ब्रसेल्स स्प्राउट्स, फूलगोभी, जापानी सहिजन और वर्जीनिया pepperweed recombinantly ई में व्यक्त से WSCP apoproteins की विधानसभा के लिए काम करने के लिए साबित हो रहा है कोलाई। यहाँ के परिणाम Chl एक के 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त के साथ WSCP के 1 मिलीग्राम के पुनर्गठन से प्रस्तुत कर रहे हैं। हालांकि यह भी reconstitutions और विभिन्न Chl / प्रोटीन दाढ़ अनुपात के लिए WSCP की कम सांद्रता का उपयोग करना संभव है। प्रोटीन की न्यूनतम राशि है, जो हम डब्ल्यू / हे इमल्शन में इकट्ठा करने में सक्षम थे 100 माइक्रोग्राम था, जबकि प्रोटीन के अनुपात में वर्णक से 5 भिन्न हो सकता है: 1 और 20 अप करने के लिए: 1। इसके अलावा, जलीय चरण की मात्रा 50 μl करने के लिए नीचे उतारा जा सकता है। इस काम में Chl एक साथ WSCP की विधानसभा में प्रस्तुत किया है। फिर भी, यह भी संभव है इकट्ठा करने के लिएअन्य हाइड्रोफोबिक Chls, BChls और उनके डेरिवेटिव के साथ WSCP। वर्तमान में, हम इस तरह के FMO और पीसीपी के रूप में अन्य पानी में घुलनशील वर्णक बाध्यकारी प्रोटीन के साथ हमारे सिस्टम का परीक्षण कर रहे हैं।

हालांकि, हमारे विधि तेज और सरल है कि वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है, जो Chl साथ डब्ल्यू / हे तैयारी और WSCP के पुनर्गठन के दौरान विचार करने की आवश्यकता हैं। कांच की शीशियों, जो पायस तैयारी के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, स्वच्छ और डिटर्जेंट से मुक्त होने की जरूरत है। शीशियों में डिटर्जेंट की भी थोड़ी निशान पायस तैयारी प्रभावित करते हैं और पायस के कम गुणवत्ता का परिणाम देगा। इसके अलावा, शीशियों पूरी तरह से सूखा होना चाहिए। अन्य महत्वपूर्ण कदम है, जो पुनर्गठन दक्षता प्रभावित हो सकता है, अच्छी तरह से पायस के जैविक चरण में Chl का फैलाव है। इसलिए, यह पूरी तरह से पायस के 5 मिलीलीटर में Chl की एक छोटी मात्रा मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी नीचे पायस तोड़ने के लिए और पूरी तरह से पानी के चरण से खनिज तेल निकालने के लिए आवश्यक के रूप में कई चरणों करने के लिए महत्वपूर्ण है। पानी पीएच में खनिज तेल के किसी भी अंशएएसई आगे के प्रयोगों को प्रभावित कर सकता है।

डब्ल्यू / हे पायस विधि श्मिट एट अल। 11 द्वारा स्थापित किया गया है, जो आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी स्तंभ पर उनकी टैग WSCP immobilizing और Chls साथ incubating पर आधारित था के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। हालांकि, के श्मिट एट अल। विधि, विभिन्न WSCPs के लिए काम करने के लिए साबित कर दिया है, यह उनकी टैग प्रोटीन की आवश्यकता है और टैग के histidines को बंधाव द्वारा Chls की गैर विशिष्ट बंधन में हो सकता है। इसके अलावा, एक ठोस सतह पर प्रोटीन immobilizing प्रोटीन संरचना को प्रभावित कर सकते हैं, इस प्रकार पिगमेंट के साथ विधानसभा की प्रक्रिया को प्रभावित। इसके अलावा, Chl है, जो इस व्यवस्था में WSCPs की विधानसभा के लिए इस्तेमाल किया गया था या तो डिटर्जेंट या 40% मेथनॉल 11,12 युक्त बफर में भंग कर दिया गया था। ऐसे सॉल्वैंट्स वर्णक एकत्रीकरण और / या गैर विशिष्ट Chl WSCP के लिए बाध्य हो सकती है। हमारी नई पुनर्गठन डब्ल्यू / हे पायस पर आधारित प्रणाली ठोस समर्थन करने के लिए प्रोटीन immobilizing पर भरोसा नहीं करता। therefoफिर से, कोई शुद्धि WSCPs के लिए जुड़े हुए टैग की आवश्यकता है, और देशी अनुक्रम के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन इकट्ठा किया जा सकता है। डब्ल्यू / हे विधि का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ पिगमेंट एकत्रीकरण कि प्रभावित कर सकते पुनर्गठन दक्षता, oligomerization और वर्णक / प्रोटीन stoichiometry को कम करने में है। इसका कारण यह है हाइड्रोफोबिक पिगमेंट तेल चरण में भंग कर रहे हैं और डब्ल्यू / हे बूंदों में अपनी शुरुआत के बाद की मात्रा के अनुपात में उच्च सतह से सक्षम है। इसके अलावा, WSCP द्वारा Chls के unspecific बाध्यकारी उन्हें धोखा दिया है के बाद से हाइड्रोफोबिक पिगमेंट पायस के जैविक और जलीय चरणों के बीच फैलाना नहीं कर सकते। केवल पिगमेंट कि सक्रिय रूप से पुनर्गठन के दौरान WSCP द्वारा इकट्ठा कर रहे हैं पायस का पानी microdroplets में प्रवेश कर सकते हैं।

पृथक thylakoids 10 के साथ WSCP मिश्रण से पिगमेंट के साथ WSCP कोडांतरण की विधि डब्ल्यू / हे पायस यहाँ प्रस्तुत प्रणाली के समान है। यह डिटर्जेंट या सोल के लिए कार्बनिक सॉल्वैंट्स की आवश्यकता हैChls ubilizing, और न ही प्रोटीन टैगिंग। हालांकि, डब्ल्यू / हे विधि किसी भी पिगमेंट कि तेल चरण में घुलनशील है, जबकि पिछले विधि Chls कि natively thylakoid झिल्ली में मौजूद हैं तक सीमित है के साथ प्रयोग किया जा सकता है। इस प्रकार, शुद्ध Chl एक या Chl डी के साथ विधानसभा से क्योंकि इन जैसे। Synechocystis पीसीसी 6803 या Acaryochloris मरीना क्रमश cyanobacterial thylakoids से उपलब्ध हैं संभव है। हालांकि, यह Chl बी के साथ WSCP पुनर्गठित करने के बाद से इस वर्णक हमेशा thylakoids में Chl एक साथ है संभव नहीं है। इसके विपरीत, डब्ल्यू / हे पायस में WSCP विधानसभा किसी भी प्राकृतिक या कृत्रिम Chl, BChl या porphyrin डेरिवेटिव के साथ परीक्षण किया जा सकता है। यह संश्लेषक झिल्ली का उपयोग कर की आवश्यकता नहीं है और इस तरह यह इस तरह के रूप में अतिरिक्त phycobilisome-झिल्ली घटक है कि cyanobacterial झिल्ली से जुड़ी हो सकती है के हस्तक्षेप से मुक्त है। डब्ल्यू / हे विधि केवल तेल चरण एक में पिगमेंट की घुलनशीलता द्वारा सीमित हैएन डी इसलिए किसी भी प्राकृतिक या कृत्रिम Chl, BChl या porphyrin डेरिवेटिव के साथ WSCP विधानसभा के लिए उपयुक्त है।

सारांश में, हम यहाँ हाइड्रोफोबिक पिगमेंट के साथ पानी में घुलनशील प्रोटीन के संयोजन के लिए एक सामान्य विधि प्रस्तुत किया। के ब्रेसिका पौधों के रूप में स्पष्ट रूप से स्पेक्ट्रोस्कोपी और जैव रासायनिक परिणामों ने संकेत से अलग पुनः संयोजक WSCPs साथ Chl एक के सफल विधानसभा द्वारा प्रदर्शन किया गया इसका लाभ। इसके अलावा, हम कैसे डब्ल्यू / हे विधानसभा प्रोटोकॉल पुनः संयोजक WSCPs और कच्चे तेल Chl अर्क overexpressing कोलाई सेल lysates का उपयोग करके WSCP / Chl जटिल विधानसभा की तेजी से जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का प्रदर्शन किया। इस तरह हम लेने वाली प्रोटीन शुद्धि कदम और आदेश जैविक चरण से पानी की बूंदों को अलग करने के इमल्शन को तोड़ने की जरूरत भी सीधे पानी की बूंदों में विधानसभा visualizing के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने से बचा जा सकता है समय को छोड़ सकते हैं। नई विधि के सामान्य प्रयोज्यता यह एक उपयोग में आता हैडिजाइनिंग और उनके सरल बनाया कृत्रिम पानी में घुलनशील प्रोटीन analogues के निर्माण से transmembrane प्रोटीन सहायक कारक के परिसरों में सहायक कारक के बंधन और विधानसभा, और ऊर्जा और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण तंत्र के अध्ययन के लिए ful उपकरण।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

डी.एन. यूरोपीय संघ FP7 परियोजनाओं PEPDIODE (जीए 256,672) और REGPOT-2012-2013-1 (जीए 316,157), और एक निजी शोध अनुदान (सं 268/10) इसराइल विज्ञान फाउंडेशन से समर्थन मानता है। हम confocal माइक्रोस्कोपी छवियों को लेने के लिए प्रो Shmuel Rubinstein, स्कूल ऑफ इंजीनियरिंग एंड एप्लाइड साइंसेज, हार्वर्ड विश्वविद्यालय, कैंब्रिज एमए, संयुक्त राज्य अमरीका धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mineral oil Sigma M5904
Span80 Sigma 85548
Tween80 Sigma P8074
Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges Bio Rad 10011164 Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence.
His Trap HF column GE Healthcare Life Science 17-5248-02 Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag
DEAE Sepharose Fast Flow GE Healthcare Life Science 17-0709-01 Chromatography medium for chlorophyll purification

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References

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रसायन विज्ञान अंक 109 पानी में घुलनशील क्लोरोफिल बाध्यकारी प्रोटीन (WSCP) पानी में तेल पायस क्लोरोफिल वर्णक प्रोटीन विधानसभा यूवी दृश्य absorbance परिपत्र द्विवर्णता (सीडी)
तेल emulsions में पानी: जल विरोधी पिगमेंट के साथ पानी में घुलनशील क्लोरोफिल बाध्यकारी प्रोटीन के संयोजन के लिए एक नई प्रणाली
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Bednarczyk, D., Noy, D. Water in Oil … More

Bednarczyk, D., Noy, D. Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments. J. Vis. Exp. (109), e53410, doi:10.3791/53410 (2016).

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