Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Protokoller for Analysere rolle Paneth Cells i Regenerering muse tarmen ved hjelp Conditional Published: November 21, 2015 doi: 10.3791/53429
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1European Cancer Stem Cell Research Institute, Cardiff University, 2Institut Curie

Summary

Intestinale epitelceller stamceller (ISCS) er blandet med Paneth celler. Disse cellene differensieres avkommet av ISC, som støtter ISCS og gi antibakteriell beskyttelse. Her viser vi hvordan vi brukte transgene betinget musemodeller for å fastslå at Paneth celler spiller en avgjørende rolle i å opprettholde intestinal epitel.

Abstract

Epiteliale overflate av pattedyrtarmen er en dynamisk vev som fornyer hver 3 - 7 dager. Forstå dette fornyelsesprosess identifisert en befolkning på hurtig sykling tarm stamceller (ISCS) preges av deres uttrykk for Lgr5 genet. Disse er støttet av en hvilende stilk cellepopulasjon, preget av BMI-1-ekspresjon, i stand til å erstatte dem i tilfelle av skade. Gransker samspillet mellom disse populasjonene er avgjørende for å forstå sine roller i sykdom og kreft. De ISCS eksistere innenfor krypter på tarmoverflaten, disse nisjene støtte ISC i påfyll av epitel. Samspillet mellom aktive og hvil ISCS sannsynlig involverer andre differensierte celler i nisje, som det har tidligere blitt vist at den '' stemness '' av Lgr5 ISC er nært knyttet til tilstedeværelse av sine nabo Paneth celler. Bruke betinget CRE-lox musmodellene vi testet effekten av å slette de fleste aktive ISCS i nærvær eller fravær av de Paneth cellene. Her beskriver vi de teknikker og analyse gjennomført for å karakterisere tarmen og vise at de Paneth cellene spiller en avgjørende rolle i ISC nisje i å hjelpe restitusjon etter betydelig fornærmelse.

Introduction

Den luminale overflaten av pattedyrtarmen funksjonene repeterende enheter av krypter og fingerlignende fremspring, betegnet villi, som stikker inn i hulrommet. Denne overflaten er en kontinuerlig ark av epitel som gjennomgår fullstendig selvfornyelse ca hver 3 - 4 dager 1. Denne dynamiske vevet understøttes av en populasjon av hurtig sykling stamceller (ISCS, også kjent som krypten basissøyleceller), som opprinnelig ble identifisert ved deres ekspresjon av genet Lgr5 2,3. Disse cellene finnes i en nisje i bunnen av kryptene i Lieberkuhn. I utgangspunktet oppdagelsen at ISCS ble raskt sykling var uharmoniske med den rådende ideen om at en stamcelle var stillestående i naturen. Forut for identifisering av den Lgr5 + ISC ble det postulert at en populasjon av hvilende celler merket beholder ved 4 stillingen, i forhold til bunnen av krypten, var ISCS 1. Nyere forskning hsom nå forsonet disse observasjonene ved å vise at først og fremst er det en pool av ekvipotent sykling ISCS i hvert krypten hvis skjebne er regulert av sine naboer 4,5. I tilfelle er de mistet disse kan erstattes med hvilende celler som vanligvis er forpliktet til sekretorisk avstamning, men kan gå tilbake til ISCS hvis ISC befolkningen er skadet seks.

ISC naboer kan enten være ISCS eller deres datterceller. De ISCS produsere naive datterceller som formerer seg og skille ut de spesialiserte celletyper som utgjør epiteliale ark som linjer intestinal lumen 1. Begeret, enteroendocrine, enterocytter, tuft og M celler migrerer oppover til luminal overflaten der de gir ulike absorberende og regulatoriske funksjoner, men de Paneth celler forblir på bunnen av krypten der de eksisterer blandet med ISCS. I de senere årene har det blitt demonstrert at en andel av den naive daughteh celler skal sendes til et sekretorisk avstamning er hvilende etikett beholde Lgr5 lo celler i stand til å gå tilbake til en ISC på skade 6,7.

På grunn av sin betydning i krypten regenerering en prioritet ble plassert på å forstå samspillet mellom ISCS og dets naboer, spesielt Paneth celler. De Paneth cellene spiller en avgjørende rolle i nisje som støtter ISCS 8. I tillegg til bakteriedrepende produkter de Paneth cellene produserer signalmolekyler som aktiverer trasé som styrer ISC fornyelse eller differensiering. Tidligere studier viste at Lgr5 + ISCS kunne bare eksistere når de kunne konkurrere om viktige nisje signaler gitt av deres datter Paneth celler 8. Disse studiene har undersøkt rollen til Paneth celler på normal Lgr5 + ISCS og ikke i en situasjon der de blir skadet, og krever etterfylling fra en Lgr5 lo befolkning.

9,10. Ofte disse modellene benytter CRE-lox teknologi til betinget endre genet (e) 9,10. Cre (Årsaker rekombinasjon) rekombinase er et stedsspesifikt rekombinase av integrase familie, isolert fra bakteriofag P1. Cre katalyserer stedsspesifikke rekombinasjon mellom definert 34 bp ' Lox P '(locus χ crossover P1) nettsteder. Mus er genetisk konstruert for å inneholde loxP nettsteder som flankerer regioner av interesse som ved uttrykk for Cre recombinase er skåret. Kobling ekspresjon av Cre-genet til en celle eller utviklingsspesifikk promotor gir mulighet for forandring skal gjøres i et romlig måte 9,10, er spesielt nyttig for å overkomme embryoniske dødelige mutasjoner. Videre forbinder Cre uttrykket til en reseptor vei,som kan aktiveres kunstig, tillater tidsmessige endringer.

Ved hjelp av denne teknologien vi inaktivert den CatnB gen 11 i intestinal epitel. β-catenin, den CatnB genproduktet, er en viktig regulator av den kanoniske Wnt signalveien som styrer ISC homeostase. To tidligere studier som bruker denne strategien produsert motstridende resultater 12,13. Studien av Fevr et al. 12, demonstrerte tap av stamceller og tarm homeostase. Mens Irland et al. 14 studien rapportert at etter en reduksjon i celle levedyktighet krypten-villus aksen ble repopulated fra villtype celler som uttrykker CatnB. Den store forskjellen i disse studiene var promoteren som brukes for å uttrykke Cre i intestinal epitel. Den Fevr et al., Studie benyttet villin-gen promotoren forbundet med østrogenreseptoren som kan aktiveres ved å administrere tamoxifen (Vil-Cre-ER T2) 15,16. I motsetning Ireland et al., Benyttet promotorelement av rotte cytokrom P450A1 (CYP1A1) genet for å drive ekspresjonen Cre i respons til xenobiotisk β-naphthoflavone (Ah-cre). Egenskapene til disse forskjellige systemene generert to hypoteser for å redegjøre for disse ulike observasjoner. Den første som CatnB blir mer effektivt fjernet i ISC ved hjelp av Vil-Cre-ER T2 system i forhold til Ah-cre, og dermed redusere antallet ISCS til sub-repopulation nivåer. Alternativt det var grunn til å forskjells CatnB sletting i den differensierte cellepopulasjon. De Vil-Cre-ER T2 system mål alle epitelceller i krypten og villus mens Ah-ere systemet kun er rettet mot de ikke-Paneth cellene i ISC nisje og krypten. Disse systemene gitt ideelle verktøy for å undersøke Behavior av ISCS og deres interaksjon med Paneth celler. Her presenterer vi flere detaljerte protokoller basert på hvordan vi brukte disse systemene til å fastslå at Paneth celler spiller en avgjørende rolle i formidling tarm respons til skade 17.

Protocol

Informasjon om alt materialet som brukes er gitt i tabell 1. Alle dyreforsøk ble utført under myndighet av en britisk hjemmekontor prosjekt lisens.

1. CatnB Sletting hjelp av Ah-ere og Vil-Cre-er T2 Systems

  1. Krysse for å generere 10 musene stammer - 14 uker gamle årskull av Ah-ere + CatnB + / +, Ah-ere + CatnB FLOX / FLOX, Vil-Cre-ER T2 CatnB + / + og Vil-Cre-ER T2 CatnB FLOX / FLOX. For visuell analyse av rekombinasjon, via en β-gal flekken, bør kohorter inneholde Rosa26R-lacZ reporter 17. Kullene bør kontrolleres med henblikk på tilstedeværelse av modifiserte gener og bruken av induksjonsmidler, bør størrelsen av kullene nødvendig beregnes ved hjelp av en kraft-analyse.
  2. Å indusere Ah-ere transgen forberede β; -Naphthoflavone (BNF), eller for den Vil-Cre-ER T2 transgen tamoksifen (TAM) i maisolje for å gi en arbeidsoppløsning på 10 mg / ml. MERK: Agentene skal veies ut i en avtrekkshette ved hjelp av egnet personlig verneutstyr.
  3. Varme løsninger i en gul flaske (BNF er lysfølsomme) til enten 99,9 ° C i BNF eller 80 ° C i TAM i et vannbad.
  4. Overføring til en oppvarmet rører innstilt på 100 ° C i BNF, eller 80 ° C i TAM, og omrør i 10 min.
  5. For BNF gjenta 01.03 til 01.04 til det er oppløst (kan ta> 1 time).
  6. Delmengde i små ravfargede flasker (~ 5 ml) og deretter fryses ved -20 ° C. Flasker skal kastes etter tre fryse / tine sykluser. Før bruk opptiningsmidler og oppvarmer til passende temperatur hvis de har falt ut av løsningen. La det avkjøles til <37 ° C før injeksjon.
  7. Injisere musene intraperitonealt (IP) med en dose på 80 mg / kg, for eksempel en 25 g mus mottar 0,2 ml av den hensiktsmessig induksjon agent. For Ah-ere levere tre injeksjoner i 24-timers periode, for Vil-Cre-ER T2 gi én injeksjon per dag i 4 dager.

2. Disseksjon av tarmen for Reporter Visualisering og Immunhistokjemi (IHC)

  1. Avlive musen med halsdislokasjon uten forutgående bedøvelse i samsvar med etisk godkjenning. Plasser musen i liggende stilling og våt pels bruker 70% EtOH, åpner intra-bukhulen lengderetningen langs midtlinjen ved hjelp av en saks.
  2. Sikre magesekken med en pinsett og bryte forbindelsen til spiserøret. Fjern tynntarmen opp til vedlegget ved å trekke forsiktig på magen. Fjern tykktarmen opp til anus ved å trekke forsiktig vedlegget.
  3. Når tarmen er blitt isolert fjerne magen og vedlegg. Skyll tarmen med 1x PBS ved hjelp av en sprøyte med en stump ended pipettespissen. MERK: Hver tarmen bør være immediately behandlet for en av nedstrøms applikasjoner som er beskrevet nedenfor.

3. Formalin Fiksering av tarmen

  1. Skjær spyles tarmen inn i 3 like store deler og etiketten proksimale, midtre og distale. Skjær hver seksjon i 1 cm biter. Ta en liten stripe av kirurgisk tape 2 cm x 2 cm. Plassere tre til fem 1 cm biter på midten av kirurgisk tape i en pyramide formasjon.
  2. Lukk og feste teipen rundt brikkene langs, for å gi en "log haug" effekt. Plasser vev i en flatbunnet beholder inneholdende et stort overskudd av nøytral bufret formalin fikseringsmiddel, minst 10 x volumet av fikseringsmiddel til volumet av vev. MERK: Unngå å plassere overskytende mengder vev i et rør for fiksering, dele den opp i flere beholdere.
  3. Plasser prøver ved 4 ° C i minst 18-24 timer før innstøping og snitting. For å unngå tap av kjernefysisk β-catenin, ikke reparer utover 24 timer.Etter fiksering overføring vevet til en flatbunnet beholder inneholdende et stort overskudd av 70% EtOH, minst 10 x volumet av vev.

4. Methacarn Fiksering av tarmen

  1. Før disseksjon fremstille methacarn fikseringsmiddel ved å blande 300 ml MeOH, 150 ml kloroform og 75 ml iseddik (4: 2: 1). Skjær spyles tarmen inn i 3 like store deler proksimale, midtre og distale.
  2. Plasser hver del av tarmen ved siden av hverandre på et stykke filterpapir (15 cm x15 cm) og bruke en springbow saks åpne den opp "en face". Plasser tarmen og filterpapiret i en glassskål inneholdende methacarn i 3 - 24 timer ved RT. Etter fiksering plukke opp på slutten av en tarm seksjon ved hjelp av en pinsett.
  3. Vind tarmen rundt tang for å danne en "swiss roll" og sikre roll med litt åpne pinsett og sette en 25 G nål gjennom den. Plasser vev i en flatbunnet beholder som inneholder en large overskudd av nøytral bufret formalin fikseringsmiddel, minst 10 x volumet av fikseringsmiddel til volumet av vev og lagre i minst en time før videre til behandling.

5. Hele Mount LacZ Visualisering (Modifisert fra El Marjou et al. 18)

  1. Forbered voks plater ved å kombinere smeltet ralwax med mineralolje til 10: 1. Hell i 15 cm petriskåler og avkjøl. Forbered X-gal fiksativ som per tabell 1 og lagre på is.
  2. Fjern hele tarmen og spyle gjennom med iskald 1x PBS, som angitt i del 2. Fix tarmen ved å spyle med 25 ml iskald X-gal fiksativ.
  3. Ved hjelp av en saks kutte tarmen inn i 3 - 5 like store deler (maks 5 per plate). Plasser hver seksjon på voks plate og peke ut hver ende slik at delen er litt strukket med mesenteriske linje øverste; trim overflødig mesenterium. Ved hjelp av en springbow saks kutte gut på langs og pin ut underveis.60;
  4. Svømme plate med X-gal fiksativ til å dekke deler og la stå i minst en time ved 4 ° C. Fjern X-gal fikseringsmiddel ved anvendelse av en 25 ml pipette og vask en gang med 30 ml 1 x PBS. Cover seksjoner med 30 ml DTT demucifying løsning for 30 - 60 min ved RT, ideelt sett på en gynge plattform.
  5. Fjern demucifiying oppløsning ved bruk av en 25 ml pipette og oversvømme plate med 30 ml 1 x PBS. Ved hjelp av en pasteur-pipette vaske tarmen seksjoner med 1 x PBS i platen for å fjerne slim.
  6. Fjern PBS 1x med en 25 ml pipette og flom med 30 ml X-gal flekken. Inkuber over natten ved romtemperatur i mørke med forsiktig omrøring på en gyngende plattform.
  7. Etter inkubasjon over natten sjekk at delene har utviklet en blå / grønn flekk, hvis bakgrunnsfargen er fortsatt hvit, kan fersk flekker løsning legges og overvåkes til farging utvikler seg. MERK: Når seksjonene har farget da ikke lenger flekker kan forsøkes.
  8. Fjern det X-gal flekkved bruk av en 25 ml pipette og flom plate med 30 ml 1 x PBS og la stå i 3 min med forsiktig omrøring. Fjern pinner og plukke opp, med pinsett, slutten av en tarm delen. Vind tarmen rundt tang for å danne en "Swiss roll", sikre roll med litt åpne pinsett og sette en 25 G nål gjennom den.
  9. Plasser vev i en bred åpning flatbunnet beholder inneholdende et stort overskudd av nøytral bufret formalin fikseringsmiddel, minst 10 x volumet av fikseringsmiddel til volumet av vev. Plasser prøver ved 4 ° C i minst 24 timer før innebygging og seksjonering.

6. Utvinning av krypter fra tarmen

  1. Isolere de første 20 cm av tynntarmen, som angitt i del 2. Sett tarmen på en ren dissekere overflate og ved hjelp av en pinsett og sakser fjerne eventuelt festet fett / mesenterium. Ved hjelp av en springbow saks åpne gut lengderetningen.
  2. Ved hjelp av et mikroskop deksel slide, firmly skrape tarmkanalen å fjerne villi og slim. Ved hjelp av en saks skjæres tarmen inn ~ 5 mm biter og overfør til et 50 ml rør med 25 ml 1 x HBSS supplert med penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 U / ml).
  3. Inkuber i 10 min ved RT. Fjern antibiotikumet inneholdende medium ved føring av prøvene gjennom en 70 um celle sil.
  4. Plasser tarmavsnitt i en frisk 50 ml tube inneholder 10 ml 1x HBSS og sett på lokket.
  5. Snu to ganger og fjern 1x HBSS ved å passere gjennom en 70 um celle sil. Videre vaske tarm stykker ved å gjenta 6.4 og 6.5-tre ganger, og sikre at det endelige brøkdel er relativt klar.
  6. Overfør vev til en frisk 50 ml rør inneholdende 10 ml av EDTA (8 mM) / 1x HBSS og la ved RT i 5 min. Rist kraftig (20 - 30x) eller vortex, passerer gjennom en 70 mikrometer celle sil og overføre vev stykker til en frisk 50 ml tube inneholder EDTA (8 mm) / 1x HBSS. NOTAT:Strømmen gjennom kan enten kastes eller beholdes hvis analyse av villi epithelia er nødvendig.
  7. Inkuber vev stykker på is i 30 min, ryste prøven kraftig (20 - 30x) eller vortex. Passere prøvene gjennom et 70μm celle sil og beholde flyten gjennom da dette inneholder krypter.
  8. Overfør vev bitene til en frisk 50 ml rør inneholdende 10 ml 1 x HBSS. Rist kraftig (20 - 30x) eller vortex, passerer gjennom en 70 mikrometer celle sil og beholde flyten gjennom. Gjenta en gang til for å sikre maksimal utvinning av krypter fra tarm stykker. Kombiner strømmen gjennom fraksjoner og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter. Hell av supernatanten og beholde krypten pellet. MERK: pellets kan brukes umiddelbart for dyrking (hvis aktuelt) eller lagret ved -80 ° C før standard DNA / RNA / protein utvinning prosedyrer.

7. Standard Immunohistokjemisk Visualisering

  1. Skjær 5 μm deler av parafin innebygd vev på poly-L-lysin (PLL) lysbilder. Merk: En standard protokoll for farging med et B-catenin antistoff er gitt nedenfor, er parametre for andre antistoffer er angitt i tabell 2.
  2. De-voks med 2x 3 min vasker i lysbilde bad som inneholder fersk xylen. Rehydrere ved føring glir i 3 minutter gjennom glide bad som inneholder fersk: 100% EtOH (2x), 95% EtOH og 70% EtOH og til slutt i 1 x PBS.
  3. Plasser glir inn et lysbilde bad inneholdende citrat-buffer (pH 6) og varme 99,9 ° C i 20 min for å hente antigener. Tillat lysbilder avkjøles og deretter vaske 3x 5 min i en lysbilde bad som inneholder 1xTBS / T for 5 min. Fjern lysbilder fra siste vask, umiddelbart trekke rundt vev med en PAP penn, og dekker delen med en kommersiell peroksidase blokk eller 1,5% H 2 O 2 (i destillert H 2 O).
  4. Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur (RT) og deretter vaskes 3x i glide bad inneholdende frisk 1x TBS / T i 5 min. Etter vasking dekselseksjonene, ved hjelp av en pipette, i 5% normalt kaninserum (NRS) / 1xTBS / t i 30 minutter ved RT for å blokkere uspesifikk hydrofob binding av det primære antistoff.
    1. Fjern NRS blokk med en Pasteur pipette og deksel delen i B-catenin primært antistoff fortynnet 1: 200 med 5% NRS. Vask glir for 3x 5 min i lysbilde bad som inneholder ferske 1xTBS / T. Merk - andre antistoffer vil kreve optimalisering for fortynning og spesifisitet. For å sikre spesifisiteten til et antistoff, bør hensiktsmessig ikke antistoff og isotypekontroll flekker utføres. En isotypekontroll er matchet til vertsarter og isotypen av din primære antistoff.
  5. Visualisere med enten et kommersielt HRP deteksjon kit eller med et passende fluorescensmerkede sekundært antistoff (tabell 2). MERK: Lengde på utvikling er forskjellig for hver antistoff, for β-catenin 10 - 15 sek er vanligvis tilstrekkelig. For å optimalisere utvikling for et antistoff første establish hvor lang tid det tar å visualisere positive celler ved hjelp av en positiv kontroll sklie og deretter bruke dette til alle påfølgende lysbilder.
  6. Vask glir for 3x 5 min i lysbilde bad som inneholder fersk TBS / T. Counterstain lysbilder ved å dyppe i en lysbilde bad som inneholder haematoxylin for ~ 45 sek (ikke nødvendig hvis du bruker fluorescensmerkede sekundære antistoffer). Sett lysbilder i en ren lysbilde bad og skyll med rennende vann fra springen for ~ 1 min, sikre haematoxylin er ikke helt vasket ut.
  7. Dehydrere lysbilder ved å passere gjennom glide bad som inneholder økende konsentrasjoner av alkohol; 1x 30 sek i 70% EtOH, 1 x 30 sek i 95% EtOH, 2 x 30 sek vaskinger i 100% EtOH, 2 x 2 min i xylen.
  8. Mount glir under et dekkglass ved hjelp av en kommersiell montering media. MERK: Hvis du bruker fluorescensmerket antistoff montere med et medium som inneholder DAPI å merke kjernen.

8. Histologisk Identifisering av Specific Intestinal Epitelceller

  1. Enterocytter
    1. Forbered delene med § 7 med villin antistoff og betingelser beskrevet i tabell 2.
  2. Entero-endokrine celler (Grimelius flekke 18,19).
    1. Forbered seksjoner ved å følge trinn 7,1-7,2. Vask lysbilder i en lysbilde bad som inneholder ultrarent vann i 3 minutter. Overfør lysbilder på et lysbilde bad inneholdende forvarmet sølvløsning (tabell 1) og inkuber ved 60 ° C i 3 timer.
    2. Fjern lysbilder fra sølv løsning og plass i et lysbilde bad som inneholder nylaget forvarmet redusering løsning (tabell 2) ved 45 ° C i 3 min. Fjern lysbilder og legg inn et lysbilde bad som inneholder frisk ultrarent vann i 3 minutter. Følg trinn 07.06 til 07.08 fra kapittel 7.
  3. Slimceller (Alcian blåved).
    1. Forbered deler av følgende trinn 7,1-7,2 .. Overfør lysbilder til et lysbilde bad som inneholder Alcian Blue pH 2,5 i 5 min ved RT. Fjern Alcian blå flekken med en pipette og sted lysbilde bad under rennende vann i 3 - 5 min. Følg trinn 07.06 til 07.08. MERK: Alcian blå løsning kan beholdes for videre bruk.
  4. ISCS.
    1. Å identifisere de ISCS følge § 9.
  5. Paneth celler.
    1. Forbered seksjoner etter § 7 ved hjelp av lysozym antistoff og betingelser beskrevet i tabell 2.

9. I Situ RNA Detection med Muse Tarm 19-21

  1. Plasser 5 mikrometer seksjoner fra formalinfiksert tarmen (§ 3) på PLL lysbilder. Forbered en linearisert digoxigenin merket RNA probe for deteksjon Olfm4 uttrykk 21. Dewax og rehydrere seksjoner som angitt i del 7. MERK: Denne protokollen bør utføres i et RNAse fritt miljø for å hindre nedbrytning av RNA probe.
  2. Tegne rundt tproblemet med en PAP penn for å minimalisere reagenser. Inkuber seksjoner i et lysbilde bad med 6% H 2 O 2 (i destillert H2O) i 30 min. Vask to ganger i et lysbilde bad med frisk 1x PBS i 3 min. Kast 1x PBS og, ved hjelp av en pipette, kappeavsnitt med 4% paraformaldehyd i 20 minutter på is.
  3. Vask to ganger i et lysbilde bad med frisk 1x PBS i 3 min. Ved hjelp av en pipette dekke deler med proteinase K løsning for 5 min Wash i en lysbilde bad med frisk 1x PBS i 3 min. Bruk en pipette post-fix seksjoner ved å dekke i 4% paraformaldehyde i 5 min ved RT.
  4. Vask i et lysbilde bad med DEPC behandlet H 2 0 2 min. Ved hjelp av en pipette dekselseksjoner i eddiksyreanhydrid løsning i 10 minutter under omrøring. Vask i en bilde bad med frisk 1x PBS / 3 min, etterfulgt av 1 x saltvann / 3 min. Passere glir gjennom bad inneholdende økende konsentrasjoner av alkoholer; 1x 30 sek i 70% EtOH, 1 x 30 sek i 95% EtOH, 2 x 30 sek vaskinger i fersk 100% EtOH,2x 2 min i frisk xylen og la det lufttørke.
  5. Fortynn Olfm4 probe 1: 100 i hybridiseringsbuffer og denaturere probe ved oppvarming til 80 ° C i 3 min. Påfør 100 mL av sonde til hver seksjon og dekk med parafilm for å hindre dehydrering av raset. Inkuber over natten i et mørkt, fuktig kammer ved 65 ° C.
  6. Vask i et lysbilde bad med 5 × SSC ved 65 C i 15 min. Vask seksjoner i et lysbilde bad to ganger med fersk 50% formamid / 5 x SSC / 1% SDS i 30 min ved 65 ° C. Vask to ganger seksjoner i en bilde bad i frisk PBT i 10 minutter, det første ved 65 ° C og den andre ved RT. Ved hjelp av en pipette dekselseksjoner med PBT inneholdende 25 pg RNase i 45 minutter ved 37 ° C. Vask seksjoner i et lysbilde bad i PBT i 5 min ved RT.
  7. Vask seksjoner i et lysbilde bad to ganger med fersk 50% formamid / 5 x SSC i 30 minutter ved 65 ° C. Blokkere, dekke deler ved hjelp av en pipette med 10% sau serum i PBT og butikk i en mørk, moist kammer ved romtemperatur i 2 - 3 timer.
  8. Forbered antistoff ved fortynning av anti-digoksigenin alkalisk fosfatase konjugert antistoff ved 1: 500 med 10% saueserum i PBT inneholdende 5 mg / ml mus intestinal pulver. Inkuber i 3 timer ved 4 ° C i mørke på en gyngende plattform. Spinne ned for å fjerne overskudd av intestinal pulver og tilsett 3 x volum av 1% saueserum i PBT til supernatanten.
  9. Fjerne blokken fra objektglass med en pipette og tilsett 100 pl av antistoffløsningen til hver seksjon, dekk med parafilm og inkuberes i en mørk, fuktig kammer ved 4 ° C over natten. Vask seksjoner i et lysbilde bad 3 × med frisk PBT i 5 min. Å blokkere deler vaske i en lysbilde bad 3 × med frisk NTMT buffer for 5 min.
  10. For å visualisere, ved hjelp av en pipette dekke hver seksjon med BM lilla og inkuberes i mørke ved RT i 24 - 72 timer inntil en tilstrekkelig sterk farge utvikler seg. Vask seksjoner i et lysbilde bad en gang i PBT og farge ved å dyppe i eosin i 1 min. Remove overflødig eosin ved å vaske seksjoner i et lysbilde bad under rennende vann i 3 - 5 min. Fordype lysbilder i xylen og la det lufttørke. Montere under et dekkglass ved hjelp av kommersielle medier.

10. Histologisk Karakterisering av Tarm epitel

  1. Plasser 5 mikrometer seksjoner fra den faste vev (§ 3 & 4) på ​​PLL lysbilder. Analyser ≥25 tilfeldig helhet (eller ≥50 halvdel) krypter fra ≥4 mus i hver årsklasse for hver av følgende parametere. MERK: For å opprettholde konsistens analysere krypter fra samme sted på hver tarmen (bare bruke den proksimale ende).
  2. Cellular parametere fra standard H & E farget seksjoner (hvis ikke annet er oppgitt): Crypt nummer, høyde, apoptose og mitose.
    1. Crypt nummer.
      1. Bruk en lav effekt forstørrelse (f.eks 4X eller 10X) manuelt telle antall krypter i kontakt med basal laget. Telle ≥10 tverr proksimale tarmen sektioner fra minst 4 mus.
    2. Crypt høyde.
      1. Bruk av høy effekt forstørrelse (f.eks 20X eller 40X) for manuelt å telle antall celler fra bunnen av krypten til krypten / villus-aksen (figur 3b).
    3. Apoptose 22, 23.
      1. Metode 1: Bruk en høy effekt forstørrelse (f.eks 20X eller 40X.) For å telle antall apoptotiske celler manuelt i hvert krypten. Apoptotiske celler kan identifiseres ved hjelp av cellekrymping, kromatin kondensering, dannelse av cytoplasmatiske blebs og apoptotiske legemer (Figur 3a).
      2. Metode 2: Utfør en IHC flekk (kapittel 7) for Caspase-3 ved anvendelse av betingelsene beskrevet i tabell 2 ved hjelp av en høy effekt forstørrelse (f.eks 20X eller 40X.) Manuelt å telle antall positive celler i hver krypt å kvantifisere cellene i. gjennomføringsfasen av apoptose.
    4. Mitose. Bruk en høy effekt forstørrelse (f.eks 20X eller 40X) for å telle antallet mitotiske celler manuelt i hvert krypten. Mitotiske celler inneholder kondensert DNA-materiale og er vanligvis symmetrisk og velformede (figur 3b).
  3. Spredning.
    1. Utføre en IHC (kapittel 7) flekk for Ki-67 ved anvendelse av betingelser som er beskrevet i tabell 2. Manuelt teller positive celler for å kvantifisere andelen av krypten celler prolifererer.

Representative Results

Sammenligning ISC rekombinasjon Effektivitet i Ah-ere og Vil-Cre-er T2 Systems

Bruk av disse cre-lox-systemer for evaluering av rollen som Paneth celler, i repopulating tarmen etter skade, kreves karakterisering av effektiviteten av rekombinasjonen i ISCS. Ved hjelp av Rosa26R-lacZ betinget reporter vi demonstrert at i begge systemer 3 dager etter induksjon (dpi) er det ~ 100% rekombinasjon i tynntarmen (Figur 1a). Kvantifisere tilstedeværelsen av den rekombinerte allelet ved qPCR var påvirket av forskjellene i Cre ekspresjonsmønstre mellom systemene. Det Vil-Cre-ER T2 system viste en 3,53 gangers økning i nærvær av den rekombinerte allelet i forhold til Ah-cre system, på grunn av dens ekspresjon i en større del av epithelien 16. For å overvinne dette vi valgt en annen strategi som tillot oss å direkte sammenligne systemene. Vi indusert musene med forskjellige induksjonsregimer og analysert ved 30 dpi, noe som medførte at LacZ positive krypter og villus representerer en ISC rekombinasjon hendelse. Ved å bruke denne tilnærmingen vi demonstrert at i begge systemer, 3 injeksjoner av induserende middel (levert IP ved 80 mg / kg i 24 timer), rekombinert i et tilsvarende antall ISCS tross for innledende rekombinasjon nivå er langt større i Vil-Cre-ER T2 systemet 16 (figur 1 b-d). Videre, ved bruk av DNA ekstrahert fra rekombinerte krypter, qPCR for de rekombinerte lene vist en ikke-signifikant økning i rekombinasjon med Vil-ska ER T2 system, eventuelt på grunn av rekombinasjon i Paneth cellene ikke ble observert ved hjelp av Ah-cre system (Figur 1d). Videre gjorde ikke indi farging for epitel celletypercate noen endring til differensiering mønster, representative bilder av hver celletype undersøkt er vist på figur 2e-2h.

Karakterisering av Intestinal epithelia følgende CatnB sletting

Kvantifisering av Crypt Loss

Karakteriserer kinetikken av rekombinasjon i disse Grobunn systemer gjort oss i stand til å analysere musen tarmen når tilsvarende antall ISCS rekombineres. Bruke LacZ reporter begge systemene viste fullstendig tap av rekombinerte (blå) celler ved tre dpi (figur 2a). Som tidligere rapportert tre dager etter sletting av CatnB de Ah-Cre mus viste delvis krypten tap, mens Vil-Cre-ER T2 mus demonstrerte fullstendig ødeleggelse av krypten / villus aksen 13,16,24 (figur 2b-d). Dynamics of Epithelial repopulation

Bruke teknikkene ovenfor vi karakterisert flere parametere for å gjøre oss i stand til å forstå denne observasjonen. Representative bilder av parametrene og celletyper analysert ved hjelp av protokoller 7 - 10 er gitt i (figur 3a og 3b). I korthet, tap av kryptene var konsistent med forhøyede nivåer av apoptose som vises i begge systemer (figur 3e). Men mitose, proliferasjon, cellulær krypt høyde, krypten og uttrykket (ikke vist) indikerte at Ah-cre system kunne komme seg, antagelig på grunn av repopulation ved un-rekombinert ISCS (figur 3c). I sterk sammenligning mislyktes Vil-Cre-ER T2 å gjenopprette tross beholde epitelceller krypten celler (figur 3d).

Karakterisering av Cellular fenotyper innen Crypt

For å forstå hvorfor krypter fra Ah-Cre mus kunne befolke mens Vil-Cre-ER T2 kunne ikke vi preget epitelcellene tre dager etter sletting av CatnB. Ved hjelp av in situ hybridisering (§ 9) og IHC analyse (§ 7, 8 og 10) har vi vist at krypten cellene i Vil-Cre-ER T2 CatnB FLOX / FLOX mus var non-proliferativ og manglet uttrykk for ISC markør Olfm4 , i motsetning krypter i Ah-Cre mus (Figur 4c & F). Som den første karakterisering hadde vist at rekombinasjon i kryptene var ekvivalent vi satte å undersøke rollen til Paneth cellene. Vi utførte en dual fluorescerende IHC mot CatnB og Lyz1 å identifisere hvilke celler hadde mistet β-catenin og om de var Paneth celler (figur 5a-5c). Som tidligere beskrevet vi demonstrated at alle krypten cellene er målrettet bruker Vil-Cre-ER T2 system. Til sammenligning Ah-ere system spart Paneth cellene og villus epitel. Ytterligere Paneth celler ble bare observert omgår apoptose etter CatnB sletting bruker den Vil-Cre-ER T2-systemet (figur 5d og 5e).

Figur 1
Figur 1: Sammenligning av spesifisitet og effektivitet av Cre / LOX rekombinasjon i tarm epitel ved hjelp av Ah-cre og Vil-Cre-ER T2 Systems (a).: Visualisering av Ah-cre LacZ reporter-ekspresjon i wholemount små (SI; * distal ende) og store (LI; * distal ende) fra en villtype mus. (b): Resultater av qPCR viser ganger endring for rekombinerte CatnB FLOX allel på en dpi å sammenligne ulike induksjonsregimene i Ah-ere CatnB FLOX / FLOX (BNF indusert) og Vil-Cre-ER T2 CatnB FLOX / FLOX (TAM indusert ); * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-tail] sammenlignet med kontroll). (c) - (e):.. Wholemount tynntarmen viser LacZ positive krypten 30 dpi Panel (b) - (e) endret fra Parry et al 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Sammenligning av Ah-ere og Vil-Cre-ER T2 CatnB i tynntarmen epithelia (a). Wholemount tynntarmen som viser tap av rekombinerte celler i Ah-ere CatnB FLOX / FLOX LacZ + mus over 3 dager. (b): Kvantifisering av krypten tap 3 dager etter sletting av CatnB; * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-tail] sammenlignet med kontroll). (c & d): Tverr H & E deler av formalinfiksert tarmen som viser tap av krypter etter CatnB sletting. (e) - (h) Eksempel celletyper fra kontrollmus: (e) entero-endocriine celler, (f) slimceller, (g) CatnB IHC indikerer en ISC (→) med atom B-catenin og (h) Paneth celler. Panel (b) endret fra Parry et al. 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

gether.within-side = "always"> Figur 3
Figur 3: Karakterisering av utbruddet av Fenotype ved bruk av Ah-ere og Vil-Cre-ER T2 Systems for Betinget Slette CatnB i samme Numbers av ISCS i tynntarmen epitel (a & b) H & E beiset formalin faste seksjoner som indikerer plasseringen av krypten. høyde ([), en apoptotisk (←) og mitotiske celle (↓). Kvantifisering av gjennomsnittlig antall celler per krypten mellom villtype (blå) og CatnB FLOX (oransje) mus ved tre tidspunkter (ppt) (c) krypten høyde, (d) mitose og (e) apoptose (feilfelt indikerer standardavvik ). Panel (c) - (e) modifisert fra Parry et al 16.3429fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4:. Sammenligning av ISC Kjennetegn ved hjelp av Ah-ere og Vil-Cre-er T2 Systemer for Betinget Slette CatnB i tynntarmen epithelia Epithelial krypten cellene 3 dager etter sletting av CatnB hjelp av Ah-ere (ac) eller Været Cre-ER T2 (df) system. (a & d) H & E seksjonen viser områder i krypten tap; (b & d) Ki-67 IHC demonstrere tap av proliferative celler ved hjelp Vil-Cre-ER T2; (c & f) Olfm4 in situ demonstrere tilstedeværelse av funksjonelle ISCS bruker Ah-ere. Panel (a.) - (f) endret fra Parry et al 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Karakterisering av Paneth celler etter CatnB Sletting å bruke Vil-Cre-ER T2 og Ah-Grobunn Systems (ac). Immunfluorescens bilder av krypter viser Paneth celle (rød), B-catenin (grønn) og kjernen (blå ), pil indikerer membranbundne β-catenin; (de) IHC for Caspase-3 indikerer apoptotiske Paneth celler er fraværende i Ah-cre (d), men som er tilstede i Vil-Cre-ER T2 system (e). Panel (a) - (e) modifisertParry et al 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit
Acetatbuffer * * For å gjøre 100 ml: 4,8 ml 0,2 M eddiksyre, 45,2 ml 0,2 M natriumacetat og 50 ml destillert vann
Eddiksyre Fisher Scientific C / 0400 / PB17
Eddikanhydrid Sigma A6404
Eddikanhydrid løsning * * 2 M eddiksyreanhydrid i 0,1 M trietanolamin-hydroklorid
Alcian blå Sigma A5268
Alcian Blå PH 2.5 * * For å gjøre 500 ml: 15 ml eddiksyre, 5 g Alcian Blue & 485 ml destillert vann
anti-digoxigenin alkalisk fosfatase konjugert antistoff Abcam ab119345
B (beta) -Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, injisere uten at oppløsningen avkjøles for mye som forbindelsen vil falle ut av løsningen. Løsningen kan brukes på nytt - butikk ved -20 ° C mellom bruker, ikke varme opp mer enn to ganger.
Bloxall Vektor Labs SP-6000
BM lilla Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovint serumalbumin
Kloroform Fisher Scientific C / 4920/17
Sitratbuffer / Antigen avsløre Solution Vektor Labs H-3300
Maisolje Sigma C8627
Demucifiying løsning * * For 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml 0,1 M Tris pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml saltvann (0,9% NaCl i vann), 1,7 g DTT. Demucifying oppløsning kan lages på forhånd og lagres, men DTT sholud tilsettes like før inkubering (340 mg / 100 ml).
DEPC behandlet vann Life Technologies 750023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0,5 M
Etanol Fisher Scientific E / 0650DF / 17
Filter papir Whatman 3000917
Formaldehyd Sigma F8775
Formalin Sigma SLBL11382V Nøytral bufret formalin
Formamidet Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H to O to Sigma 216763
Haematoxylin Raymond A Lamb 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2 +; -CaCl2)
Hybridiseringsbuffer * * 5 x SSC, 50% formamid, 5% SDS, 1 mg / ml heparin, 1 mg / ml kalvelever tRNA
Hydrokinon Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroxidase Vektor Labs SK-4105
Vektor Labs MP-7402
Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit Vektor Labs MP-7401
Tarmvevet pulver * * Tynntarmen av 5 voksne mus ble slått sammen og homogenisert i et minimalt volum av iskald PBS. 4 volumer iskald aceton ble tilsatt til den homogeniserte tarmen, som ble grundig blandet og inkubert på is i 30 min. Denne ble sentrifugert, og pelleten ble vasket ved å bruke iskald aceton. Dette ble ytterligere sentrifugert og den resulterende pellet spredd på filterpapir og fikk tørke. Når tørke materialet ble malt til et fint pulver ved anvendelse av en pistill og morter.
K-ferricyanide Sigma P-3667
K-ferrocyanid Sigma P3289 Levamisole Sigma L0380000
Methacarn * * 60% metanol: 30% kloroform: 10% Eddiksyre
Metanol Fisher Scientific M / 4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normalt geiteserum Vektor Labs S-1012 NGS
Normal kaninserum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 0,1% Tween 20, 2 mM levamisol
PAP penn Vector H-400
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBT * * 0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH 7,5, 0,1% Tween 20
Penicillin / streptomycin Gibco 15140-122 Solutiuon 100x.
Fosfatbufret saltløsning (10x) Fisher Scientific BP3994 Fortynnet 1:10 med destillert vann for å gi 1x
PLL lysbilder Sigma P0425-72EA Poly-L-lysin objektglass
Proteinase K Sigma P2308
Proteinase k løsning * * Fortynn proteinase K ved 200 ug / ml i 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36154 7N
Redusering Solution * * For å gjøre 100 ml: 1 g hydrokinon, 5 g natrium sulfitt og 100 ml destillert vann
RnaseA Sigma R6148 </ td>
Saline * * 0,9% NaCl i destillert vann
SDS Sigma I3771
Sheep serum Sigma S3772
Sølvnitrat Sigma S / 1240-1246
Silver løsning * * For å gjøre 100 ml: 10 ml acetatbuffer, 87 ml destillert vann, 3 ml 1% sølvnitrat
Natriumacetat Fisher Scientific S / 2120/53
Natriumklorid Sigma S6753 NaCl
Natriumsulfit Sigma 239321
SSC Sigma 93017 20x saltvann natriumsitrat
Kirurgisk tape Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, injisere uten at oppløsningen avkjøles for mye som forbindelsen vil falle ut av løsningen. Løsningen kan brukes på nytt - butikk ved -20 ° C mellom bruker, ikke varme opp mer enn to ganger.
TBS / T Cell Signale # 9997
Triethanolaminhydroklorid Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vektor Labs H-5000
Vectashield Hardset montering Medium DAPI Vektor Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vecteller Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fiksativ * * 2% formaldehyd, 0,1% glutaraldehyd i 1XPBS
X-gal flekken * * X-gal flekken; 200 pl X-gal (A) i 50 ml oppløsning B (0,214 g MgCl2, 0,48 g K-ferricyanid, 0,734 g K-ferrocyanid i 500 ml PBS). Løsning B kan gjøres opp oin forhånd og lagret ved 4 ° C
Xylen Fisher Scientific X / 0200/21

Tabell 1: Materialer og Metoder

d> 1/200, 30 minutter ved romtemperatur
Mål beta-catenin Lysozym Ki67 Caspase-3 Villin
Kommersiell kilde til primær Ab Transduksjon Labs Neomarkers Vektor Labs R & D Systems Santa Cruz
Katalognummer 610154 RB-372 VP-K452 AF835 SC-7672
Primær Ab oppvokst i Mouse (mAb) Rabbit (pAb) Mouse (mAb) Rabbit (pAb) Goat (pAb)
Antigen henting Kokende vannbad / Citrate Buffer Kokende vannbad / citratbuffer Kokende vannbad / citratbuffer Kokende vannbad / citratbuffer Kokende vannbad / citratbuffer
Peroksidase blokk Bloxall eller 2% H 2 O 2, 45 sek Bloxall eller 1,5% H 2 O 2, 30 min Bloxall eller 0,5% H 2 O 2, 20 min Bloxall eller 2%H 2 O 2, 45 sek Bloxall eller 3% H-O 2 2, 20 min
Serum blokk 1% BSA, 30 min 10% NGS, 30min 20% NRS, 20 min 10% NGS, 45 min 10% NRS, 30 min
Vaskebuffer PBS TBS / T TBS / T PBS TBS / T
Betingelser for primær Ab 1/300, 2 timer ved RT 1/100, 1t ved RT 1/50, 1t ved RT 1/750, o / n ved 4 ° C 1/500, 1t ved RT
Sekundær Ab Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit Biotinylert kanin anti-mus Biotinylert geite-anti-kanin Biotinylert kanin anti-geit
Betingelser for sekundær Ab 1 time ved RT 30min på RT 1/200, 30 minutter ved romtemperatur 1/200, 30 minutter ved romtemperatur
Signalforsterkning N / A N / A ABC kit ABC kit ABC kit
Signal deteksjon ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase ImmPACT DAB Peroxidase
Immunofluorescence antistoff Alexafluor 488 Alexafluor 594 N / A N / A N / A
Immunfluorescens Properties Eksitasjon Max 488 / Emission Max 525 Eksitasjon Max 595 / Emission Max 617
Felles Filter Set FITC Texas Red
innhold "> Tabell 2: IHC Antistoffer og betingelser

Discussion

Bruke betingelses Cre-lox transgene mus for å dissekere funksjonen til gener og celler er et vanlig tilnærming. Disse modellene har blitt brukt med stor suksess i tarmen for å identifisere og karakterisere stamceller 2,4-6 og forstå sin rolle i sykdoms 25. For å fullt ut utnytte disse modellene krever en omfattende karakterisering av systemet for å muliggjøre at data kan tolkes riktig. En fullstendig forståelse av disse systemene er vanskelig å oppnå på grunn av gener sjelden være spesifikke for en celletype eller enslig sted, mangel på biologisk kunnskap og ineffektivitet av systemene som brukes for å indusere ekspresjon Cre. Metodene som er beskrevet her vise hvordan vi overvinne disse problemene gjennom eksperimentell design og anvendelse av eksisterende kunnskap. Selv om vi brukte disse metodene for å svare på et konkret problemstilling de teknikkene som presenteres her er generiske og kan utnyttes til forskning undersøke Murine tarmen.

Utarbeidelse av tarmvevet

Den avgjørende skritt for å sikre robuste resultater er høsting og foredling av vevet, som trenger å bli behandlet i tide og feste protokoller strengt overholdt. Da nesten alle betydelige problemer nedstrøms kan tilskrives gjenstander i forbindelse med vevet uttørking og / eller ufullstendig fiksering. Timing er avgjørende for å forhindre nedbrytning av vev arkitektur og / eller nukleinsyrer og proteiner. Ufullstendig eller overivrig fiksering kan resultere i tap av histokjemisk oppløsning. Ufullstendig fiksering på grunn av utilstrekkelig tid eller seksjoner for tykke til å tillate fiksativ penetrasjon kan resultere i tap av oppløsning i tarm krypter som kan observeres som en "tidevannet mark" på IHC analyse. Videre er det avgjørende at fiksering ikke strekker seg for lenge, som atom β-catenin kan diffundere ut av kjernen med mindre umiddelbart probearbeides og voks innebygd følgende formalin fiksering.

Rolle Paneth Cells i ISC nisje

Dataene presentert her effektivt å vise betydningen av Paneth celler i krypt regenerering i voksen tarmen følgende ISC tap. Men det forble en mulighet for at Ah-ere deler en befolkning på ISCS at Vil-Cre-ER T2 mål. Tian et al. 26 elegant demonstrert at Lgr5 hi ISCS er erstattet av en befolkning på Lgr5 lo reserve ISCS. Det virker nå sannsynlig at disse ISCS blir spart i Ah-ere system på grunn av reserve befolkningen å ha blitt identifisert som sekretorisk celle forløpere 6,7. Betydningen av det modne Paneth celle i støtte disse sekretoriske celle forløpere når det er nødvendig å gå tilbake til en ISC tilstand gjenstår å bli besvart. Som Paneth celler utgjør den jegSC nisje 8 og spille roller i å regulere ISC svar på kaloriinntaket 27 og betennelse 28 er det fortsatt sannsynlig at deres pleiefunksjoner vil utvide til sine egne forløpere.

Nye tilnærminger og teknologier for å effektivt Modell Menneskelig tykktarmskreft

Oppdagelsen av ISC ført til identifisering av gener som nå blir brukt til å generere nye musemodeller for å undersøke rollene av gener og celler i tarm biologi og sykdom, anmeldt av Clarke et al 9. De eneste begrensninger for denne teknikken er identifisering av gener for å uttrykke proteinet Cre. Foreløpig ISCS blir rutinemessig undersøkt ved hjelp av betinget gene mus basert på Lgr5 genuttrykk mønster. Mus som uttrykker Cre fra Lgr5 promoteren er blitt brukt til å slette APC, genet som oftest mutert i kolorektal cancer (CRC), Demonstrere ISC som cellen opprinnelses 25. Selektivt slette andre CRC gener i disse cellene er å gi innsikt i sykdomsutvikling og spre f.eks. PTEN 29. Ytterligere innsikt i ISC funksjon blir hentet av spesielt ablating Lgr5 -expressing celler i mus ved hjelp av en menneskelig difteritoksin reseptor (DTR) gen slås inn i Lgr5 locus 26. Andre strategier bruker Tet-O system som gjør løpende reversible uttrykk for mutante proteiner 30. Ved hjelp av disse verktøyene for å modifisere genet (er) i forskjellige celler 31 og steder 32,33 brukes til å forstå hvordan kreft initiere, fremdrift og metastasere 34. Alternativt mutagenese bruker den sovende skjønnheten transposonet system er å identifisere nye driverne av CRC. Den videre utviklingen av mus, teknikker og genetisk endring strategier fortsetter å utvikle mer pasient relevante modeller.

Ny methods har blitt utviklet for karakterisering av tarm epithelia og ISCS. Karakterisering av forholdet mellom epiteliale celletyper kan oppnås ved hjelp av strømningscytometri basert på differensiell ekspresjon av lectin og 35 CD24. Potensielt den største fremgangen i forståelse ISC biologi og deres rolle i sykdommen vil bli gjort ved hjelp av ex vivo organoid kultur system 36. Dette systemet gjør at normale og maligne ISCS til kultur i 3D, hvor de replikere og skille i en mer fysiologisk relevant måte. Det er å håpe at disse vil muliggjøre direkte testing av legemidler på pasientprøver in vitro, banet vei for personlig medisin 37.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetate buffer * * To make 100 ml: 4.8 ml 0.2 M Acetic acid, 45.2 ml 0.2 M Sodium acetate & 50 ml distilled water
Acetic acid Fisher Scientific C/0400/PB17
Acetic anhydride Sigma A6404
Acetic anhydride solution * * 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride
Alcian Blue Sigma A5268
Alcian Blue pH 2.5 * * To make 500 ml: 15 ml acetic acid, 5 g Alcian Blue & 485 ml distilled water
anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody Abcam ab119345
B(beta)-Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM purple Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovine serum albumin
Chloroform Fisher Scientific C/4920/17
Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution Vector Labs H-3300
Corn oil Sigma C8627
Demucifiying solution * * For 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml Tris 0.1M pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7 g.  Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340 mg/100 ml).
DEPC treated water Life Technologies 750023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0.5M
Ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17
Filter paper Whatman 3000917
Formaldehyde Sigma F8775
Formalin  Sigma SLBL11382V Neutral buffered formalin
Formamide Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H2O2 Sigma 216763
Haematoxylin Raymond A Lamb 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Hybridisation buffer * *  5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA
Hydroquinone Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105
Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Vector Labs MP-7402
Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit Vector Labs MP-7401
Intestinal tissue powder * * The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 min. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. 
K-ferricyanide Sigma P-3667
K-ferrocyanide Sigma P3289
Levamisole Sigma L0380000
Methacarn * * 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid
Methanol Fisher Scientific M/4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normal goat serum Vector Labs S-1012 NGS
Normal rabbit serum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole
PAP pen Vector H-400
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBT * * 0.5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Phosphate buffered saline (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x
PLL slides Sigma P0425-72EA Poly-L-lysine microscope slides
Proteinase K Sigma P2308
Proteinase k solution * * Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36154 7N
Reducer Solution * * To make 100 ml: 1 g Hydroquinone, 5 g sodium sulphite & 100 ml distilled water
RnaseA Sigma R6148
Saline * * 0.9% NaCl in distilled water
SDS Sigma I3771
Sheep serum Sigma S3772
Silver nitrate Sigma S/1240/46
Silver solution * * To make 100 ml: 10 ml Acetate buffer, 87 ml distilled water, 3 ml 1% silver nitrate
Sodium acetate Fisher Scientific S/2120/53
Sodium Chloride Sigma S6753 NaCl
Sodium sulfite Sigma 239321
SSC Sigma 93017 20x saline sodium citrate
Surgical tape Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
TBS/T Cell Signalling #9997
Triethanolamine hydrochloride Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vector Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fixative * * 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1x PBS
X-gal stain * * X-gal stain; 200 μl X-gal (A) in 50 ml solution B (0.214 g MgCl2, 0.48 g K-ferricyanide, 0.734 g K-ferrocyanide in 500 ml PBS).  Solution B can be made up oin advance and stored at 4 °C
Xylene Fisher Scientific X/0200/21

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).
  2. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  3. Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: http://www.molecularmovies.com/movies/view/96 (2015).
  4. Snippert, H., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  5. Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science. 330 (6005), 822-825 (2010).
  6. Buczacki, S. J., et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).
  7. Basak, O., et al. Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele. EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).
  8. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
  9. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).
  10. Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).
  11. Brault, V., et al. Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development. Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).
  12. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  13. Ireland, H., et al. Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin. Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).
  14. Kemp, R., et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32 (11), e92 (2004).
  15. Madison, B. B., et al. Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine. J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).
  16. Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury. Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).
  17. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
  18. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  19. Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. Essential role of Mash-2 in extraembryonic development. Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).
  20. Gregorieff, A., et al. Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine. Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).
  21. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  22. Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation. Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).
  23. Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine. J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).
  24. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  25. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  26. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  27. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).
  28. Adolph, T. E., et al. Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation. Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).
  29. Marsh, V., et al. Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation. Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).
  30. Jardé, T., et al. In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system. Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).
  31. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  32. Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).
  33. Hinoi, T., et al. Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation. Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).
  34. Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
  35. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).
  36. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  37. van de Wetering, M., et al. Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

Tags

Developmental Biology tarm Cre-Lox mus stamcelle Paneth celle transgen
Protokoller for Analysere rolle Paneth Cells i Regenerering muse tarmen ved hjelp Conditional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Musemodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parry, L., Young, M., El Marjou, F., … More

Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models. J. Vis. Exp. (105), e53429, doi:10.3791/53429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter