Summary
腸の上皮幹細胞（のISC）は、パネート細胞と混在しています。これらの細胞は、のISCをサポートするISCの子孫を分化し、抗菌保護を提供しています。ここでは、我々はパネート細胞は腸管上皮を維持する上で重要な役割を果たしていることを確立するために、トランスジェニック条件付きマウスモデルを使用する方法を示します。
Abstract
7日 - 哺乳類の腸の上皮表面は、すべて3を更新動的な組織です。この更新プロセスを理解することは、急速にLGR5遺伝子の発現によって特徴付けられる腸管幹細胞（のISC）をサイクリングの人口を同定しました。これらは、損傷の際にそれらを置き換えることができるBMI-1発現によってマーク静止幹細胞集団、によって支持されています。これらの集団間の相互作用を調査すると、疾患や癌における役割を理解するために不可欠です。 ISCは、腸の表面に陰窩内に存在し、これらのニッチは、上皮を補充するには、ISCをサポートしています。それは以前にLGR5 ISCの''幹細胞性」が「密接に隣接パネート細胞の存在に結びついていることが実証されているように、活性と静止のISCとの間の相互作用はおそらく、ニッチ内の他の分化細胞を含んでいます。条件CRE-LOXのマウスを使用モデル我々は、パネート細胞の存在下または非存在下で活性のISCの大部分を削除する効果を試験しました。ここでは、腸を特徴付け、パネート細胞はかなりの損傷後の回復を助けるのに、ISCのニッチ内の重要な役割を果たしていることを証明するために行わ技術と分析について説明します。
Introduction
哺乳動物の腸の管腔表面は、突起のような陰窩と指の繰り返し単位を備え、内腔に突出する絨毛は、と呼ばれます。 4日目1 -この表面は、ほぼ毎3完全な自己再生を受ける上皮の連続シートです。最初LGR5遺伝子 2,3の発現によって同定した。この動的な組織が 急速にサイクリング幹細胞（も陰窩ベース円柱細胞として知られているのISC）の人口でサポートされています。これらの細胞は、リーベルの陰窩の下部に特化したニッチに存在します。当初、のISCが急速にサイクリングた発見は、幹細胞が本質的に静止したことを支配する考えと耳障りでした。それは静止ラベルの人口は、陰窩のベースに対して4位置に細胞を保持すると仮定されたLGR5 + ISCの同定前、のISC 1でした 。最近の研究の時間今主に運命隣国4,5によって規制されている各陰窩における等効力サイクリングのISCのプールがあることを実証することによって、これらの観察を両立。イベントでは、彼らは、これらは通常、分泌系統にコミットしているが、ISCの人口は6を損傷した場合のISCに戻すことができ、静止細胞に置き換えることができます失われます。
ISCの隣人はのISCまたはその娘細胞のいずれかとすることができます。 ISCは、増殖しているライン腸管腔1上皮シートを備える特殊な細胞型に分化ナイーブ娘細胞を産生します。ゴブレット、腸、腸、房およびM細胞は、様々な吸収や調節機能を提供腔表面に上向きに移動するが、パネート細胞は、それらがのISCと混ざり存在陰窩の底に残っています。近年では、ナイーブdaughtの割合ことが実証されています分泌系統宛てER細胞が傷害6,7時に、ISCに戻すことのできるLGR5 LO細胞を保持静止ラベルです。
原因陰窩再生におけるその重要性に優先順位をのISCとその近隣諸国、特にパネート細胞間の相互作用を理解する上に置きました。パネート細胞はのISC 8をサポートしてニッチで重要な役割を果たしています。殺菌製品に加えて、パネート細胞は、ISCの再生または分化を支配する経路を活性化するシグナル伝達分子を生成します。以前の研究は、彼らが自分の娘パネート細胞8が提供する本質的なニッチ信号を競うことができたときにLGR5 +のISCにのみ存在することを示しました。これらの研究は、通常のLGR5 +のISCではなく、それらが損傷し、LGR5 LO集団からの補充を必要としている状況でパネート細胞の役割を調べました。
この技術を用いて、我々は、腸上皮にCatnB遺伝子 11を不活性化。 βカテニン、CatnB遺伝子産物は 、ISCのホメオスタシスを支配する標準的なWntシグナル伝達経路の重要な調節因子です。この戦略を使用して、前の2つの研究では、矛盾する結果12,13を生産しました。 Fevr ら12の研究は、幹細胞および腸の恒常性の喪失を示しました。アイルランドらに対し、14の研究では、細胞生存率の低下を以下陰窩-絨毛軸がCatnBを発現する野生型細胞からの再増殖したことを報告しました。これらの研究における主な違いは、腸の上皮でのCreを発現するために使用されるプロモーターでした。 Fevr らの研究は、Tを投与することによって活性化することができる、エストロゲン受容体に結合されたビリン遺伝子プロモーターを使用しましたamoxifen（VIL-のCre-ER T2の ）15,16。対照的にアイルランドらは、生体異物βナフトフラボン（AH-CRE）に応答して、Cre発現を駆動するために、ラットチトクロームP450A1（CYP1A1）遺伝子のプロモーター要素を利用します。これら異なるシステムの特徴は、これらの異なった観察を考慮するために、2つの仮説を生成しました。 CatnBをより効率良くサブ再増殖レベルへのISCの数を減らす、AH-CREに比べVIL-のCre-ER T2のシステムを使用して ISCで削除されていることを初めて。あるいは、それは、分化した細胞集団でCatnBの削除を差によるましました。 VIL-のCre-ER T2システムの対象AH-CREシステムに対し、陰窩および絨毛のすべての上皮細胞にのみ、ISCのニッチと陰窩の非パネート細胞を標的とします。これらのシステムはbehavを調べるための理想的なツールを提供しますISCのIORとパネート細胞との相互作用。ここでは、我々はパネート細胞は傷害17に腸の応答を媒介するのに重要な役割を果たしていることを決定するためにこれらのシステムを使用する方法に基づいていくつかの詳細なプロトコルを提示します。
Protocol
使用されるすべての材料に関する情報を表1に与えられている。全ての動物実験は、英国内務省プロジェクトライセンスの権限の下で行いました。
AH-CREとVIL-のCre-ER T2システムを使用して1 CatnB削除
- AH-CRE + CatnB + / +、AH-CRE + CatnB FLOX / FLOX、VIL- のCre-ER T2 CatnB + / +とVIL-のCre-ER T2 CatnB FLOXの14週齢のコホート- 10を生成するために、マウス系統を渡り/ FLOX。再結合の視覚的な分析のために、β-gal染色を経て、コホートはRosa26R-lacZレポーター 17が含まれている必要があります。コホートが変更遺伝子および誘導剤の使用の有無を制御する必要があり、必要な集団の大きさは、電力解析を用いて推定されるべきです。
- β準備AH-CRE導入遺伝子を誘導するために、; -Naphthoflavone（BNF）、またはVIL-のCre-ER T2導入遺伝子のタモキシフェン（TAM）は、トウモロコシ油中の10 mg / mlでの作業溶液を得ました。注：エージェントは、適切な個人用保護具を使用して、ドラフト内で秤量しなければなりません。
- 水浴中でBNFのための99.9°CまたはTAMのための80°Cのいずれかに琥珀色のボトルの熱ソリューション（BNFは光感受性です）。
- BNFのために100℃に設定された加熱攪拌機への転送、またはTAM 80℃、10分間攪拌します。
- 溶解するまでBNFは1.3から1.4を繰り返しために（> 1時間を取ることができます）。
- 小さな琥珀色の瓶（〜5ミリリットル）に小分けして、-20℃で凍結します。ボトルは、3回の凍結/融解サイクル後に廃棄されるべきです。融解エージェントを使用し、それらが溶液から下落している場合は、適切な温度に再加熱する前に。注射の前に、<37℃に冷却させます。
- 25gのマウスがapprop 0.2mlのを受け取り、例えば、80ミリグラム/ kgの用量でマウスに腹腔内（IP）を注射しますriate誘導剤。 AH-CREのために4日間毎日一回の注射を与えるVIL-のCre-ER T2の間 、24時間の期間中に3回の注射を提供します。
Reporterの可視化と免疫組織化学のための腸の2解剖（IHC）
- 倫理的承認に従って事前の麻酔なし頸椎脱臼を使用して、マウスを安楽死させます。仰臥位でマウスを置き、70％エタノールを使用してファーを濡らし、はさみを使用して正中線に沿って縦方向にイントラ腹腔を開きます。
- 鉗子で胃を保護し、食道への接続を切断。優しくお腹を引っ張ることにより、付録までの小腸を取り出します。そっと付録を引っ張って肛門までの大腸を削除します。
- 腸が単離されたら、胃や付録を削除します。平滑末端ピペットチップで注射器を用いて1×PBSで洗い流す腸。注：各腸は私でなければなりませんmmediately以下で説明する下流のアプリケーションのいずれかのために処理しました。
腸の3ホルマリン固定
- 3つの等しいサイズのセクションとラベル近位、中、遠位にフラッシュ腸をカット。 1cmの片に各セクションをカット。サージカルテープ2センチメートル×2センチの小さなストリップを取ります。ピラミッド形成のサージカルテープの中央に上の3つの1 5センチの部分を置きます。
- 閉じると、「ログパイル」効果を与えるために、縦方向の部分の周りにテープをシール。少なくとも10倍、組織のボリュームに固定液の量を中性緩衝ホルマリン固定液を大過剰を含む平底の容器に組織を配置します。注：固定用チューブ内の組織の過剰量を配置しないように、複数のコンテナに分割。
- 埋め込み、切片の前に24時間 - 少なくとも18 4℃で置きサンプル。核βカテニンの損失を防ぐために、24時間を超えて修正されません。70％エタノール、組織の少なくとも10倍の体積の大過剰を含有する平底容器に固定転送後の組織。
腸の4 Methacarn固定
- 300 mlのMeOHを、150 mlのクロロホルムおよび75 mlの氷酢酸を組み合わせることにより、methacarn固定液を調製解剖前に（4：2：1）。 、近位ミドルおよび遠位3同じサイズのセクションにフラッシュされた腸をカット。
- ろ紙（15cmのX15センチ）の一片側によって腸側の各部分を置き、springbowハサミを使用して「顔en 'とそれを開きます。室温で24時間 - 3 methacarnを含むガラス皿に腸及びろ紙を置きます。固定後、鉗子を用いて、腸セクションの最後を拾います。
- 「スイスロール」を形成し、わずかに鉗子を開き、それを介して25 G針を置くことによってロールを保護するために鉗子の周りの腸に風。ラを含む平底の容器に組織を配置します中性緩衝ホルマリン固定液のRGEの過剰、処理に進む前に、少なくとも1時間のための組織と店舗の体積に固定液の少なくとも10倍のボリューム。
5.ホールマウントのLacZの可視化（エルMarjou らから変更された。18）
- 1：10にミネラルオイルを溶融ralwaxを組み合わせることにより、ワックスプレートを準備します。 15cmのペトリ皿に注ぎ、冷却するために残します。 表1の通りのX-galの固定液を用意し、氷上で保存します。
- 腸全体を削除し、25ミリリットルの氷冷のX-galの固定液でフラッシュすることによって部2修正腸ごとに、氷冷1×PBSでを通じて洗い流します。
- 5等分（プレートあたり最大5） - はさみを使用すると、3に腸を切りました。ワックスプレート上に各セクションを置き、セクションは少し腸間膜ライン最上に延伸されるように、それぞれの端を突き止めます。余分な腸間膜をトリミング。 springbowハサミを使用すると、縦方向に腸を切断して、道に沿ってピン。60;
- セクションをカバーし、4℃で少なくとも1時間放置するのX-galの固定液でプレートを洪水。 25ミリリットルのピペットを用いて、X-galの固定液を取り出して、1×PBS 30mlで1回洗浄。理想的には、ロッキングプラットフォーム上で室温で60分間、 - 30のためのソリューションをdemucifying DTTを30 mlのカバーセクション。
- 25ミリリットルのピペットを用いてdemucifiying溶液を除去し、1×PBS 30mlでプレートをあふれさせます。パスツールピペットを使用して、粘液を除去するために、プレートに1×PBSを用いて腸セクションを洗います。
- X-gal染色の30ミリリットルと25ミリリットルピペットと洪水で1×PBSを削除します。ロッキングプラットフォーム上で穏やかに撹拌しながら、暗所で室温で一晩インキュベートします。
- 背景色はまだ白である場合のセクションでは、青/緑の汚れを開発したことを一晩のインキュベーションのチェックの後、新鮮な染色溶液を添加し、染色が発症するまで監視することができます。注：セクションでは、その後、染色した後、さらなる染色は行われませんすることができます。
- X-gal染色を削除1×PBS 30mlで25ミリリットルピペットや洪水プレートを使用し、穏やかに撹拌しながら3分間おきます。ピンを削除し、鉗子で、腸セクションの最後を拾います。少し鉗子を開き、それを介して25 G針を入れてロールを固定し、「スイスロール」を形成するために鉗子の周りの腸に風。
- 組織のボリュームに少なくとも10倍の固定剤の量の中性緩衝ホルマリン固定液を大過剰を含む広口平底の容器に組織を配置します。埋め込み、切片の前に少なくとも24時間4℃で置きサンプル。
腸から陰窩の6抽出
- セクションごとなど2.小腸の最初の20センチ、クリーンな解剖表面に腸を分離し、鉗子とはさみ接続されているすべての脂肪/腸間膜を削除を使用して。 springbowハサミを使用すると、縦方向に腸を開きます。
- fは、顕微鏡カバースライドを使用してirmly絨毛および粘液を除去するために、腸管内腔をこすり。はさみを使用して、ペニシリン（100 U / ml）およびストレプトマイシン（100 U / ml）を補充した約5 mmの片に腸を切断し、25 mlの1×HBSSで50 mlチューブに移します。
- RTで10分間インキュベートします。 70μmのセルストレーナーを通してサンプルを通過させることにより、抗生物質を含む培地を除去します。
- 10ミリリットル1×HBSSを含む新しい50mlチューブに腸のセクションを配置し、キャップを交換してください。
- 静かに二回反転させ、70μmのセルストレーナーを通過させることにより、1×HBSSを除去します。さらに6.4＆6.5三回繰り返すことで、腸の部分を洗浄し、最終的な割合が比較的明確であることを確認してください。
- EDTAの10ミリリットルを含む新鮮な50mlのチューブ（8ミリモル）/ 1×HBSSに組織を移し、室温で5分間おきます。 、または渦70μmのセルストレーナーを通過し、EDTA（8ミリモル）/ 1×HBSSを含む新しい50mlチューブに組織片を転送する - 活発（30×20）振ります。注意：絨毛上皮の分析が必要な場合は廃棄されるか、または保持することができるいずれかのフロースルー。
- 、30分間氷上で組織片をインキュベート精力的にサンプル振る（20 - 30倍）や渦を。 70μmのセルストレーナーを通してサンプルを渡し、これが陰窩が含まれているとして流れを介して、保持しています。
- 1×HBSS 10 mlを含む新しい50mlチューブに組織片を転送します。積極的に（20 - 30倍）振動や渦を、70μmのセルストレーナーを通過し、フロースルーを保持しています。腸の作品から陰窩の最大回復を確実にするために、もう一回繰り返します。 5分間300×gでの分画遠心を通る流れを結合します。上清を捨て、および陰窩ペレットを保持しています。注：ペレットを培養する（該当する場合）、または前の標準DNA / RNA /タンパク質抽出手順を-80℃で保存するためにすぐに使用することができます。
7.標準免疫組織化学的可視化
- 5μをカットポリ-L-リジン（PLL）スライド上のパラフィン包埋組織の切片M。注：B-カテニン抗体で染色するための標準プロトコルを以下に示すが、他の抗体のためのパラメータを表2に示します。
- 新鮮なキシレンを含むスライド浴中の2倍、3分間の洗浄と脱ワックス。 100％エタノール（2回）、95％エタノール、70％エタノール、最終的に1×PBSへ：新鮮含むスライドバスを通して3分間スライドを渡すことで水分補給。
- 場所は、クエン酸緩衝液（pH 6）を含むスライド槽に挿入し、抗原を取得するために20分間99.9℃で加熱します。スライドを冷却した後、5分間1xTBS / Tを含むスライド浴中に3回、5分間の洗浄を可能にします。 PAPペンで組織を中心に描くすぐに、最後の洗浄からスライドを外し、商業ペルオキシダーゼブロックまたは（蒸留H 2 O中 ）、1.5％のH 2 O 2とカバー部。
- 室温（RT）で20分間インキュベートし、次いで5分間、新鮮な1×TBS / Tを含むスライド浴中で3回洗浄します。洗浄した後、あなたの一次抗体の非特異的な疎水性結合をブロックするために室温で30分間、1xTBS / T / 5％正常ウサギ血清（NRS）に、カバーセクションるピペットを使用して。
- 5％のNRSで200：1に希釈したB-カテニン一次抗体でパスツールピペットとカバー部分とNRSのブロックを削除します。洗浄は、新鮮な1xTBS / Tを含むスライド浴中で3×5分間スライドします。注 - 他の抗体は、希釈および特異性の最適化が必要になります。抗体の特異性を確保するために、適切な抗体およびアイソタイプコントロールできない汚れを実行する必要があります。アイソタイプコントロールは、宿主種とあなたの一次抗体のアイソタイプにマッチしています。
- いずれかの市販のHRP検出キットまたは適切な蛍光標識二次抗体（ 表2）で視覚化します。注： - 15秒で十分です開発の長さは、10は、βカテニンのために、各抗体については異なります。抗体最初のESTの開発を最適化するにはablish時間の長さは、陽性対照スライドを使用して陽性細胞を可視化して、以降のすべてのスライドにこれを適用するために必要な。
- 洗浄は、新鮮なTBS / Tを含むスライド浴中で3×5分間スライドします。対比は、〜45秒（蛍光標識二次抗体を使用している場合は必要ありません）のためにヘマトキシリンを含むスライド浴中に浸漬することによりスライドします。きれいなスライド浴にスライドを入れ、完全に洗浄されていないヘマトキシリンを確保し、約1分間水道水ですすいでください。
- アルコールの濃度を増加させ、スライド含む浴を通過することによってスライドを脱水します。 1×70％EtOHに30秒、95％EtOH中の1×30秒、100％エタノールで2倍30秒洗浄、キシレンで2倍の2分。
- マウントは、市販の取り付けメディアを使用して、カバーガラスの下にスライドします。注：蛍光標識した抗体を使用している場合、核を標識し、DAPIを含む培地でマウントします。
特定Intestinaの8組織学的同定L上皮細胞
- 腸
- 表2に記載ビリン抗体および条件にセクション7を使用してセクションを準備します。
- 腸-内分泌細胞（Grimelius染色18,19）。
- 手順7.1から7.2に従うことにより、セクションを準備します。洗浄は3分間の超純水を含むスライド浴中にスライドします。予熱された銀溶液（ 表1）を含むスライド浴にスライドを移し、3時間60℃でインキュベートします。
- 3分間45℃で新たに調製した予熱した減速溶液（ 表2）を含むスライド浴中の銀溶液と場所からスライドを削除します。スライドを削除し、3分間、新鮮な超純水を含むスライド浴中に置きます。セクション7から手順7.6から7.8に従ってください。
- ゴブレット細胞（アルシアンブルー染色）。
- アルシアンB1をを含むスライド浴に..次の手順7.1から7.2による転送スライドをセクションを準備室温で5分間、UEのpHは2.5。 5分 - 3用水道の下にピペットと場所スライドバス付きのアルシアンブルー染色を削除します。ステップ7.6から7.8に従ってください。注：アルシアンブルー溶液をさらなる使用のために保持することができます。
- ISC。
- 識別するためのISCは、セクション9に従ってください。
- パネート細胞。
- 表2に記載したリゾチーム抗体および条件を用いてセクション7次のセクションを用意してください。
マウス腸19-21とその場のRNAの検出9.
- PLLスライド上に、ホルマリン固定された腸（セクション3）から5μm切片を置きます。 Olfm4式21を検出するための線形化ジゴキシゲニン標識RNAプローブを準備します。脱ワックスとは、セクション7の注に従って切片を再水和：このプロトコルは、RNAプローブの劣化を防止するために、RNAseを含まない環境で行われるべきです。
- トンの周りを描きますPAPペンで問題が試薬を最小限に抑えます。 30分間（蒸留H 2 O中）6％のH 2 O 2とスライド浴中にセクションをインキュベートします。 3分間、新鮮な1×PBSでスライド浴で二回洗浄します。氷上で20分間、4％パラホルムアルデヒドでピペット、カバー部を使用して、1×PBS捨て。
- 3分間、新鮮な1×PBSでスライド浴で二回洗浄します。 3分間の新鮮な1×PBSでスライド浴中で5分間の洗浄のためのプロテイナーゼK溶液でピペットカバーセクションを使用しました。 RTで5分間4％パラホルムアルデヒドで被覆することによってピペット接尾部を使用して。
- DEPCでスライド浴で洗浄は2分間のH 2 Oを処理しました。撹拌しながら10分間、無水酢酸溶液中にピペットカバーセクションを使用して。 1×食塩水/ 3分、続いて新鮮な1×PBS / 3分、とスライド浴で洗浄します。アルコールの濃度の増加を含むバスを介してスライドを渡します。 70％のEtOH、95％EtOH中の1×30秒で1×30秒、新鮮な100％エタノールで2倍30秒の洗浄、新鮮なキシレンで2分を2倍空気乾燥させ。
- 希釈Olfm4プローブ1：ハイブリダイゼーション緩衝液中の100および3分間80℃に加熱することによって、プローブを変性させます。各セクションにプローブを100μlを適用し、スライドの脱水を防ぐためにパラフィルムでカバーしています。 65℃の暗所、湿室中で一晩インキュベートします。
- 15分間、65℃で5×SSCでスライド浴で洗浄します。 65℃で30分間、新鮮な50％ホルムアミド/ 5×SSC / 1％SDSで二回スライド浴中で洗浄セクション。 10分、65℃での最初の、室温で二新鮮なPBTでスライド浴中に二回のセクションを洗ってください。 PBTは、37℃で45分間、25μgのRNアーゼを含有するピペットカバーセクションを使用して。室温で5分間PBTでスライド浴でセクションを洗ってください。
- 65℃で30分間、新鮮な50％ホルムアミド/ 5×SSCで二回スライド浴中で洗浄セクション。 、暗闇の中でPBTや店舗で、10％ヒツジ血清をピペットを用いて、MOIをカバーセクションをブロックするには3時間 - 2 RTでST室。
- 5 mg / mlのマウスの腸の粉末を含むPBT 10％ヒツジ血清を500：1の抗ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ結合抗体を希釈することによって抗体を準備します。ロッキングプラットフォーム上で暗所で4℃で3時間インキュベートします。過剰腸粉を除去し、上清に、PBTの1％のヒツジ血清の3倍のボリュームを追加するためにスピンダウン。
- ピペットでスライドからブロックを削除し、各セクションへの抗体溶液100μlを加え、パラフィルムで覆い、4℃で一晩、暗い、湿ったチャンバー内でインキュベートします。 5分間新鮮なPBTでスライド浴中に3回のセクションを洗ってください。ブロックするためのセクションでは、スライド浴中で5分間、新鮮なNTMTバッファーで3回洗浄します。
- BMとの各セクションでは、紫色のピペットカバーを使用して、視覚化し、24室温で暗所でインキュベートする - 十分に強い色が開発されるまで72時間。 1分間エオシンで浸漬することによって、一度PBTと対比でスライド浴でセクションを洗ってください。レモ5分 - 3用の流水でスライド浴中の洗濯セクションによって過剰エオシンVEの。キシレンにスライドを浸し、空気乾燥させ。商業メディアを使用してカバースリップの下にマウントします。
腸管上皮の組織学的特性評価10
- PLLスライド上に固定された組織（セクション3＆4）から5μm切片を置きます。 ≥25ランダム全体（または≥50半分）以下の各パラメータの各コホートの≥4マウスから陰窩を分析します。注：整合性を維持するため（だけ近位端を使用）、各腸の同じ場所から陰窩を分析します。
- （特に明記しない限り）は、標準的なH＆E染色した切片から細胞パラメーター：クリプト数、高さ、アポトーシスおよび有糸分裂。
- 墓所番号。
- 手動で基底層と接触している陰窩の数をカウントするために、低電力倍率（ 例えば 4Xまたは10X）を使用します。カウント≥10横基部腸の宗派少なくとも4匹のマウスからのイオン。
- 墓所の高さ。
- 手動陰窩/絨毛軸（ 図3b）に陰窩の底から細胞数をカウントするために高出力倍率（ 例えば 20倍または40倍）を使用します。
- アポトーシス22、23。
- 方法1：手動で各クリプトにアポトーシス細胞の数をカウントするために高出力倍率（ 例えば 20倍または40倍）を使用します。アポトーシス細胞は、細胞収縮、クロマチン凝縮、細胞質ブレブ及びアポトーシス小体（ 図3a）を形成することによって同定することができます。
- 方法2： 表2に記載された条件を用いてカスパーゼ-3のためのIHC染色（セクション7）を実行し、高出力倍率を使用して（例えば、20Xまたは40X。）手動で細胞を定量するために、各陰窩における陽性細胞の数を数えます。アポトーシスの実行段階。
- 有糸分裂。
- 墓所番号。
- 増殖。
- 表2に記載された条件を用いてのKi-67のためのIHC（セクション7）染色を実行します。手動で増殖する陰窩細胞の割合を定量するために陽性細胞をカウントします。
Representative Results
AH-CREにISCの再結合効率を比較するとVIL-のCre-ER T2システム
損傷後の腸のISC内の再結合効率の必要な特徴付けを再構築において、パネート細胞の役割を評価するためのこれらのcre-LOXシステムの使用 。我々は両方のシステムで3日誘導（DPI）を投稿小腸（ 図1a）で約100％の再結合が存在することを実証しRosa26R-lacZの条件付きレポーターを使用します。 qPCRにより再結合対立遺伝子の存在を定量化は、システム間でのCreの発現パターンの差異によって混乱しました。 VIL-のCre-ER T2システムが原因epitheliの大部分でその式に、AH-CREシステムに比べて再結合し、対立遺伝子の存在下で3.53倍の増加を示しました16。これを克服するために私たちは私たちが直接システムを比較することができ、異なる戦略を採択しました。我々は、さまざまな誘導体制をマウスに誘導し、その時点でのLacZ陽性の陰窩および絨毛は、ISCの組換え事象を表し、30 dpiで分析しました。我々は最初の再結合レベルはVIL-のCre-ER T2においてはるかに大きいことにもかかわらずのISCの同等数で再結合し、両方のシステム、誘導剤の3回の注射（24時間で80ミリグラム/ kgでIPを配信）でことを証明したこの手法を用いてシステム16（ 図1B-D）。さらに、再結合陰窩から抽出したDNAを使用して、再結合対立遺伝子について定量PCRは、潜在的に起因AH-CREシステムを使用して観察されないパネート細胞における組換えに、VIL-作成より ER T2システムを使用して組換え非有意な増加を示しました（ 図1D）。さらに、上皮細胞型のための染色はINDIませんでしたケイト分化パターンへの変更は、調べた各細胞型の代表的な画像を図2E-2Hに示されています。
CatnB削除以下の腸管上皮のキャラクタリゼーション
墓所損失の定量化
これらのCreシステムでの再結合の動力学を特徴付けることのISCの同等の数が再結合されたときに、マウスの腸を分析することができました。 LacZレポーターを使用して、両方のシステムは、3解像度（ 図2a）で再結合（青）細胞の完全な損失を示しました。既報の通り3日間CatnBの削除後AH-CREマウスはVIL-Creを-ER T2マウスに対し、部分的な陰窩損失を示した陰窩/絨毛軸13,16,24（ 図2B-D）の完全な破壊を示しました。 上皮再増殖のダイナミクス
我々上記の技術を使用すると、この観察結果を理解するために私たちを可能にするために複数のパラメータを特徴とします。パラメータ及び細胞型の代表的な画像が7のプロトコルを用いて分析- 10に示されているが（ 図3aおよび図3b）。簡単に言えば、陰窩の損失は両方のシステム（ 図3E）に表示されるアポトーシスのレベルの上昇と一致しました。しかし、有糸分裂、増殖、陰窩細胞の高さ、陰窩および式（図示せず）のデータは、AH-CREシステムが非組換えのISC（ 図3c）によりおそらく再増殖に、回復可能性が示されました。荒涼と比較して、VIL-のCre-ER T2は、上皮陰窩細胞（ 図3d）を保持にもかかわらず、回復に失敗しました。
墓所内の細胞表現型の特性評価
VIL-のCre-ER T2は我々が三日CatnBの削除後に上皮細胞を特徴とすることができませんでした一方。AH-Creマウスからの陰窩が再投入ができた理由を理解するために、 in situハイブリダイゼーション （セクション9）と、IHC分析（セクション7、8＆10） に用いて、我々は、VIL-Creを-ER T2 CatnB FLOX / FLOXマウスの陰窩細胞は非増殖性であることを実証したとISCマーカーOlfm4の発現を欠いていました、AH-CREマウスにおける陰窩（ 図4c＆F）とは異なり。初期特性は陰窩における再結合が等価であることが実証されたていたとして、我々は、パネート細胞の役割を調べるために進みました。我々は、βカテニン、彼らはパネート細胞（ 図5a-5c）はあったかどうかを失っていた細胞を識別するためのCatnBとLyz1に対する二重の蛍光IHCを行いました。以前に我々は、D説明したようにすべての陰窩細胞がVIL-のCre-ER T2のシステムを使用してターゲットとしていることをemonstrated。比較ではAH-CREシステムは、パネート細胞と絨毛上皮を免れます。さらにパネート細胞は、VIL-のCre-ER T2システム （ 図5Dおよび5E）を用い CatnB削除した後、アポトーシスを受ける観測されました。
図1：AH-CREとVIL-のCre-ER T2システムを使用して、腸管上皮内の特異性とのCre /ロックス組換えの効率の比較（A）：ホールマウント小（SIにおけるAH-CRE LacZレポーターの発現を可視化。 *先端）と大型（LI; *先端）は、野生型マウスから。 （B）：1解像度での再結合CatnB FLOXの対立遺伝子について定量PCR上映倍数変化の結果は、AH-CRE CatnB FLOX / FLOX（BNFが誘導）で異なる誘導体制を比較するとVIL-のCre-ER T2 CatnB FLOX / FLOX（TAMが誘発されます）; * P> 0.05（マン・ホイットニー[2尾]対照と比較して）。 （C） - （E）：ホールマウント小腸示すのLacZ陽性の地下室30解像度パネル（B） - （e）のパリーら 16から変更されたこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：AH-CREとVIL-のCre-ER T2の比較
gether.withinページ= "常に"> 
図3：表現型の発症の特性小腸上皮内のISC同様の数に条件付き削除CatnBためにAH-CREとVIL-のCre-ER T2システムを使用して、（A＆B）地下室の位置を示すH＆E染色したホルマリン固定切片。高さ（[）、アポトーシス（←）および分裂細胞（↓）。 3つの時点（DPI）（c）の陰窩の高さ、（d）の有糸分裂および（e）アポトーシスにおける野生型（青）及びCatnB FLOX（オレンジ）マウスとの間の陰窩あたりの細胞の平均数の定量化（エラーバーは標準偏差を示します）。パネル（C） - （e）は、パリーら 16から変更。3429fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
AH-CRE（AC）を使用して3日CatnBの削除後の小腸上皮における条件付き削除CatnBためにAH-CREとVIL-のCre-ER T2システムを使用して、ISC特性の比較上皮陰窩細胞またはvil-：図4。 Cre-ER T2（DF）システム。 （A＆D）、H＆Eセクション陰窩損失の領域を示します。 （B＆D）のKi-67 IHCはVIL-のCre-ER T2とを用いて、増殖性細胞の喪失を実証します。 （C＆F）Olfm4はその場でああ-CREを用いた機能のISCの存在を実証します。パネル（A） - （f）のパリーら 16から変更されたこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：VIL-のCre-ER T2を使用してCatnB削除後のパネート細胞およびAH-CREシステムの特性（AC）：パネート細胞を示す陰窩の免疫蛍光画像（赤）、B-カテニン（緑）、核（青）、矢印は膜結合βカテニンを示しています。カスパーゼ3（デ）IHCアポトーシスパネート細胞を示すAH-CRE（D）には存在しないが、VIL-のCre-ER T2のシステム （e）の中に存在しています 。パネル（A） - （E）から改変パリーら 16。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 酢酸緩衝液 | * | * | 4.8ミリリットル0.2 M酢酸、45.2ミリリットルの0.2M酢酸ナトリウム＆50ミリリットルの蒸留水：100ミリリットルを作成するには | ||||
| 酢酸 | フィッシャーサイエンティフィック | C / 0400 / PB17 | |||||
| 無水酢酸 | シグマ | A6404 | |||||
| 無水酢酸溶液 | * | * | 0.1Mのトリエタノールアミン塩酸塩中の2M無水酢酸 | ||||
| アルシアンブルー | シグマ | A5268 | |||||
| アルシアンブルーPH 2.5 | * | * 500ミリリットルにする：15ミリリットルの酢酸を、5グラムアルシアンブルー＆485ミリリットルの蒸留水 | |||||
| 抗ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体 | アブカム | ab119345 | |||||
| B（ベータ）-Naphthoflavone | シグマ | N3633 | BNFは、化合物が溶液からドロップされますように解決策があまりにも多くを冷却させることなしに注入します。ソリューションを再利用することができます - ストアを使用の間、-20℃で、二回以上を再加熱しないでください。 | ||||
| Bloxall | ベクター研究所 | SP-6000 | |||||
| BMパープル | ロッシュ | 11442074001 | |||||
| BSA | シグマ | A4503 | ウシ血清アルブミン | ||||
| クロロホルム | フィッシャーサイエンティフィック | C / 17分の4920 | |||||
| クエン酸緩衝液/抗原アンマスキングソリューション | ベクター研究所 | H-3300 | |||||
| コーンオイル | シグマ | C8627 | |||||
| Demucifiyingソリューション | * | * | 50ミリリットルグリセロール、50ミリリットルのトリス、0.1M pH8.8、100ミリリットルのEtOH、300ミリリットル生理食塩水（水中の0.9％NaCl）、DTT 1.7グラム：500ミリリットルのために。 Demucifyingソリューションは、事前に行われ、保存されたが、DTTはただのインキュベーション（340ミリグラム/ 100ミリリットル）の前に追加することがsholudすることができます。 | ||||
| DEPC処理水 | ライフテクノロジーズ | 750023 | |||||
| DTT | シグマ | 101509944 | |||||
| EDTA | シグマ | O3690 | 0.5 M | ||||
| エタノール | フィッシャーサイエンティフィック | E / 0650DF / 17 | |||||
| 濾紙 | ワットマン紙 | 3000917 | |||||
| ホルムアルデヒド | シグマ | F8775 | |||||
| ホルマリン | シグマ | SLBL11382V | 中性緩衝ホルマリン | ||||
| ホルムアミド | シグマ | F5786 | |||||
| Glutaraldehye | シグマ | G6257 | |||||
| H 2 O 2 | シグマ | 216763 | |||||
| ヘマトキシリン | レイモンド・ラムA | 12698616 | |||||
| HBSS | ギブコ | 14175-053 | HBSS（-MgCl2 +; -CaCl2） | ||||
| ハイブリダイゼーション緩衝液 | * | * | 5×SSC、50％ホルムアミド、5％SDS、1mg / mlのヘパリン、1 mg / mlのウシ肝臓のtRNA | ||||
| ハイドロキノン | シグマ | H9003 | |||||
| ImmPACT DABペルオキシダーゼ | ベクター研究所 | SK-4105 | ベクター研究所 | MP-7402 | |||
| Immpress HRP抗ウサギIgGキット | ベクター研究所 | MP-7401 | |||||
| 腸組織粉末 | * | * | 5成体マウスの小腸を氷冷PBSの最小体積で混合し、均質化しました。氷冷アセトンを4容積を十分に混合し、氷上で30分間インキュベートしたホモジナイズ腸に添加しました。これを遠心分離し、ペレットを、氷冷アセトンを用いて洗浄しました。これにより、遠心分離し、得られたペレットを濾紙上に広げ、乾燥させます。一度徹底的に材料は乳棒と乳鉢を用いて微粉末に粉砕した乾燥させます。 | ||||
| K-フェリシア | シグマ | P-3667 | |||||
| K-フェロシアン | シグマ | P3289 | レバミゾール | シグマ | L0380000 | ||
| Methacarn | * | * | 60％メタノール：30％クロロホルム：10％酢酸 | ||||
| メタノール | フィッシャーサイエンティフィック | M / 17分の4000 | |||||
| MgCl 2 | シグマ | M8266 | |||||
| 正常ヤギ血清 | ベクター研究所 | S-1012 | NGS | ||||
| 正常ウサギ血清 | ダコ | X0902 | NRS | ||||
| NTMT | * | * | 100mMのNaCl、100mMのトリスHCl、50mMのMgCl 2を、0.1％のTween20、2mMのレバミゾール | ||||
| PAPペン | ベクター | H-400 | |||||
| パラホルムアルデヒド | シグマ | P6148 | |||||
| PBT | * | * | 0.5 MのNaCl、10mMのTrisHCL pHは7.5、0.1％のTween 20 | ||||
| ペニシリン/ストレプトマイシン | ギブコ | 15140-122 | 100Xのsolutiuon。 | ||||
| リン酸緩衝生理食塩水（10倍） | フィッシャーサイエンティフィック | BP3994 | 1Xを作るために、蒸留水で1:10 Dilluted | ||||
| PLLスライド | シグマ | P0425-72EA | ポリ-L-リジン顕微鏡スライド | ||||
| プロテイナーゼK | シグマ | P2308 | |||||
| プロテイナーゼK溶液 | * | * | 50 mMトリス、5mMのEDTA中に200μg/ mlのプロテイナーゼKを希釈します。 | ||||
| Ralwax | BDH | 36154 7N | |||||
| 減速ソリューション | * | * | 1gのハイドロキノン、5gの亜硫酸ナトリウムと100ミリリットルの蒸留水：100ミリリットルを作成するには | ||||
| RNアーゼA | シグマ | R6148 </ TD> | |||||
| 生理食塩水 | * | * | 蒸留水中の0.9％NaCl | ||||
| SDS | シグマ | I3771 | |||||
| ヒツジ血清 | シグマ | S3772 | |||||
| 硝酸銀 | シグマ | S / 1240から1246 | |||||
| 銀液 | * | * | 10ミリリットルの酢酸緩衝液、87ミリリットルの蒸留水、3ミリリットル1％硝酸銀：100ミリリットルを作成するには | ||||
| 酢酸ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィック | S / 53分の2120 | |||||
| 塩化ナトリウム | シグマ | S6753 | 塩化ナトリウム | ||||
| 亜硫酸ナトリウム | シグマ | 239321 | |||||
| SSC | シグマ | 93017 | 20倍の生理食塩水クエン酸ナトリウム | ||||
| サージカルテープ | フィッシャーサイエンティフィック | 12960495 | |||||
| タモキシフェン | シグマ | T5648 | TAMは、化合物が溶液からドロップされますように解決策があまりにも多くを冷却させることなしに注入します。ソリューションを再利用することができます - ストアを使用の間、-20℃で、二回以上を再加熱しないでください。 | ||||
| TBS / T | セルシグナリング | ＃9997 | |||||
| トリエタノールアミン塩酸塩 | シグマ | T1502 | |||||
| トリス塩酸 | インビトロジェン | 15567-027 | |||||
| トゥイーン20 | シグマ | TP9416 | |||||
| VectaMount | ベクター研究所 | H-5000 | |||||
| ベクタシールドHardset DAPIでミディアムを装着します | ベクター研究所 | H-1500 | |||||
| ABCキットベクタステイン | VECTまたはラボ | PK-4001 | |||||
| X-GAL | プロメガ | V3941 | |||||
| X-galの固定液 | * | * | 2％ホルムアルデヒド、を1×PBS中の0.1％グルタルアルデヒド | ||||
| X-gal染色 | * | * | X-gal染色; 50ミリリットルの溶液B（0.214グラムのMgCl 2、0.48グラムのK-フェリシアン500 mlのPBSで0.734グラムのK-フェロシアン）で200μlのX-GAL（A）。溶液Bは、4℃で予めOIN作製し、保存することができます | ||||
| キシレン | フィッシャーサイエンティフィック | X / 0200/21 |
表1：材料と方法
| ターゲット | βカテニン | リゾチーム | Ki67 | カスパーゼ3 | ビリン |
| 一次抗体の商業的供給源 | トランスダクション・ラボ | Neomarkers | ベクター研究所 | R＆Dシステムズ | サンタクルーズ |
| カタログナンバー | 610154 | RB-372 | VP-K452 | AF835 | SC-7672 |
| 一次Abがで上げ | マウスモノクローナル抗体（mAb） | うさぎ（PAB） | マウスモノクローナル抗体（mAb） | うさぎ（PAB） | ヤギ（PAB） |
| 抗原検索 | 沸騰水浴/クエン酸緩衝液 | 沸騰水浴/クエン酸緩衝液 | 沸騰水浴/クエン酸緩衝液 | 沸騰水浴/クエン酸緩衝液 | 沸騰水浴/クエン酸緩衝液 |
| ペルオキシダーゼブロック | Bloxallまたは2％H 2 O 2、45秒 | Bloxallまたは1.5％H 2 O 2、30分 | Bloxallまたは0.5％H 2 O 2、20分 | Bloxallまたは2％H 2 O 2、45秒 | Bloxallまたは3％H 2 O 2、20分 |
| 血清ブロック | 1％のBSA、30分 | 10％NGS、30分 | 20％NRS、20分 | 10％NGS、45分 | 10％NRS、30分 |
| 洗浄バッファー | PBS | TBS / T | TBS / T | PBS | TBS / T |
| 一次抗体のための条件 | 1/300、RTで2時間 | 1/100、室温で1時間 | 1/50、室温で1時間 | 1/750、O / Nで4℃で | 1/500、RTで1時間 |
| 二次抗体 | Immpress HRP抗マウスIgGキット | Immpress HRP抗ウサギIgGキット | ビオチン化ウサギ抗マウス | ビオチン化ヤギ抗ウサギ | ビオチン化ウサギ抗ヤギ |
| 二次抗体のための条件 | 室温で1時間 | 室温で30分 | 1/200、RTで30分間 | 1/200、RTで30分間 | |
| 信号増幅 | N / A | N / A | ABCキット | ABCキット | ABCキット |
| 信号検出 | ImmPACT DABペルオキシダーゼ | ImmPACT DABペルオキシダーゼ | ImmPACT DABペルオキシダーゼ | ImmPACT DABペルオキシダーゼ | ImmPACT DABペルオキシダーゼ |
| 免疫蛍光抗体 | 488のAlexaFluor | 594のAlexaFluor | N / A | N / A | N / A |
| 免疫蛍光のプロパティ | 励磁最大488 /発光最大525 | 励磁最大595 /発光最大617 | |||
| 一般的なフィルタセット | FITC | テキサスレッド |
Discussion
遺伝子および細胞の機能を分析するために、条件CRE-LOXトランスジェニックマウスを使用すると、一般的に使用されるアプローチです。これらのモデルは、特定し、特徴づける幹細胞2,4-6をし、病気25におけるその役割を理解するために腸で大きな成功を収めて使用されています。完全にこれらのモデルを活用するために、正しく解釈されるデータを可能にするために、システムの総合的な特性評価が必要です。これらのシステムの完全な理解が原因遺伝子はほとんど孤立細胞型または位置、生物学的知識及びCre発現を誘導するために使用されるシステムの非効率性の欠如に特定されないように達成することは困難です。ここで説明する方法は、我々は実験的なデザインと既存の知識のアプリケーションを介してこれらの問題を克服する方法を示します。我々は、ここで紹介するテクニックは一般的なものとムリを調査する任意の研究に利用することができる特定の研究の質問に答えるために、これらのメソッドを使用しましたがNE腸。
腸組織の作製
強固な結果を確保するための重要なステップは、厳密に付着適時および固定プロトコルで処理する必要がある組織の採取及び処理です。ほぼすべての重要な問題は、下流の組織乾燥アウトおよび/または不完全な固定に関連するアーティファクトに起因することができます。タイミングは、組織構造および/または核酸およびタンパク質の分解を防ぐために重要です。不完全または熱心固定は、組織化学的解像度の損失につながることができます。固定液の浸透がIHC分析の際に「潮マーク」として観察することができる腸陰窩内解像度の損失をもたらすことができるようにするにはあまりにも厚く、不十分な時間やセクションに不完全な固定。さらに核βカテニンはすぐにプロのない限り、核の外に拡散することができるように、それは、固定が長すぎるために拡張されないことが重要ですcessedとホルマリン固定次の埋め込みワックス。
ISCのニッチでパネート細胞の役割
ここに示されたデータは、効果的に、ISCの損失以下の成人の腸内で暗号再生におけるパネート細胞の重要性を示しています。しかしそこにAH-CREはVIL-のCre-ER T2をターゲットことのISCの人口を惜しみ可能性が残りました。天ら26はエレガント LGR5 ハイテクのISCがLGR5 LO予備のISCの人口に置き換えられていることを実証しました。今はこれらのISCが原因で分泌細胞前駆体6,7として同定された予備の集団にAH-CREシステムに免れている可能性が高いようです。 ISCの状態に戻すために必要なときに、これらの分泌細胞前駆体を支える成熟パネート細胞の重要性が答えられることを残ります。パネート細胞は、Iを構成するようにSCニッチ8とカロリー摂取量27と炎症28にISC応答の調節に役割を果たし、それは彼らの看護の機能は、独自の前駆体に拡張される可能性が残っています。
新しいアプローチとテクノロジモデルヒト結腸直腸癌を効果的に
ISCの発見は、今やクラークら9によって概説腸生物学および疾患における遺伝子と細胞の役割を調べるための新しいマウスモデルを生成するために使用されている遺伝子の同定につながりました。この技術の唯一の制限は、Creタンパク質を発現する遺伝子の同定です。現在のISCは定期LGR5遺伝子発現パターンに基づいて、条件付きトランスジェニックマウスを用いて調べました。 LGR5プロモーターからのCreを発現するマウスは 、APC、最も一般的に大腸癌で変異遺伝子（CRCを削除するために使用されています）、起源25のセルとして、ISCを実証します。選択的に削除するこれらの細胞内の他のCRC遺伝子は、疾患の進行への洞察を提供し、広がっているなど。PTEN 29。 ISC機能へのさらなる洞察は、ヒトジフテリア毒素受容体（DTR）遺伝子を用いて、マウスの細胞を発現性LGR5を切除することにより取得されるLGR5座 26にノックしました。他の戦略は、変異タンパク質30の継続的な可逆的発現を可能にテト-Oシステムを使用しています。異なるセル31との位置32,33における遺伝子（複数可）を変更するためにこれらのツールを使用すると、癌は、進行を開始し、34の転移方法を理解するために使用されます。あるいは、眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いて、突然変異誘発は、CRCの新しいドライバを識別しています。マウス、技術や遺伝子変化戦略の継続的な開発は、より多くの患者関連するモデルを開発し続けています。
新しいメートルethodsは、腸管上皮とのISCの特徴付けのために開発されてきました。上皮細胞型の割合の特徴付けは、レクチンおよびCD24 35の示差的な発現に基づいてフローサイトメトリーを用いて達成することができます。潜在ISC生物学および疾患におけるそれらの役割を理解する上で最大の進歩は 、ex vivoオルガノイド培養系36を用いて説明します。このシステムは、彼らが複製し、より生理学的に関連する方法で差別化、3D、培養に正常および悪性のISCを可能にします。これらは個別化医療37への道を切り開いて、in vitroで患者サンプルに対する薬物の直接的な試験を可能にすることが期待されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetate buffer | * | * | To make 100 ml: 4.8 ml 0.2 M Acetic acid, 45.2 ml 0.2 M Sodium acetate & 50 ml distilled water |
| Acetic acid | Fisher Scientific | C/0400/PB17 | |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | |
| Acetic anhydride solution | * | * | 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride |
| Alcian Blue | Sigma | A5268 | |
| Alcian Blue pH 2.5 | * | * | To make 500 ml: 15 ml acetic acid, 5 g Alcian Blue & 485 ml distilled water |
| anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody | Abcam | ab119345 | |
| B(beta)-Naphthoflavone | Sigma | N3633 | BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice. |
| Bloxall | Vector Labs | SP-6000 | |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| BSA | Sigma | A4503 | Bovine serum albumin |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4920/17 | |
| Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution | Vector Labs | H-3300 | |
| Corn oil | Sigma | C8627 | |
| Demucifiying solution | * | * | For 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml Tris 0.1M pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7 g. Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340 mg/100 ml). |
| DEPC treated water | Life Technologies | 750023 | |
| DTT | Sigma | 101509944 | |
| EDTA | Sigma | O3690 | 0.5M |
| Ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | |
| Filter paper | Whatman | 3000917 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Formalin | Sigma | SLBL11382V | Neutral buffered formalin |
| Formamide | Sigma | F5786 | |
| Glutaraldehye | Sigma | G6257 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | |
| Haematoxylin | Raymond A Lamb | 12698616 | |
| HBSS | Gibco | 14175-053 | HBSS (-MgCl2+; -CaCl2) |
| Hybridisation buffer | * | * | 5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Labs | SK-4105 | |
| Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit | Vector Labs | MP-7402 | |
| Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit | Vector Labs | MP-7401 | |
| Intestinal tissue powder | * | * | The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 min. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. |
| K-ferricyanide | Sigma | P-3667 | |
| K-ferrocyanide | Sigma | P3289 | |
| Levamisole | Sigma | L0380000 | |
| Methacarn | * | * | 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4000/17 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | S-1012 | NGS |
| Normal rabbit serum | Dako | X0902 | NRS |
| NTMT | * | * | 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole |
| PAP pen | Vector | H-400 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBT | * | * | 0.5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x solutiuon. |
| Phosphate buffered saline (10x) | Fisher Scientific | BP3994 | Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x |
| PLL slides | Sigma | P0425-72EA | Poly-L-lysine microscope slides |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Proteinase k solution | * | * | Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA. |
| Ralwax | BDH | 36154 7N | |
| Reducer Solution | * | * | To make 100 ml: 1 g Hydroquinone, 5 g sodium sulphite & 100 ml distilled water |
| RnaseA | Sigma | R6148 | |
| Saline | * | * | 0.9% NaCl in distilled water |
| SDS | Sigma | I3771 | |
| Sheep serum | Sigma | S3772 | |
| Silver nitrate | Sigma | S/1240/46 | |
| Silver solution | * | * | To make 100 ml: 10 ml Acetate buffer, 87 ml distilled water, 3 ml 1% silver nitrate |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S/2120/53 | |
| Sodium Chloride | Sigma | S6753 | NaCl |
| Sodium sulfite | Sigma | 239321 | |
| SSC | Sigma | 93017 | 20x saline sodium citrate |
| Surgical tape | Fisher Scientific | 12960495 | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice. |
| TBS/T | Cell Signalling | #9997 | |
| Triethanolamine hydrochloride | Sigma | T1502 | |
| Tris-HCL | Invitrogen | 15567-027 | |
| Tween20 | Sigma | TP9416 | |
| VectaMount | Vector Labs | H-5000 | |
| VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Labs | PK-4001 | |
| X-gal | Promega | V3941 | |
| X-gal fixative | * | * | 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1x PBS |
| X-gal stain | * | * | X-gal stain; 200 μl X-gal (A) in 50 ml solution B (0.214 g MgCl2, 0.48 g K-ferricyanide, 0.734 g K-ferrocyanide in 500 ml PBS). Solution B can be made up oin advance and stored at 4 °C |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0200/21 |
References
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- Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science. 330 (6005), 822-825 (2010).
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