Vatten i oljeemulsioner: Ett nytt system för montering Vattenlösliga klorofyllbindande proteiner med hydrofoba pigment
Summary
Detta manuskript beskriver en enkel och hög genomströmning metod för sammansättning av vattenlösliga proteiner med hydrofoba pigment som är baserade på vatten-i-olja-emulsioner. Vi demonstrera effektiviteten av förfarandet vid montering av nativa klorofyller med fyra varianter av rekombinant vattenlöslig-klorofyll bindande proteiner (WSCPs) av Brassica-växter som uttrycks i E. coli.
Abstract
Klorofyll (CHLS) och bakterioklorofyller (Bchl) är de främsta kofaktorer som utför foto ljus skörd och elektrontransport. Deras funktion beror kritiskt på deras specifika organisation inom stora och komplicerade multisubunit transproteinkomplex. För att förstå på molekylär nivå hur dessa komplex underlättar solenergi konvertering, är det viktigt att förstå protein pigment och pigmentpigment interaktioner och deras inverkan på glada dynamik. Ett sätt att få sådan förståelse är genom att konstruera och studera komplex av Chl med enkla vattenlösliga rekombinanta proteiner. Det är dock svårt att införliva lipofila Chl och Bchl till vattenlösliga proteiner. Dessutom finns det ingen allmän metod, som skulle kunna användas för montering av vattenlösliga proteiner med hydrofoba pigment. Här visar vi en enkel och hög kapacitet system baserat på vatten-i-olja-emulsioner, som gör det möjligt assmonterings av vattenlösliga proteiner med hydrofoba Chl. Den nya metoden har validerats av montering rekombinanta versioner av vattenlösliga klorofyll protein av Brassicaceae växter (WSCP) med Chl a. Vi visar den framgångsrika montering av Chl a med hjälp av råa lysat av WSCP uttrycker E. coli-cell, som kan användas för att utveckla ett genetiskt skärmsystem för nya vattenlösliga Chl-bindande proteiner, och för studier av Chl-proteininteraktioner och monteringsprocesser.
Introduction
Hydrofoba pigment såsom klorofyller (CHLS), bakterioklorofyller (Bchl) och karotenoider är de primära kofaktorer i fotoreaktionscentra och lätta skörd proteiner som utför elektrontransport och lätt fånga energi och överföring. Reaktionscentra och de flesta av CHL-bindande antennkomplexet är transmembranproteiner. Den Fenna-Matthews-Olson (FMO) protein av icke-syrehaltig foto grön svavelbakterier 1,2 och peridinin-Chl protein (PCP) av dinoflagellater 3 är exceptionella exempel på vattenlösliga ljus skörd proteiner. De vattenlösliga klorofyllbindande proteiner (WSCPs) av Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae och Amaranthaceae växter 4, 5 är ett annat unikt exempel, men i motsats till FMO och PCP, dessa är varken inblandade i ljuset avverkning eller i någon av de primära fotosyntetiska reaktions och deras exakta physiological funktioner är ännu oklart 5-8. Deras höga Chl-bindningsaffiniteten har lett till ett förslag funktion som övergående bärare av Chl och Chl-derivat 9,10. Alternativt framställdes det en hypotes att WSCP spelar en roll vid sophantering Chl i skadade celler och skyddar mot Chl-inducerad fotooxidativ skada 7,11-13. Mer nyligen, föreslogs det att WSCP fungerar som en proteashämmare och spelar en roll under herbivore beständighet samt reglerar celldöd under blomutveckling 14. WSCPs delas in i två huvudklasser beroende på deras fotofysikaliska egenskaper. Den första klassen (klass I, t ex. Från Chenopodium album) kan genomgå photoconversion vid belysning. Klass II WSCPs från Brassica växter, som inte genomgår photoconversion 5,10, ytterligare delas in i klass IIa (eg., Brassica oleracea, Raphanus sativus) och IIb (eg., Från virginiakrassing </em>). Strukturen för klass IIb WSCP från virginiakrassing löstes genom röntgenkristallografi vid 2,0 Å upplösning 8. Det avslöjar en symmetrisk homotetramer i vilken de proteinsubenheter bilda en hydrofob kärna. Varje underenhet binder en enda Chl, vilket resulterar i en tät anordning av fyra tätt packade Chl inom de core.This enkelt alla Chl arrangemang gör WSCPs ett potentiellt användbart modellsystem för att studera bindning och montering av Chl-proteinkomplex, och effekterna av angränsande Chl och proteinmiljöer på spektrala och elektroniska egenskaperna hos enskilda Chl. Dessutom kan det ge mallar för att konstruera konstgjorda Chl-bindande proteiner som kan användas för ljus skörd moduler i artificiella foto enheter.
Rigorösa studier av nativa WSCPs inte är genomförbara, eftersom komplexen renade från växter innehåller alltid en heterogen blandning av tetramerer med olika kombinationer av Chl aoch Chl B 9. Sålunda erfordras en metod för montering av rekombinant uttryckta WSCPs med Chl in vitro. Detta ifrågasätts av den försumbara vattenlöslighet Chl, vilket gör det omöjligt att montera komplexa in vitro genom att helt enkelt blanda vattenlösliga apoproteiner med pigment i vattenlösningar. In vitro montering genom att blanda apoproteiner med tylakoid membran 15 visades, men denna metod är begränsad till den nativa Chl närvarande i tylakoider. Schmidt et al. rapporterade om montering flera Chl och BChl-derivat med WSCP från blomkål (CaWSCP) genom rekombinant uttrycker en histidin-märkt protein i E. coli immobilisera den på en Ni-affinitetskolonn och införa Chl derivat löstes i tvättmedel 11. Framgångsrikt beredning av rekombinanta WSCPs från A. thaliana 6, och brysselkål (BoWSCP), japanska vild rädisa (RshWSCP) end Virginia pepperweed (LvWSCP) genom en liknande metod har också rapporterats.
Här presenterar vi en ny, generell, enkel metod för montering Chl med WSCP som inte kräver märkning eller immobilisering av proteiner. Det bygger på framställning av emulsioner från deras vattenlösningar av vattenlösliga apoproteiner i mineralolja. Proteinerna är således inkapslade i vatten-i-olja (W / O) mikrodroppar med mycket hög yta till volym 16. De hydrofoba kofaktorer upplöses sedan i oljan och kan lätt införas i de små dropparna från oljefasen. Vi rapporterar om hur du använder metoden för montering av flera varianter av WSCP apoproteiner rekombinant uttryckta i E. coli med Chl a. Vi visar aggregatet från rå lysat av WSCP-överuttryckande bakterier som kan användas som ett screeningssystem för att utveckla nya Chl-bindande proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vårt mål var att utveckla en ny generell ordning för montering av vattenlösliga klorofyllbindande proteiner med hydrofoba pigment. Här visas att den nya beredningen system baserat på W / O-emulsion är en allmän riktlinje visat sig fungera för montering av WSCP apoproteiner från brysselkål, blomkål, japansk pepparrot och Virginia pepperweed rekombinant uttryckta i E. coli. Här Resultaten presenteras från rekonstituering av 1 mg av WSCP med 10-faldigt molärt överskott av Chl a. Det är em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DN erkänner stöd från EU FP7 projekt PEPDIODE (GA 256.672) och REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), och en personlig forskningsanslag (nr 268/10) från Israel Science Foundation. Vi tackar Prof. Shmuel Rubinstein, Institutionen för teknik och tillämpad vetenskap, Harvard University, Cambridge, MA, USA för att ta konfokalmikroskopi bilder.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
References
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA – Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
