Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Протоколы для анализа роли Paneth клеток для регенерации мышиной кишечника с помощью условных Published: November 21, 2015 doi: 10.3791/53429
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1European Cancer Stem Cell Research Institute, Cardiff University, 2Institut Curie

Summary

Кишечные эпителиальные стволовые клетки (ISCS) перемешаны с Paneth клеток. Эти клетки дифференцируются потомство ISC, которые поддерживают ISCs и обеспечить антибактериальную защиту. Здесь показано, как мы использовали трансгенных условные модели мыши, чтобы установить, что Paneth клетки играют ключевую роль в поддержании кишечную эпителия.

Abstract

Эпителиальный поверхности кишечника млекопитающего является динамическим ткани, обновляет каждые 3 - 7 дней. Понимание этого процесса обновления идентифицировали население быстро велосипеде кишечные стволовые клетки (ISCS), характеризующийся своей экспрессии гена Lgr5. Они подкрепляются покоя популяции стволовых клеток, отмеченной ИМТ 1 выражения, способного заменить их в случае повреждения. Исследуя взаимодействие между этими группами населения имеет решающее значение для понимания их роли в болезни и рака. В ISCs существуют в склепах на поверхности кишечника, эти ниши поддерживать ISC в пополнении эпителий. Взаимодействие между активными и неактивными ISCS вероятно, включает в себя другие дифференцированные клетки в нише, как это ранее было показано, что '' стволовости '' в Lgr5 ISC тесно связана с наличием их соседних Paneth клеток. С помощью условного CRE-LOX мышьМодели, которые мы исследовали влияние удаления большинства активных ISCS в присутствии или в отсутствие клеток Paneth. Здесь мы опишем методы и анализ с целью охарактеризовать кишечник и продемонстрировать, что клетки Paneth играть решающую роль в нише ISC в пособничестве восстановления после существенного оскорбление.

Introduction

Просвета поверхности кишечника млекопитающего Характеристика повторяющиеся звенья крипт и пальцем выступами, называется ворсинки, которые выступают в просвет. Эта поверхность является сплошной лист, который подвергается эпителий полностью самообновление примерно каждые 3 - 4 дня 1. Этот динамический ткани поддерживается населением быстро велосипеде стволовых клеток (ISCS; также известный как крипты базы столбчатые клетки), которые первоначально были идентифицированы по их экспрессии гена Lgr5 2,3. Эти клетки существуют в специализированной нише на дне крипт Либеркюна. Первоначально открытие, что ISCs быстро велосипеде был несогласный с господствующей идеей, что стволовые клетки был в состоянии покоя в природе. До идентификации Lgr5 + ISC было выдвинуто предположение, что население покоя этикетке сохраняя клетки при +4 позиции по отношению к базе склепе, были ISCs 1. Недавние исследования ча ныне примирил эти наблюдения, продемонстрировав, что в первую очередь имеется бассейн равносильными велосипеде ISCs в каждом склепе чья судьба регулируются своими соседями 4,5. В случае они будут потеряны они могут быть заменены покоящихся клетках, которые обычно совершаются с секреторной линии, но можно вернуться к ISCS если население ISC поврежден 6.

ISC соседи могут быть либо ISCs или их дочерние клетки. В ISCs производить наивные дочерние клетки, которые размножаются и дифференцируются в специализированные типы клеток, которые составляют эпителиальных листа, который линии просвет кишечника 1. На кубке, энтероэндокринные, энтероцитов, пучок и M клетки мигрируют вверх к поверхности просвета, где они обеспечивают различные абсорбирующие и регулирующие функции, однако, клетки Paneth остается на дне крипты, где они существуют приобщены с ISCS. В последние годы было показано, что доля наивного daughtER клетки, предназначенные для секреторной линии находятся в состоянии покоя этикетки сохраняя Lgr5 LO клетки, способные возвращаясь к ISC после повреждения 6,7.

Из-за его важности в склепе регенерации приоритетом был сделан на понимание взаимодействия между ISCS и его соседями, в частности клеток Paneth. Клетки Paneth играть решающую роль в нише, которая поддерживает ISCS 8. В дополнение к бактерицидных продуктов клетки Paneth производить сигнальных молекул, которые активируют в пути, которые регулируют обновление ISC или дифференциации. Предыдущие исследования показали, что Lgr5 + ISCs может существовать только тогда, когда они могли бы конкурировать за существенных сигналов ниши, предусмотренных в их дочерних клеток Paneth 8. Эти исследования изучали роль Paneth клеток на нормальные Lgr5 + ISCs, а не в ситуации, когда они повреждены и требуют пополнения из популяции Lgr5 Ло.

9,10. Часто эти модели используют CRE-LOX технологии условно изменить ген (ы) 9,10. Cre (Причины рекомбинации) рекомбиназа является конкретного участка рекомбиназа семейства интегразы, выделенные из бактериофага Р1. Cre катализирует сайт-специфическое рекомбинации между определенной 34 ВР Lox P '(локус χ кроссоверов P1) сайтов. Мыши генной инженерии, чтобы содержать LoxP сайты, которые фланкируют регионы интерес, который при экспрессии Cre рекомбиназой вырезали. Связывание экспрессию гена Cre к клетке или развития конкретного промотора позволяет изменение быть сделаны в пространственном моды 9,10, это особенно полезно в преодолении эмбриональных летальных мутаций. Кроме того связывая выражение Cre в пути рецептора,который может быть активирован искусственно, позволяет временные изменения.

Используя эту технологию, мы инактивируется ген CatnB 11 в кишечных эпителиев. β-катенин, продукт гена CatnB, является ключевым регулятором канонической Wnt сигнального пути, который регулирует гомеостаз ISC. Две предыдущие исследования с использованием этой стратегии противоречивые результаты 12,13. Изучение ЕФЖДТП и др. 12, показали, потерю стволовых клеток и кишечного гомеостаза. В то время как Ирландии и др. 14 исследование показало, что после снижения жизнеспособности клеток ось Crypt-ворсинок был заселен из клеток дикого типа, экспрессирующих CatnB. Основное различие в этих исследованиях было промотор используется, чтобы выразить Cre в эпителии кишечника. ЕФЖДТП и др., Исследования использовались промотор гена в виллин связанный с рецептором эстрогена, который может быть активирован путем введения тamoxifen (пос-Cre-ER Т2) 15,16. В отличие Ireland и др., Использовали промотор элемент крысиного цитохрома P450A1 (CYP1A1) гена для управления экспрессией Cre в ответ на ксенобиотиков бета-naphthoflavone (А-CRE). Характеристики этих различных систем генерируется две гипотезы для объяснения этих различных наблюдений. Первое, что CatnB более эффективно удалены в ISC использованием системы T2 Виль-Cre-ER по сравнению с Ай-CRE, тем самым уменьшая количество ISCS до уровней суб-Репопуляции. В качестве альтернативы это было связано с дифференциальным CatnB удаление в дифференцированном клеточной популяции. Система Т2 пос-Cre-ER цели все эпителиальные клетки склепе и ворсинки, тогда как системы А-CRE цели только не-Панетом клетки ниши ISC и склепа. Эти системы при условии, идеальные инструменты для изучения Behavдение в ISCs и их взаимодействие с клетками Paneth. Здесь мы представляем несколько подробных протоколов, основанных на том, как мы использовали эти системы, чтобы определить, что Paneth клетки играют ключевую роль в посредничестве кишечного ответ на повреждение 17.

Protocol

Информация о всех материалов, используемых приведены в таблице 1. Все эксперименты на животных проводили под руководством лицензии проекта внутренних дел Великобритании.

1. Удаление с помощью CatnB AH-CRE и Вил-CRE-ER T2 системы

  1. Крест штаммов мышей, чтобы генерировать 10 - 14 неделя старый когорты Ай-CRE + CatnB + / +, А-CRE + CatnB Flox / Flox, пос-Cre-ER Т2 CatnB + / + и пос-Cre-ER Т2 CatnB Flox / Flox. Для визуального анализа рекомбинации, через бета-Gal пятно когорты должна содержать репортер Rosa26R-LacZ 17. Когорты должны контролировать наличие измененными генами и использования индукционных агентов, размер когорты, необходимых следует оценивать с помощью анализа мощности.
  2. Для индукции Ах-CRE трансген подготовить β; -Naphthoflavone (БНФ), или для пос-Cre-ER T2 трансгена тамоксифен (ТАМ) в кукурузном масле, чтобы дать рабочий раствор 10 мг / мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Агенты должны быть взвешены в вытяжном шкафу с использованием соответствующего средства индивидуальной защиты.
  3. Тепловые решения в янтарном бутылки (БНФ является светочувствительным) в любом 99,9 ° С в течение БНФ или 80 ° С в течение ТАМ в водяной бане.
  4. Переход к нагретой мешалкой, установленной на 100 ° С в течение БНФ, или 80 ° С в течение ТАМ, и перемешивают в течение 10 мин.
  5. Для БНФ повторить 1,3-1,4 до растворения (может занять> 1 ч).
  6. Алиготе в небольшие непрозрачные бутылки (~ 5 мл) и затем заморозить при температуре -20 ° С. Бутылки должны быть уничтожены после 3 циклов замораживания / оттаивания. Перед использованием оттаивания агентов и разогреть до соответствующей температуры, если они выпали из раствора. Позволить охладиться до <37 ° С до инъекции.
  7. Внедрить мышей внутрибрюшинно (IP) в дозе 80 мг / кг, например, 25 г мыши получает 0,2 мл appropетел агент индукции. Для Ай-CRE поставить три инъекции в 24 ч периода для пос-Cre-ER T2 дать одну инъекцию в день в течение 4 дней.

2. Препарирование кишечнике Reporter Визуализация и иммуногистохимии (IHC)

  1. Эвтаназии мыши, используя шейки дислокации без предварительного обезболивания в соответствии с этическими утверждения. Поместите мышь в лежачем положении и влажный мех используя 70% этанола, открыть внутри брюшной полости в продольном направлении вдоль средней линии с помощью ножниц.
  2. Безопасный желудок щипцами и разорвать соединение с пищевода. Удалить тонкую кишку до приложении, осторожно потянув на животе. Снимите толстую кишку до ануса, осторожно потянув приложении.
  3. После того, как кишечник были выделены убрать живот и аппендикс. Флеш кишечник с помощью PBS 1x шприц с тупыми пипетки. ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый кишечник должен быть яmmediately обрабатываются для одного из последующих применений, описанных ниже.

3. Фиксация в формалине кишечника

  1. Вырезать покрасневшее кишечник на 3 равные по размеру секции и этикетки проксимальных, средних и дистальных. Разрежьте каждый раздел в 1 см кусочки. Возьмите небольшую полоску хирургической лентой 2 см х 2 см. Поместите три-пять 1 см кусочки на середине хирургической лентой в пласте пирамиды.
  2. Закрыть и опечатать ленту вокруг частей продольно, чтобы дать "Журнал куча" эффект. Поместите ткань в плоскодонных контейнер, содержащий большой избыток формалин в нейтральном буфере фиксатора, по крайней мере, в 10 раз объем фиксатором к объему ткани. ПРИМЕЧАНИЕ: Не устанавливайте избыточных количеств ткани внутри трубки для фиксации, разделить его на несколько контейнеров.
  3. Образцы место на 4 ° С в течение, по крайней мере 18 - 24 часов до до встраивания и секционирования. Чтобы предотвратить потерю ядерного -катенина, не исправить за 24 часа.После передачи фиксации ткани к плоским дном контейнера, содержащего большой избыток 70% этанола, по крайней мере, в 10 раз объем ткани.

4. Methacarn Фиксация кишки

  1. Перед вскрытием подготовки methacarn фиксатором путем объединения 300 мл MeOH, 150 мл хлороформа и 75 мл ледяной уксусной кислоты (4: 2: 1). Вырезать покрасневшее кишечник на 3 равные по размеру секции проксимальных, средних и дистальных.
  2. Поместите каждый кусок кишечника бок о бок на кусок фильтровальной бумаги (15 см x15 см) и с помощью ножниц springbow открыть его "фас". Поместите кишечник и фильтровальную бумагу в стеклянную посуду, содержащую methacarn в течение 3 - 24 ч при комнатной температуре. После фиксации подобрать конец кишечника секции, используя пинцет.
  3. Ветер кишечник вокруг щипцов, чтобы сформировать "рулет" и закрепить рулон слегка приоткрывая щипцы и положить 25 иглу G через него. Поместите ткань в плоскодонных контейнер, содержащий а-ляRGE избыток формалин в нейтральном буфере фиксатора, по крайней мере, в 10 раз объем фиксатора объему ткани и магазина, по крайней мере 1 часа до проведения обработки.

5. Всего горе LacZ Визуализация (модифицированный Эль Marjou др. 18)

  1. Подготовка восковых пластин путем объединения расплавленного ralwax с минеральным маслом в 10: 1. Налейте в 15 см чашки Петри и дать остыть. Подготовьте X-Gal фиксатором в соответствии с таблицей 1 и хранить на льду.
  2. Удалить весь кишечник и промойте через ледяным PBS 1x, как указано в разделе 2. Fix кишечника путем промывки 25 мл ледяной X-гал фиксатором.
  3. Использование ножниц вырезать кишечник в 3 - 5 равных частей (максимум 5 за тарелку). Поместите каждую секцию на восковой табличке и придавить каждый конец так секция слегка растягивается с брыжеечной линии самой верхней; отделка излишки брыжейки. Использование springbow ножницы сократить кишку в продольном направлении и закрепить вдоль пути.60;
  4. Flood пластину с X-Gal фиксатором для покрытия секции и оставить, по крайней мере 1 ч при 4 ° С. Удалить X-Gal фиксатор с помощью 25 мл пипетки и мыть один раз 30 мл 1x PBS. Обложка секции с 30 мл DTT demucifying решения в течение 30 - 60 мин при комнатной температуре, в идеале на качающейся платформе.
  5. Удалить demucifiying решение с использованием 25 мл пипетки и залить плиту 30 мл 1x PBS. Использование пипетки Пастера мыть разделы кишечника с 1x PBS в тарелку, чтобы удалить слизь.
  6. Удалить 1X PBS с пипеткой 25 мл и наводнения с 30 мл X-Gal пятна. Выдержите в течение ночи при комнатной температуре в темноте при легком помешивании на качающейся платформе.
  7. После ночной инкубации проверки, что секции разработали синий / зеленый краситель, если цвет фона по-прежнему белый, могут быть добавлены и контролируется до окрашивание развивается свежий раствор окрашивание. ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как участки запятнал то никаких дальнейших окрашивание не может быть предпринято.
  8. Снимите X-гал пятнос использованием 25 мл пипетки и наводнений пластину 30 мл 1x PBS и оставить на 3 мин при легком помешивании. Удалить булавки и забрать, щипцами, конец секции кишечника. Ветер кишечник вокруг щипцов, чтобы сформировать "рулет", закрепите рулон слегка приоткрывая щипцы и положить 25 иглу G через него.
  9. Поместите ткань в широком ртом плоским дном контейнера, содержащего большой избыток формалин в нейтральном буфере фиксатора, по меньшей мере, в 10 раз объем фиксатора объему ткани. Образцы место на 4 ° С в течение не менее 24 часов до до встраивания и секционирования.

6. Добыча гробницы из кишечника

  1. Изолировать первые 20 см тонкой кишки, как указано в разделе 2. Место кишечник на чистую поверхность и с помощью рассекает пинцетом и ножницами удалить все установленные жира / брыжейки. Использование springbow ножницы открыть кишку в продольном направлении.
  2. Использование микроскопа крышку слайд, Firmly очистить просвет кишечника удалить ворсинки и слизь. Использование ножницы сократить кишечника в ~ 5 мм кусочки и передать в 50 мл пробирку 25 мл HBSS 1x, с добавлением пенициллина (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 ед / мл).
  3. Инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Выньте носители, содержащие антибиотик, передавая образцы через ячейки сетчатого фильтра 70 мкм.
  4. Поместите кишечных секции в свежем 50 мл пробирку, содержащую 10 мл HBSS 1x и заменить крышку.
  5. Аккуратно инвертировать дважды и удалить 1x HBSS при прохождении через сетчатый фильтр 70 мкм клеток. Кроме того мыть кишечника штук, повторяя 6,4 & 6,5 три раза и убедитесь, что последняя фракция относительно ясно.
  6. Передача ткани в свежую пробирку на 50 мл, содержащую 10 мл ЭДТА (8 мм) / 1x HBSS и оставьте при комнатной температуре в течение 5 мин. Встряхивать (20 - 30x) или вихрь, проходят через 70 мкм ячейки фильтра и передачи ткани куски на свежую 50 мл пробирку, содержащую ЭДТА (8 мм) / 1x HBSS. ПРИМЕЧАНИЕ:Поток через можно либо выбросить, или сохранить, если анализ ворсинок эпителия требуется.
  7. Инкубируйте ткани куски на льду в течение 30 мин, встряхните образец энергично (20 - 30x) или вихрь. Передайте образцы через 70 мкм ячейки фильтра и сохранить поток через это, как содержит крипты.
  8. Передача ткани куски на свежую 50 мл пробирку, содержащую 10 мл 1х HBSS. Встряхивать (20 - 30x) или вихрь, проходят через ячейки сетчатого фильтра 70 мкм и сохранить поток через. Повторите еще раз, чтобы обеспечить максимальную восстановление крипт кишечника от части. Смешайте потока через фракций и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин. Слейте надосадочную и сохранить склепа осадок. ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы можно использовать сразу для культивирования (если применимо) или храниться при -80 ° C до стандартных процедур извлечения ДНК / РНК / белка.

7. Стандартный Иммуногистохимический Визуализация

  1. Вырезать 5 мкмм разделы парафин ткани на поли-L-лизина (PLL) слайдов. Примечание: Стандартный протокол для окрашивания с Б-катенина антитела приведены ниже, параметры других антител, приведены в таблице 2.
  2. Де-воск с 2x 3 мин моет в слайд ваннах, содержащих свежий ксилол. Увлажняет путем передачи слайдов в течение 3 мин через слайд ваннах, содержащих свежие: 100% EtOH (2 раза), 95% этанола и 70% этанола и, наконец, 1x PBS.
  3. Место слайдов в слайд ванну, содержащую цитратный буфер (рН 6) и тепла 99,9 ° С в течение 20 мин, чтобы получить антигенов. Разрешить слайды для охлаждения, а затем вымыть 3x 5 мин в режиме слайд-ванне, содержащей 1xTBS / T в течение 5 мин. Удалить слайды из последней промывки, немедленно привлечь около ткани с PAP пера, и охватывают участок с коммерческой блока пероксидазы или 1,5% H 2 O 2 (в дистиллированной H 2 O).
  4. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре (RT) затем промыть 3 раза в слайд ваннах, содержащих свежие 1x TBS / T в течение 5 мин. После мытьяIng крышки секции, с помощью пипетки, в 5% нормальной кроличьей сывороткой (NRS) / 1xTBS / T в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы блокировать неспецифические гидрофобное связывание вашего первичного антитела.
    1. Удалить NRS блок с пипетки и крышка секции Пастера в B-катенин первичного антитела, разбавленного 1: 200 с 5% ЯРБ. Вымойте слайды для 3-кратным 5 мин в слайд ваннах, содержащих свежие 1xTBS / T. Примечание - другие антитела требуют оптимизации для разбавления и специфичности. Чтобы обеспечить специфичность антитела, соответствующие не антител и изотипа пятна управления не должны быть выполнены. Контроля изотипа согласован с принимающими видов и изотипа вашего первичного антитела.
  5. Визуализация либо коммерческого набора обнаружения HRP или с соответствующим флуоресцентно-меченного вторичного антитела (таблица 2). ПРИМЕЧАНИЕ: Длина развития различается для каждого антитела, для -катенина 10 - 15 сек, как правило, достаточно. Для оптимизации развития для антител первого ESTablish длина времени, необходимого для визуализации положительных клеток с использованием положительного контроля слайд, а затем применить это всех последующих слайдов.
  6. Вымойте слайды для 3-кратным 5 мин в слайд ваннах, содержащих свежие TBS / T. Контрастное слайды, погружая в ванну, содержащую слайд гематоксилином за ~ 45 сек (не требуется при использовании флуоресцентно меченных вторичных антител). Поместите слайды в чистую слайд бане и промыть проточной водопроводной водой в течение ~ 1 мин, обеспечивая гематоксилином не полностью вымывается.
  7. Высушить слайды, проходя через слайд ванны, содержащие возрастающие концентрации спиртов; 1x 30 сек в 70% этанола, 1x 30 сек в 95% этанола, 30 сек 2x моет в 100% этанола, 2x 2 мин в ксилоле.
  8. Гора скользит под покровное с использованием коммерческого монтажа средств массовой информации. ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании флуоресцентно меченые антитела крепление с средах, содержащих DAPI маркировать ядро.

8. Гистологическое определение конкретных Intestinaл эпителиальных клеток

  1. Энтероцитов
    1. Подготовка разделов с использованием раздел 7 с виллин антитела и условий, описанных в таблице 2.
  2. Entero-эндокринные клетки (Grimelius пятно 18,19).
    1. Подготовка разделов по следующей схеме 7,1-7,2. Вымойте слайды в режиме слайд-ванне, содержащей воду для особо чистой 3 мин. Передача слайды в слайд ванне, содержащей предварительно нагретой раствор серебра (таблица 1) и инкубировать при 60 ° С в течение 3 ч.
    2. Удалить слайды из раствора серебра и поместить в ванну, содержащую слайд свежеприготовленный раствор нагретого редуктор (таблица 2) при 45 ° С в течение 3 мин. Удалить слайды и поместить в ванну, содержащую слайд свежий сверхчистой воды в течение 3 мин. Последующие шаги из раздела 7,6-7,8 7.
  3. Бокаловидных клеток (Альциановый синевы).
    1. Подготовка разделов по следующей схеме 7,1-7,2 .. слайды перевод в слайд-ванне, содержащей альциановым BlUE рН 2,5 в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить альциановым синий пятно с пипетки и место слайд ванной под струей воды в течение 3 - 5 мин. Выполните шаги 7,6-7,8. Примечание: Альциановый синий раствор может быть сохранен для дальнейшего использования.
  4. ISCs.
    1. Чтобы определить ISCs следовать раздел 9.
  5. Paneth клетки.
    1. Подготовьте секции следующие секции 7 с использованием лизоцима антитела и условий, описанных в таблице 2.

9. В Ситу обнаружения РНК с мышиной кишечника 19-21

  1. Поместите 5 мкм разделы из фиксированных формалином кишечника (раздел 3) на PLL слайдов. Подготовьте линеаризованной дигоксигенином меченой РНК зонд для обнаружения Olfm4 выражение 21. Депарафинизации и увлажняет разделы как указано в разделе 7. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен быть выполнен в условиях свободного РНКазы для предотвращения деградации РНК зонда.
  2. Нарисуйте вокруг тВопрос с PAP пера, чтобы минимизировать реагентов. Выдержите разделы в режиме слайд-ванной с 6% H 2 O 2 (в дистиллированной H 2 O) в течение 30 мин. Вымойте дважды в слайд-ванной с пресной 1x PBS в течение 3 мин. Отменить 1X PBS, и, с помощью пипетки, включает раздел 4% параформальдегидом в течение 20 мин на льду.
  3. Вымойте дважды в слайд-ванной с пресной 1x PBS в течение 3 мин. С помощью пипетки крышки секции с протеиназы К решению в течение 5 мин стирка в режиме слайд-ванной с пресной 1x PBS в течение 3 мин. С помощью пипетки разделы пост-Fix, покрывая в 4% параформальдегида в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Стирать в слайд-ванной с DEPC лечение H 2 0 2 мин. С помощью пипетки крышки секции в уксусной раствору ангидрида в течение 10 мин при перемешивании. Промыть в слайд бане со свежим PBS / 1x 3 мин, с последующим 1x физиологический раствор / 3 мин. Pass слайды через ванны, содержащие возрастающие концентрации спиртов; 1x 30 сек в 70% этанола, 1x 30 сек в 95% этанола, 30 сек 2x моет в свежем 100% этанола,2x 2 мин в свежем ксилола и дайте высохнуть на воздухе.
  5. Развести Olfm4 зонд 1: 100 в буфере для гибридизации и денатурации зонда при нагревании до 80 ° C в течение 3 мин. Применить 100 мкл зонда к каждому разделу и накрыть парафильмом, чтобы предотвратить обезвоживание слайда. Выдержите в течение ночи в темном, влажной камере при 65 ° С.
  6. Стирать в слайд-ванной с 5 × SSC при 65 ° С в течение 15 мин. Промыть секции в слайд-ванны дважды свежей 50% формамида / 5 х SSC / 1% SDS в течение 30 мин при 65 ° С. Вымойте разделы дважды в слайд-ванной на свежем PBT в течение 10 мин, первый в 65 ° С, а второй при комнатной температуре. С помощью пипетки крышки секции с ПБТ, содержащего 25 мкг РНКазы в течение 45 мин при 37 ° С. Промыть секции в слайд-ванны в PBT в течение 5 мин при комнатной температуре.
  7. Промыть секции в слайд-ванны дважды свежей 50% формамида / 5 х SSC в течение 30 мин при 65 ° С. Чтобы заблокировать, крышка секции с помощью пипетки с 10% овечьей сыворотки в PBT и хранить в темном, МВДул камера при комнатной температуре в течение 2 - 3 ч.
  8. Подготовьте антитела путем разбавления анти-щелочная фосфатаза дигоксигенин конъюгированного антитела при 1: 500 с 10% овечьей сыворотки в PBT, содержащий 5 мг / мл мыши кишечного порошок. Инкубируют в течение 3 часов при 4 ° С в темное на качающейся платформе. Спин вниз, чтобы удалить лишнюю кишечную порошок и добавить 3x объемы 1% овечьей сыворотки в PBT на супернатанта.
  9. Удалить блок из слайдов с помощью пипетки и добавить 100 мкл раствора антител к каждому разделу, накрыть парафильмом и инкубировать в темноте, влажной камере при 4 ° С в течение ночи. Вымойте секций в слайд-ванной 3 × свежей PBT в течение 5 мин. Чтобы заблокировать участки мыть в слайд-ванной 3 × с помощью свежего буфера NTMT в течение 5 мин.
  10. Для визуализации, с помощью пипетки покрыть каждую секцию с БМ фиолетовый и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 24 - 72 часов до тех пор, достаточно сильный цвет не развивается. Вымойте секций в слайд ванной раз в PBT и контрастное погружением в эозином в течение 1 мин. Ремове лишний эозин промывкой секций в виде слайд-ванной под проточной водой в течение 3 - 5 мин. Погрузитесь слайдов в ксилола и дайте высохнуть на воздухе. Установите под покровное с использованием коммерческих средств массовой информации.

10. Гистологическое характеристика кишечных эпителиев

  1. Поместите 5 мкм разделы из фиксированной ткани (раздел 3 и 4) на PLL слайдов. Анализ ≥25 случайное целое (или ≥50 половину) крипт от ≥4 мышей каждой группы для каждого из следующих параметров. ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания согласованности проанализировать склепов с таким же адресом каждого кишечника (использовать только ближний конец).
  2. Сотовые параметры из стандартных H & E окрашенных срезов (если не указано иное): Crypt число, высота, апоптоз и митоза.
    1. Печерский номер.
      1. Использование увеличение малой мощности (например, 4X или 10X) вручную подсчитывают количество крипт в контакте с базальным слоем. Граф ≥10 поперечный ближний секту кишечникаионов из по крайней мере 4 мышей.
    2. Печерский высота.
      1. Используйте увеличение высокой мощности (например, 20X или 40X) вручную подсчитывать количество клеток из нижней части склепа в склеп / ворсинок ось (рис 3b).
    3. Апоптоз 22, 23.
      1. Метод 1: Используйте увеличение высокой мощности (например, 20X или 40X.), Чтобы вручную пересчитать количество апоптотических клеток в каждой крипте. Апоптотических клеток могут быть идентифицированы клетки усадки, конденсации хроматина, формирование цитоплазматических пузырьков и апоптозных тел (фиг.3А).
      2. Способ 2: Выполните пятно IHC (раздел 7) каспазы-3 с использованием условий, описанных в таблице 2 Использование увеличения высокой мощности (например, 20X или 40X.) Вручную подсчитать количество положительных клеток в каждой крипте для количественного клеток в. фаза выполнения апоптоза.
    4. Митоз. Используйте увеличение высокой мощности (например, 20X или 40X) вручную посчитать число делящихся клеток в каждой крипте. Митотических клеток содержат сгущенное материал ДНК и, как правило, симметрична и хорошо сформированы (рис 3b).
  3. Распространение.
    1. Выполнение IHC (раздел 7) пятно на Ки-67 с использованием условий, описанных в таблице 2. Вручную рассчитывать положительных клеток для количественной доли клеток крипт пролиферирующих.

Representative Results

Сравнивая ISC Рекомбинация эффективности в Ай-CRE и Vil-CRE-ER T2 системы

Использование этих CRE-LOX систем для оценки роли Paneth клеток, в заселив кишечник после повреждения, необходимую характеристику эффективности рекомбинации в пределах ISCs. Использование условного репортер Rosa26R-LacZ мы показали, что в обеих системах 3 дня после индукции (точек на дюйм) есть ~ 100% рекомбинации в тонком кишечнике (фиг.1а). Количественного присутствия рекомбинированного аллеля по кПЦР смутился различиями в экспрессии Cre моделей между системами. Система Т2 Виль-Cre-ER показали 3,53 кратное увеличение присутствии рекомбинации аллелей по сравнению с системой А-Cre, из-за его экспрессии в большей пропорции epitheli16. Чтобы преодолеть это, мы приняли другую стратегию, которая позволила нам напрямую сравнить системы. Мы индуцированных мышей с различными режимами асинхронных и проанализированы на 30 точек на дюйм, при которой точка LacZ положительные крипты и ворсинки представляют собой рекомбинации событие ISC. Используя этот подход, мы показали, что в обеих системах, 3 инъекции индуцирующего агента (поставляется IP-по 80 мг / кг в 24 ч), объединяется в эквивалентном количестве ISCS несмотря начальных уровней рекомбинации, находящихся намного больше в Виль-CRE-ER T2 Система 16 (1б-г). Кроме того, с помощью ДНК, выделенной из рекомбинантных склепов, КПЦР для рекомбинации аллелей продемонстрировали незначимое увеличение рекомбинации с использованием системы ЭР T2 пос-твор-, потенциально из-за рекомбинации в клетках Paneth не наблюдается с помощью системы А-CRE (На рисунке 1г). Кроме того, окрашивание видов эпителия клеток не сделал индиКейт любое изменение в дифференциации шаблон, представитель образы каждого типа клеток исследуемой показано на рисунке 2e-2Н.

Характеристика кишечной эпителия после CatnB Удаление

Количественная оценка Печерского потери

Характеризуя кинетики рекомбинации в этих системах Cre позволило нам проанализировать кишечник мыши, когда эквивалентные числа ISCs рекомбинируют. Использование репортер LacZ обе системы показали полную потерю рекомбинантных (синих) клеток в 3 точек на дюйм (рис 2а). Как сообщалось ранее через три дня после удаления CatnB AH-CRE мышей показали частичную потерю крипт, в то время как T2 мышей пос-Cre-ER продемонстрировал полное уничтожение склепа / ворсинок оси 13,16,24 (рис 2b-D). Динамика эпителиальных Репопуляции

Используя методы выше мы охарактеризовали несколько параметров позволяют нам понять, это наблюдение. Типичные изображения параметров и типов клеток анализировали с использованием протоколов 7 - 10 приведены в (3а & 3b). Вкратце, потеря крипт согласуется с повышенным уровнем апоптоза, отображаемых в обеих системах (фиг 3e). Однако митоза, пролиферация, крипта сотовой высота, крипта и выражение (не показано) данные показали, система А-CRE мог оправиться, по-видимому из-за заселения ООН-рекомбинации ISCs (3С). В абсолютном сравнения, пос-Cre-ER Т2 удалось восстановить, несмотря на сохранение эпителиальные клетки крипт (рис 3D).

Характеристика Сотовые фенотипов внутри склепа

Чтобы понять, почему склепы из Ах-CRE мышей может заселить в то время как пос-Cre-ER Т2 мы не могли характеризуется эпителиальных клеток через три дня после удаления CatnB. Использование в гибридизация (раздел 9) и IHC анализа (раздел 7, 8 и 10), мы показали, что клетки крипт в пос-Cre-ER Т2 CatnB Flox / Flox мышей непролиферативная и не хватало экспрессии ISC маркера Olfm4 , в отличие от склепов в А-CRE мышей (рис 4в & F). Как начальная характеристика показал, что рекомбинация в склепах было эквивалентно мы исходили изучить роль клеток Paneth. Мы провели двойное флуоресцентные IHC против CatnB и Lyz1 определить, какие клетки потеряли -катенин и были ли они Paneth клетки (рис 5а-5с). Как описано выше, мы Demonstrated, что все клетки крипт ориентированы с помощью системы T2 пос-Cre-ER. В сравнении система А-CRE пощадил клеток Панетом и ворсинок эпителия. Дальнейшие Paneth клетки наблюдается только апоптоза после CatnB удаления с помощью системы T2 пос-Cre-ER (рис 5d и 5e).

фигура 1
Рисунок 1: Сравнение специфичности и эффективности Cre / Lox рекомбинации внутри кишечника эпителия с использованием AH-CRE и Вил-CRE-ER T2 системы (а):. Визуализация Ах-CRE LacZ репортера выражении в Wholemount небольшой (СИ; * дистального конца) и больших (Л.И.; * дистального конца) от дикого типа мыши, (б): Результаты КПЦР изменения показ раза для рекомбинации CatnB Flox аллеля на 1 дюйм, чтобы сравнить различные режимы индукции в А-CRE CatnB Flox / Flox (БНФ индуцированной) и пос-Cre-ER Т2 CatnB Flox / Flox (ТАМ индуцированной ); * Р> 0,05 (Манна-Уитни [2-хвост] по сравнению с контролем). (с) - (е):.. Wholemount тонкой кишки показывая LacZ положительный склепа 30 точек на дюйм панель (б) - (д) редактировался Парри и др 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Сравнение Ай-CRE и Вил-Cre-ER T2 CatnB в эпителии тонкой кишки (а):. Wholemount тонкой кишки показывая потери рекомбинантных клеток в А-CRE CatnB Flox / Flox LacZ + мышей в течение 3 дней. (б): Количественное определение потери крипт через 3 дня после удаления CatnB; * Р> 0,05 (Манна-Уитни [2-хвост] по сравнению с контролем). (с & г): Поперечные H & E секции, фиксированные формалином кишечника, демонстрирующие потерю крипт после CatnB удаления. (е) - (Н) Пример типов клеток из контрольных мышей: (е) энтеро-endocriine клетки, (F) бокаловидных клеток, (г) CatnB IHC что указывает на ISC (→) с ядерной B-катенина и (H) Панет клеток. Панель (б) редактировался Парри и др. 16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

gether.within-страница = "всегда"> Рисунок 3
Рисунок 3: Характеристика наступления фенотипа при использовании Ай-CRE и Вил-CRE-ER T2 системы для условно Удаление CatnB в одинаковое число ISCs в тонкой кишке эпителий (в & B) H & E окрашенных фиксированных формалином разделы, указывающий местонахождение склепа. высота ([), апоптоза (←) и митотический клеток (↓). Количественная оценка среднего числа клеток в склепе между дикого типа (синий) и CatnB Flox (оранжевый) мышей в трех временных точках (точек на дюйм) (C) склепа высоты, (г) митоза и (е) апоптоза (планки погрешностей показывают стандартное отклонение ). Панель (с) - (е) из модифицированной Parry и др 16.3429fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Сравнение характеристик с использованием ISC Ай-CRE и Вил-CRE-ER T2 системы для условно Удаление CatnB в тонком кишечнике Эпителий эпителиальных клеток крипт 3 дня после удаления CatnB использованием AH-CRE (AC) или vil- Cre-ER Т2 (DF) системы. (а & г) Н & Е в разрезе, показывающий области потери склепа; (б & г) Ки-67 ВВК потеря Демонстрация пролиферативных клеток с использованием пос-Cre-ER T2; (с & F) Olfm4 на месте демонстрируя наличие функциональных ISCs использованием Ай-CRE. Панель (а) -. (е) редактировался Парри и др 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Характеристика клеток Paneth после CatnB Удаление с помощью системы Виль-Cre-ER T2 и Ах-CRE (переменного тока):. Иммунофлюоресценции изображения склепов, показывая Панета ячейку (красный), B-катенин (зеленый) и ядра (синий ), стрелка указывают Мембраносвязанные -катенин; (де) IHC для каспазы-3 с указанием апоптоза клеток Панетом отсутствуют в Ай-CRE (г), но присутствует в системе пос-Cre-ER T2 (е). Панель (а) - (е) ​​редактировалсяПарри и др 16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Комплект Immpress HRP Анти-IgG мыши
Ацетат буфер * * Чтобы сделать 100 мл: 4,8 мл 0,2 М уксусной кислоты, 45,2 мл 0,2 М натрий-ацетата 50 мл дистиллированной воды
Уксусная кислота Fisher Scientific С / 0400 / PB17
Уксусный ангидрид Сигма A6404
Раствора уксусной ангидрид * * 2 М уксусным ангидридом в гидрохлорида 0,1 М триэтаноламин
Альциановый Голубой Сигма A5268
Альциановый Голубой рН 2,5 * * Для того, чтобы 500 мл: 15 мл уксусной кислоты, 5 г Альциановый Синий и 485 мл дистиллированной воды
анти-дигоксигенин щелочной фосфатазы конъюгированных антител Abcam ab119345
B (бета-версия) -Naphthoflavone Сигма N3633 БНФ, не позволяя вводить раствор для охлаждения слишком много, как соединение будет выпадать из раствора. Решение может быть использована повторно - хранить при температуре -20 ° С между видами, не подогревать более чем вдвое.
Bloxall Vector Labs SP-6000
БМ фиолетовый Рош 11442074001
БСА Сигма A4503 Бычий сывороточный альбумин
Хлороформ Fisher Scientific С / 4920/17
Цитрат буфер / антиген Разоблачение Решение Vector Labs Н-3300
Кукурузное масло Сигма C8627
Demucifiying решение * * Для 500 мл: 50 мл глицерина, 50 мл 0,1 М Трис pH8.8, 100 мл этанола, 300 мл физиологического раствора (0,9% NaCl в воде), DTT 1,7 г. Demucifying решение может быть сделаны заранее и хранить, но ДТТ sholud быть добавлены непосредственно перед инкубацией (340 мг / 100 мл).
DEPC очищенной воды Life Technologies 750023
DTT Сигма 101509944
ЭДТА Сигма O3690 0,5 М
Спирт этиловый Fisher Scientific E / 0650DF / 17
Фильтровальная бумага Какой мужчина 3000917
Формальдегид Сигма F8775
Формалин Сигма SLBL11382V Обычный буферном растворе формалина
Формамид Сигма F5786
Glutaraldehye Сигма G6257
H 2 O 2 Сигма 216763
Гематоксилин Раймонд ягненка 12698616
ССРХ Гибко 14175-053 ССРХ (-MgCl2 +; -CaCl2)
Гибридизация буфера * * 5 х SSC, 50% формамиде, 5% ДСН, 1 мг / мл гепарина, 1 мг / мл тРНК печени теленка
Гидрохинон Сигма H9003
ImmPACT DAB пероксидазы Vector Labs SK-4105
Vector Labs MP-7402
Immpress HRP Анти-IgG кролика комплект Vector Labs MP-7401
Кишечные порошок ткани * * Тонкий кишечник от 5 взрослых мышей, объединяли и гомогенизировали в минимальном объеме охлажденного льдом PBS. 4 объема ледяной ацетон добавляют к гомогенизированной кишечника, который был тщательно перемешивали и инкубировали на льду в течение 30 мин. Это центрифугируют и осадок промывали холодным ацетоном льда. Это дополнительно центрифугировали и полученный осадок распредел ли на фильтровальной бумаге и дают высохнуть. После высохнуть материал измельчали ​​в тонкий порошок с помощью ступки и пестика.
К-феррицианид Сигма Р-3667
К-ферроцианид Сигма P3289 Левамизол Сигма L0380000
Methacarn * * 60% метанол: 30% хлороформ: 10% уксусной кислоты
Метанол Fisher Scientific М / 4000/17
MgCl2 Сигма M8266
Нормальный сыворотки козы Vector Labs S-1012 NGS
Нормальная сыворотка кролика Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 мМ NaCl, 100 мМ Трис HCl, 50 мМ MgCl2, 0,1% Tween20, 2 мМ левамизол
РАР ручка Вектор Н-400
Параформальдегид Сигма P6148
ПБТ * * 0,5 М NaCl, 10 мМ ТrisHCL рН 7,5, 0,1% Tween 20
Пенициллина / стрептомицина Гибко 15140-122 100x solutiuon.
Забуференный фосфатом физиологический раствор (10x) Fisher Scientific BP3994 Разбавить в соотношении 1:10 дистиллированной водой, чтобы сделать 1x
PLL горки Сигма P0425-72EA Поли-L-лизин предметные стекла
К Протеиназа Сигма P2308
Протеиназы К решение * * Развести протеиназы К при 200 мкг / мл в 50 мМ Трис, 5 мМ EDTA.
Ralwax ВДН 36154 7N
Редуктор Решение * * Для того, чтобы 100 мл: 1 г гидрохинон, 5 г сульфита натрия & 100 мл дистиллированной воды
РНКазы Сигма R6148 </ TD>
Солевой * * 0,9% NaCl в дистиллированной воде
SDS Сигма I3771
Овцы в сыворотке Сигма S3772
Нитрат серебра Сигма S / 1240/46
Серебряный решение * * Для того, чтобы 100 мл: 10 мл ацетатного буфера, 87 мл дистиллированной воды, 3 мл 1% раствора нитрата серебра,
Ацетат натрия Fisher Scientific S / 2120/53
Хлористый натрий Сигма S6753 NaCl
Сульфит натрия Сигма 239321
SSC Сигма 93017 20x цитрат натрия физиологический раствор
Хирургическое ленты Fisher Scientific 12960495
Тамоксифен Сигма T5648 ТАМ, не позволяя вводить раствор для охлаждения слишком много, как соединение будет выпадать из раствора. Решение может быть использована повторно - хранить при температуре -20 ° С между видами, не подогревать более чем вдвое.
TBS / T Сотовый сигнализации # 9997
Гидрохлорид триэтаноламина Сигма T1502
Трис-HCl Invitrogen 15567-027
Tween20 Сигма TP9416
VectaMount Vector Labs Н-5000
Vectashield Hardset монтажа среде с DAPI Vector Labs Н-1500
Vectastain ABC Kit Vectили Labs ПК-4001
X-Gal Promega V3941
X-гал фиксатор * * 2% формальдегида, 0,1% глутарового альдегида в 1xPBS
X-гал пятно * * X-гал пятно; 200 мкл X-Gal (А) в 50 мл раствора В (0,214 г MgCl2, 0,48 г K-феррицианид, 0,734 г K-ферроцианида в 500 мл PBS). Раствор B может быть составлен ойн заранее и хранить при температуре 4 ° С
Ксилол Fisher Scientific Х / 0200/21

Таблица 1: Материалы и методы

d> 1/200, 30 мин при комнатной температуре
Цель бета-катенин Лизоцим Ki67 Каспазы-3 Виллин
Коммерческая источником первичной Ab Transduction Labs Neomarkers Vector Labs R & D Systems Санта Круз
Номер по каталогу 610154 РБ-372 VP-K452 AF835 SC-7672
Первичная Ab вырос в Мышь (МАБ) Кролик (PAB) Мышь (МАБ) Кролик (PAB) Коза (PAB)
Антиген поиска Кипящей водяной бане / цитрат буфер Кипящей водяной бане / цитрат буфер Кипящей водяной бане / цитрат буфер Кипящей водяной бане / цитрат буфер Кипящей водяной бане / цитрат буфер
Пероксидазы блок Bloxall или 2% H 2 O 2, 45 сек Bloxall или 1,5% H 2 O 2, 30 мин Bloxall или 0,5% H 2 O 2, 20 мин Bloxall или 2%H 2 O 2, 45 сек Bloxall или 3% H 2 O 2, 20 мин
Сыворотка блок 1% БСА, 30 мин 10% НГС, 30мин 20% НСП, 20 мин 10% НГС, 45 мин 10% НСП, 30 мин
Промывочный буфер PBS, TBS / T TBS / T PBS, TBS / T
Условия первичного Ab 1/300, 2 ч при комнатной температуре 1/100, 1 час при комнатной температуре 1/50, 1 час при комнатной температуре 1/750, о / п при 4 ° C 1/500, 1 час при комнатной температуре
Вторичный Аб Комплект Immpress HRP Анти-IgG мыши Immpress HRP Анти-IgG кролика комплект Биотинилированных анти-кролик мышь Биотинилированным козьим анти-кролик Биотинилированный Кролик анти-Коза
Условия вторичного Ab 1 ч при комнатной температуре 30мин при комнатной температуре 1/200, 30 мин при комнатной температуре 1/200, 30 мин при комнатной температуре
Усиление сигнала N / A N / A ABC комплект ABC комплект ABC комплект
Сигнал обнаружения ImmPACT DAB пероксидазы ImmPACT DAB пероксидазы ImmPACT DAB пероксидазы ImmPACT DAB пероксидазы ImmPACT DAB пероксидазы
Иммунофлуоресценции антитела Alexafluor 488 Alexafluor 594 N / A N / A N / A
Свойства иммунофлюоресценции Возбуждение Макс 488/525 Макс Излучение Возбуждение Макс 595/617 Макс Излучение
Обычный фильтр Набор FITC Техасский красный
Содержание "> Таблица 2: IHC Антитела и условия

Discussion

Использование условных CRE-LOX трансгенных мышей препарировать функции генов и клеток является широко используемый подход. Эти модели были использованы с большим успехом в кишечнике, чтобы выявить и охарактеризовать стволовые клетки 2,4-6 и понять их роль в развитии болезни 25. Чтобы полностью использовать эти модели требует комплексного характеристику системы для того, чтобы данные, которые будут правильно интерпретированы. Полное понимание этих систем трудно достичь из-за генов, редко специфичны для одиночного типа клеток или месте, отсутствие биологических знаний и неэффективности системы, используемые для индукции экспрессии Cre. Методы, описанные здесь, показывают, как мы можем преодолеть эти проблемы путем экспериментального проектирования и применения имеющихся знаний. Хотя мы использовали эти методы, чтобы ответить на конкретный вопрос исследования методы, представленные здесь, родовой и может эксплуатироваться для любого исследования, расследующей Muriпе кишечник.

Подготовка кишечной ткани

Решающим шагом для обеспечения надежных результатов является сбор и обработка ткани, которая должна быть обработана своевременно и фиксации протоколов строго соблюдаться. Как почти все важные вопросы по потоку можно отнести к артефактам, связанных с тканевой высыхания и / или неполного фиксации. Сроки имеет решающее значение для предотвращения деградации архитектуры ткани и / или нуклеиновых кислот и белков. Неполная или переусердствовали фиксация может привести к потере гистохимической резолюции. Неполное фиксация из-за нехватки времени или разделов слишком толстыми, чтобы проникновение фиксатором может привести к потере резолюции в криптах кишечника, которые можно наблюдать, как "прилива" при анализе IHC. Кроме того важно, что фиксация не распространяется слишком долго, так как ядерная β-катенин может диффундировать из ядра, если только сразу проcessed и воск встроенные следующие фиксации формалином.

Роль Paneth клеток в нише ISC

Данные, представленные здесь, эффективно показать важность Paneth клеток в регенерации крипты в кишечнике взрослого после потери ISC. Однако осталось возможность того, что А-CRE избавляет население ISCs что пос-Cre-ER T2 цели. Тянь др. 26 элегантно продемонстрировали, что привет ISCs Lgr5 заменены населения Lgr5 ло резервных ISCs. Вполне вероятно, что эти ISCs избавлены в системе А-CRE-за резерв населения была определена в качестве секреторной клеток предшественников 6,7. Важность зрелого Панетом ячейки в поддержку этих предшественников секреторных клеток при необходимости вернуться в состояние остается ISC, чтобы ответить. Как Paneth клетки составляют IСК ниши 8 и играть роль в регуляции ответов ISC в 27 калорий и воспаления 28 остается вероятность того, что их функции кормящих будут распространяться на их собственных предшественников.

Новые подходы и технологии для эффективного Модель колоректального рака человека

Открытие ISC привели к идентификации генов, которые в настоящее время используются для генерации новых моделей мыши для исследования роли генов и клеток кишечной биологии и болезней, рассмотрены Кларк и др 9. Единственные ограничения этого метода является выявление генов, экспрессируют белок Cre. В настоящее время исследуются ISCs обычно с помощью условных трансгенных мышей, основанных на шаблоне экспрессии генов Lgr5. Мыши, которые экспрессируют Cre из промотора Lgr5 были использованы для удаления APC, ген обычно мутантный при колоректальном раке (CRC), Что свидетельствует о ISC как клетки происхождения 25. Выборочно удалите другие гены CRC в этих клетках обеспечивает понимание прогрессирования заболевания и распространяться, например,. PTEN 29. Кроме того понимание функции ISC будет его извлечения конкретно абляции Lgr5 -expressing клетки у мышей с использованием человеческого рецептора дифтерийного токсина (DTR) гена постучал в Lgr5 локус 26. Другие стратегии используют систему Тет-O, которая позволяет постоянное обратимое выражение мутантных белков 30. Используя эти инструменты, чтобы изменить ген (ы) в различных клетках 31 и местах 32,33 используется, чтобы понять, как рак инициировать, прогресс и метастазировать 34. В качестве альтернативы мутагенеза с использованием спящего систему красоты транспозонов является выявление новых драйверов КПР. Продолжающееся развитие мышей, методов и стратегий генетических гидротермальных продолжает развивать более терпеливые соответствующих моделей.

Новый мethods были разработаны для характеристики кишечной эпителии и ISCS. Характеристика соотношения эпителиальных типах клеток могут быть достигнуты при использовании проточной цитометрии на основе дифференциальной экспрессии CD24 и лектина 35. Потенциально самый большой прогресс в понимании биологии ISC и их роль в болезни будут сделаны, используя Экс Vivo Органоид систему культуры 36. Эта система позволяет нормальных и злокачественных ISCs в культуре в 3D, где они копируются и дифференцировать в более физиологически соответствующие пути. Он надеялся, что это позволит прямой тестирование препаратов на образцах пациентов в пробирке, прокладывая путь для персонализированной медицины 37.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetate buffer * * To make 100 ml: 4.8 ml 0.2 M Acetic acid, 45.2 ml 0.2 M Sodium acetate & 50 ml distilled water
Acetic acid Fisher Scientific C/0400/PB17
Acetic anhydride Sigma A6404
Acetic anhydride solution * * 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride
Alcian Blue Sigma A5268
Alcian Blue pH 2.5 * * To make 500 ml: 15 ml acetic acid, 5 g Alcian Blue & 485 ml distilled water
anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody Abcam ab119345
B(beta)-Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM purple Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovine serum albumin
Chloroform Fisher Scientific C/4920/17
Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution Vector Labs H-3300
Corn oil Sigma C8627
Demucifiying solution * * For 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml Tris 0.1M pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7 g.  Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340 mg/100 ml).
DEPC treated water Life Technologies 750023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0.5M
Ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17
Filter paper Whatman 3000917
Formaldehyde Sigma F8775
Formalin  Sigma SLBL11382V Neutral buffered formalin
Formamide Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H2O2 Sigma 216763
Haematoxylin Raymond A Lamb 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Hybridisation buffer * *  5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA
Hydroquinone Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105
Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Vector Labs MP-7402
Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit Vector Labs MP-7401
Intestinal tissue powder * * The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 min. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. 
K-ferricyanide Sigma P-3667
K-ferrocyanide Sigma P3289
Levamisole Sigma L0380000
Methacarn * * 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid
Methanol Fisher Scientific M/4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normal goat serum Vector Labs S-1012 NGS
Normal rabbit serum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole
PAP pen Vector H-400
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBT * * 0.5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Phosphate buffered saline (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x
PLL slides Sigma P0425-72EA Poly-L-lysine microscope slides
Proteinase K Sigma P2308
Proteinase k solution * * Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36154 7N
Reducer Solution * * To make 100 ml: 1 g Hydroquinone, 5 g sodium sulphite & 100 ml distilled water
RnaseA Sigma R6148
Saline * * 0.9% NaCl in distilled water
SDS Sigma I3771
Sheep serum Sigma S3772
Silver nitrate Sigma S/1240/46
Silver solution * * To make 100 ml: 10 ml Acetate buffer, 87 ml distilled water, 3 ml 1% silver nitrate
Sodium acetate Fisher Scientific S/2120/53
Sodium Chloride Sigma S6753 NaCl
Sodium sulfite Sigma 239321
SSC Sigma 93017 20x saline sodium citrate
Surgical tape Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
TBS/T Cell Signalling #9997
Triethanolamine hydrochloride Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vector Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fixative * * 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1x PBS
X-gal stain * * X-gal stain; 200 μl X-gal (A) in 50 ml solution B (0.214 g MgCl2, 0.48 g K-ferricyanide, 0.734 g K-ferrocyanide in 500 ml PBS).  Solution B can be made up oin advance and stored at 4 °C
Xylene Fisher Scientific X/0200/21

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).
  2. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  3. Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: http://www.molecularmovies.com/movies/view/96 (2015).
  4. Snippert, H., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  5. Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science. 330 (6005), 822-825 (2010).
  6. Buczacki, S. J., et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).
  7. Basak, O., et al. Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele. EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).
  8. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
  9. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).
  10. Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).
  11. Brault, V., et al. Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development. Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).
  12. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  13. Ireland, H., et al. Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin. Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).
  14. Kemp, R., et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32 (11), e92 (2004).
  15. Madison, B. B., et al. Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine. J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).
  16. Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury. Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).
  17. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
  18. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  19. Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. Essential role of Mash-2 in extraembryonic development. Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).
  20. Gregorieff, A., et al. Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine. Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).
  21. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  22. Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation. Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).
  23. Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine. J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).
  24. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  25. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  26. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  27. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).
  28. Adolph, T. E., et al. Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation. Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).
  29. Marsh, V., et al. Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation. Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).
  30. Jardé, T., et al. In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system. Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).
  31. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  32. Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).
  33. Hinoi, T., et al. Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation. Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).
  34. Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
  35. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).
  36. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  37. van de Wetering, M., et al. Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

Tags

Биология развития выпуск 105 кишка АП-Lox мышь стволовых клеток клеток Панет трансгенная
Протоколы для анализа роли Paneth клеток для регенерации мышиной кишечника с помощью условных<em&gt; Cre-LOX</em&gt; Mouse Модели
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parry, L., Young, M., El Marjou, F., … More

Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models. J. Vis. Exp. (105), e53429, doi:10.3791/53429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter