Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

doi: 10.3791/53430 Published: January 7, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Fibroblastlar hücre dışı matriks salgılayan sorumlu ilke hücre tipi ve birçok organ ve dokuların kritik bir bileşenidir. Fibroblast fizyolojisi ve patolojisi birden organlarda fibrozların, hipertrofik skar aşağıdaki yanıklar, iskemi sonrası kardiyak fonksiyon kaybı ve kanser stroma oluşumu da dahil olmak üzere klinik kuruluşların, bir spektrum altında yatan. Ancak, fibroblastlar büyük ölçüde kendi içsel heterojenite, hücrenin kötü karakterize tip kalır. Fibroblastlar izolasyonu için mevcut yöntemler derinden hücre fenotipi ve davranışlarını etkileyen hücre kültüründe zaman gerektirir. Sonuç olarak, fibroblast biyoloji araştıran birçok çalışma, in vitro manipülasyon güvenmek ve doğru bir in vivo fibroblast davranışı yakalamak değil. Bu problemin üstesinden gelmek için, preservi böylece, hücre kültürü gerektirmez, yetişkin farelerin dorsal deri fibroblast izolasyonu için bir FACS tabanlı bir protokol geliştirilmiştirfizyolojik transkripsiyonel ve her hücrenin proteomik profili ng. Bizim stratejimiz soy negatif kapısı yoluyla olmayan mezenkimal soy dışlama sağlar (Lin -) oldukça spesifik yüzey belirteçleri ifade fibroblastlar bir alt ön seçim veya zenginleştirme önlemek ve bu heterojen genelinde mümkün olduğunca kapsayıcı olması için pozitif bir seçim stratejisi daha hücre tipi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fibroblastlar sık ​​plastik yüzeylerde uygun iğ biçimli hücreler olarak morfolojik tanımlanır. Fibroblastlar sentezlenmesi ve embriyonik ve yetişkin organlarının 1 hücre dışı matriks remodeling sorumlu ilke hücre tipi vardır. Fibroblastlar memeli gelişme dolayısıyla kritik ve her doku ve organda mevcut hücre tipleri komşu davranışını etkileyen hücre dışı ortamın önemli ölçüde katkıda bulunur.

Fibroblastlar de muazzam bir klinik yükünü neden tıbbi koşullar çeşitli bir kümesi arkasında asıl hücre tipi vardır. Patolojik fibroblast aktivitesinin normal doku işlevini bozar ve deri yara iyileşmesi, ateroskleroz, sistemik skleroz, ve damar yaralanması 2-5 sonra aterom plaklarının oluşumuna aşağıdaki doku ve (örneğin akciğer ve karaciğer gibi), organ fibrozis, skar içerir. Özellikle yara iyileşmesi, hem akut ve kronik, d içerirnormal doku gibi ne benzeyen, ne de işlevleri çevreleyen ve çeşitli patolojik devletler arasında önemli morbidite neden skar dokusunun eposition. Travmalarından sonra, daha sonra, yapısal ECM bileşenleri salgılar hücre tiplerini komşu parakrin etkilere neden ve skar dokusu 6 yatırma mekanik istikrarı sağlamak miyofibroblastlar fibroblastların bir geçiş vardır.

Deri dokularda gelişimsel süre boyunca yara onarım kalitesi ve anatomik siteler arasında önemli varyasyon mevcuttur. Yaşamın ilk iki trimesterde fetüs iz bırakmadan iyileşir; Ancak, üzerinde ve yetişkinlik boyunca üçüncü trimesterde, bir yara ile iyileşir insanlarda. Mevkiye-özgü yaşa özgü ek olarak, yara iyileşmesi farklılıklar vardır. Deri yaraların içinde skar dokusu biriktirme 9 önemli ise ağız boşluğunda yaralar, minimal skar oluşumu 7,8 ile pişmanlık. Münakaşa c devamyaş ve konum 10,11 hem açısından yara iyileşmesi sonucu yerel fibroblast içsel özelliklerinin karşı çevrenin göreceli etkisini oncerning. Deri dermis ve önceki embriyonik (E15) karşı sözlü fare iyileşmesinde önemli farklılıklar göz önüne alındığında vs sonra embriyonik (E18) dermiş, bazı gelişimsel yaşta ve çeşitli anatomik siteler arasında fibroblastların popülasyonlarında içsel farklılıklar var olasıdır .

1986 yılında, Harold F. Dvorak tümörler 12 iyileşmeyen yaralar vardır oturtulması. Dvorak tümörler vücutta yaralar gibi davranırlar ve konağın yanıtını yaranın iyileşme aktive ederek stroma neden olduğu sonucuna varıldı. Çeşitli çalışmalar beri karsinom 13-15 ilerlemesine fibroblastların katkısını araştırdık, ama yara iyileşmesi, kimlik ve deri ca stromal bölmesine katkıda fibroblast embriyonik kökenli olduğu gibircinomas yeterince tanımlanmamıştır. Bu sorunun cevabı, anti-kanser terapisi 16 için potansiyel olarak etkin hedef olarak tümörle ilişkili fibroblast açığa son çalışmalar verilen tıbbi alaka taşımaktadır.

Belirlenmesi ve ileriye dönük in vivo fibrojenik potansiyeli sahip fibroblast soy izole etkin bir akut ve kronik hastalık durumları geniş bir yelpazesinde yaralanma kendi tepkisini manipüle yönelik önemli bir adımdır. 1987 yılında, Cormack papiller ve retiküler dermis 17,18 içinde biri içinde ikamet eden fibroblast iki alt popülasyonlarını bir gösterdi. Üçüncü ICSI'nin follikül 19,20 Dermal papilla bölgedeki saç köklerinin ile ilişkili bulunmuştur. Ne zaman kültür, büyüme potansiyeli, morfoloji ve büyüme faktörü / sitokin bu fibroblast alt tiplerinin sergi farkları 21-24 profilleri.

Bugüne kadar, fibroblast inceleyen çalışmaların oterogeneity ölçüde yeterli in vivo fibroblastlar arasında gelişimsel ve fonksiyonel çeşitlilik karakterize etmek başarısız oldu. Bu, kısmen, kültürlenmiş fibroblast popülasyonları bir güven ve tüm fibroblastlar 25 ile ifade edilen bir kendi kendine yüzey reseptörüne göre hücre kültüründen ya da pozitif bir seçim homojenize etkisinin bir sonucu olduğu. Laboratuarımızda yapılan yeni bir çalışma, derin bir yüzey işaretleyici ve bu yazıda 26 sunulan FACS-bazlı izolasyon metodolojisi ile izole vs kültürlü kültürsüz fibroblast transkripsiyonel vardiya gösterdi.

Daha sonra, kemirgen dorsal dermiş içinde belirli bir fibroblast soy tanımlanmış ve Engrailed-1 embriyonik ekspresyonu ile tanımlanan, bu soy, dorsal, derideki bağ dokusu birikimi için temel olarak sorumlu olduğu tespit edilmiştir. Yara iyileşmesi, kanser stroma oluşumu da dahil olmak üzere fibrozis, akut ve kronik biçimleri boyunca da soy fonksiyonlarıRadyasyon fibrozis 27 uyarılan. Farklı fibroblast soy karakterizasyonu fibrojenik davranışlarını modüle amaçlayan tedaviler için kritik etkileri vardır.

Aksine, hücre izolasyonu 28,29 ulaşmak için in vitro manipülasyon güvenmek mevcut protokolleri kullanarak daha burada ayrıntılı hasat protokolü (Şekil 1) daha doğru in vivo fenotip ve davranışlarını yakalamak fibroblast verimi bilgilendirici analizlerini yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol Laboratuar Hayvanları Bakım Stanford Üniversitesi İdari Heyeti tarafından onaylanan yöntemler izler.

Fare Dermisinde 1. Sindirim

  1. Ketamin 100 mg / kg + ksilazin 20 mg / kg asepromazin + 3 mg / kg karın içinden enjeksiyonu ile anestezi sonra servikal dislokasyon ile fareler öldürülür.
    Not: Çeşitli yaş ve arka kullanılabilir.
  2. Tıraş ve dorsal cilt atmaktadır. Yaklaşık olarak 100,000 hücre sırt derisine bir parça x 100 mm, 60 mm izole edilebilir.
  3. Kuruması için temiz, steril bir yüzey üzerinde% 70 etanol ve yerinde fareyi Batmak.
  4. Hemen steril diseksiyon makas kullanarak dorsal fare cilt hasat. Dişi fareler içinde, meme dokusu da dahil olmak üzere kaçının.
  5. Kuyruk tabanı başlayan çadır kadar cilt için forseps kullanabilir ve üstü fasiyal düzlemi boyunca diseksiyon önce enine kesim yapmak.
  6. Dikkatle hasat sırasında herhangi deri altı yağ içeren kaçınmakcilt. Herhangi bir deri altı yağ için hasat cildi inceleyin ve dikkatli bir neşter künt kenarını kullanarak kazıyın.
  7. Buz üzerinde PBS yıkar 5x ardından Betadin hasat cildi durulayın.
    Not: kirlenmesini önlemek için mümkün olduğunca steril yakın olarak cildi korumak önemlidir.
  8. Jilet kullanarak ve örnek 2-3 mm'lik parçalar ile düzgün bir tutarlılık kadar steril bir tabak içinde makas diseksiyon cilt kıyma.
  9. DMEM içindeki 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda, 50 ml, 20 ml kolajenaz IV ihtiva eden konik tüpler hazırlayın. Tüp başına beş farenin bazında tüplere dermis bölün.
  10. Bir su banyosu ya da fırın ya 1 saat süreyle 37 ° C'de inkübe kuvvetli şekilde örnekleri çalkalayın.
  11. Inkübatör örnekleri çıkarın ve steril bir muhafaza içinde bir iğne 3-5x olmayan bir 10 ml şırınga geçer.
  12. 37 ° C'de inkübatör içinde numuneler ve 30 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır.
  13. Steril bir başlık olarakBir 10 ml pipet kullanarak ve 3-5x aşağı örnekleri pipetle. Yeni 50 ml konik tüp içine 100 mikron filtre örneği pipetle.
  14. Hücre verimi maksimize etmek ve 40 ml toplam hacmi getirmek için, aynı filtre boyunca% 10 FBS DMEM 20 ml geçirin. 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 300 g'de santrifüjleyin.
  15. İlk süpernatant kalan öncesinde üst yağ tabakasını kaldırmak için büyük bir özen, bir steril cam pipet kullanarak süpernatantı.
    Not: Bu adım adiposit kirlenmeyi azaltmak için çok önemlidir.
  16. 20 ml% 10 FBS DMEM pelet yeniden süspanse edin.
  17. 70 mikron filtreden geçirilerek hücre / DMEM süspansiyonu geçirin.
  18. 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 300 g'de 10 mi,% 10 FBS DMEM ile filtre ve santrifüj filtre süspansiyonu çalkalayınız.
  19. Yine ilk kalan yağ tabakası kaldırmak için özen, steril bir cam pipet kullanarak süpernatantı.
  20. Önemli RBC kirlenme varsa (pelet gözle görülür kırmızı), pelet yeniden askıyave 20 ml ACK lizis tamponu içinde, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. Aksi halde 24 adıma atlayın.
  21. FACS tamponu (PBS,% 10 FBS,% 0.1 sodyum azid) içinde eşit bir hacmi (20 mi) ilave edilir, daha sonra karıştırılır ve bir boyanmamış bir kontrol olarak bir kenara 5 ml'lik bir şişe tutun. 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 300 g'da kalan santrifüjleyin.
  22. Süpernatantı ve buz üzerinde pelet koydu. FACS zamanı mevcut değilse, bu noktada hücreler, aşağı dondurulabilir.

FACS Fibroblast 2. izolasyonu

  1. Her pelet için soy antikor inkübasyon karışımı 500 ul olun. CD45 (1: 200), Tie2 (01:50), Ter: İlk bir tübe DNaz (10 ug / ml) ihtiva eden FACS tampon 475 ul ekleyerek ve daha sonra fluorofor-konjuge CD31 (100 1) ilave edilerek, bu fazlası -119 (1: 200) ve EpCAM (1: 100) antikorları her bir antikor için, ilgili seyreltme elde etmek.
  2. Nesilli antikor inkübasyon karışımı 500 ul her bir pelet yeniden askıya ve 20 dakika boyunca buz üzerinde, bu süspansiyon inkübe edilir.
  3. 5 ekleyinörnek DNaz (10 ug / ml) ihtiva eden ve hafifçe karıştırın mi FACS tamponu. 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 300 g'de santrifüjleyin.
  4. Süpernatantı ve adım 26'daki gibi 5 ml FACS DNaz ihtiva eden tampon (10 ug / ml) ve aynı koşullar kullanılarak santrifüj ile hücre pelletini yıkayın.
  5. DNase (10 ug / ml) ihtiva eden 500 ul FACS tampon maddesi içinde pelletini ve canlılığı boya kontrol olarak bir kenara 50 ul tablet koydu.
  6. Seçilen boya için belirtilen konsantrasyonda kalan örnek seçim canlılığı boya ekleyin.
  7. FACS analizi 31 gerçekleştirin ve Canlılık Dye- / CD31 / CD45- / Tie2- / Ter-119- / EpCAM- hücreleri (Şekil 2A) için sıralama. Sıralama doğrudan FACS tampon içine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yaklaşım (Şekil 1) geçerlilik son yayın 27 ayrıntılı incelenebilir şekilde, bir dizi doğrulanmıştır. Bunlar sıralanmış hücreler ve kitle hücre ve taze sıralanmış hücrelerin tek bir hücre transkripsiyonel analizi immünsitokimya içerir. Fibroblastlar Sıralama doğrudan ziyade daha doğru kültürüne dayanarak in vivo fenotip yakalar. Yerine olumlu bir seçim yaklaşımı daha soy negatif tüketme yaklaşımı (Şekil 2A) kullanılarak belirli alt popülasyonlar için ön seçerek önler. Bu yaklaşımın değeri son daha önce tanımlanmayan dermiş bir seviyede CD26 pozitif fibroblastlann varlığının belirlenmesi, Rinkevich ve ark. 27 ile gösterilmiştir.

Kültüre fibroblast süreci gen ifadesinde önemli değişikliklere yol açtığını teyit etmek için, biz kültürsüz fibroblastlar kültüre fibroblast karşılaştırmak için mikrodiziler kullanılır. Biz fibroblastlar kültüreBu iki teknik bu el yazması ve iyi bilinen bir doku eksplantı protokol 28 ayrıntılı olarak canlı hasat protokolü ile izole edildi. Tüm-transcriptome mikroarray analizi canlı hasat (C.LH) tarafından ve doku eksplant ile izole kültür fibroblastlar (C.TE) metodolojileri Pearson çarpım moment korelasyon katsayısının bir transcriptome-çapında (r de yüksek bir benzerlik derecesine sahip olduğunu ortaya koymuştur ) 0.92 (Şekil 2B). Buna karşılık, kültürlü fibroblastlar canlı hasat kültürsüz fibroblastlar (U.LH) önemli ölçüde farklılaşmıştır. U.LH karşı C.TE bir karşılaştırma 0.64 (Şekil 2B), bir r vermiştir ise U.LH karşı C.LH arasında bir karşılaştırma, 0.61 bir r elde edilmiştir. Bu sonuçlar fibroblast kültürlerinde ziyade canlı hasat fibroblastlar analiz önemini ortaya. Bu protokol kullanılarak izole kültürlenmiş ve uncultured fibroblast arasında transkripsiyonel ve proteomik farklar, daha tam bir analiz için, Walmsley <bakınızem> vd. 26

figür 1
Fibroblast İzolasyon Şekil 1. Genel. Bu FACS-bazlı izolasyon protokolü katılan ilköğretim adımların şematik gösterimi. Walmsley izni ile yeniden, GG ve ark. Fibroblast Hasat in vitro. Doku mühendisliği Yüzey Etiket Shift ortaya çıkarır Canlı. Bölüm C, Yöntem, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Flow Sitometri ve Mikroarray Analizi. Propidium iyodür sta dayalı canlı hücreler için tek hücre seçimi (sol arsa), seçimi gösteren (A) FACS yolluk stratejisiining (orta arsa), ve CD31, CD45, Tie2'ye, Ter119 ve EpCAM için soy olumsuzluk temelinde fibroblastlar (sağ arsa) seçimi. (B) Yetiştirme Canlı Hasat karşı terbiye Canlı Hasat (U.LH) arasında Mikrodizin Analizi Yetiştirme Doku Eksplant (C.TE) Fibroblastları karşı (C.LH). U.LH (n = 3), C.LH arasında gen ekspresyonu benzerliği (n = 3) ve C.TE (n = 3), Pearson ürün moment korelasyon katsayısı (r) ile ölçüldüğü haliyle, fibroblast popülasyonu. [C.LH C.TE vs: r = 0.92]; [C.LH U.LH vs: r = 0.61]; [U.LH vs C.TE: r = 0.64]. Walmsley izni ile yeniden, GG ve ark. Fibroblast Hasat in vitro. Doku mühendisliği Yüzey Etiket Shift ortaya çıkarır Canlı. Bölüm C, Yöntem, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yazıda tarif edilen protokol, bir alt seçmek ya da daha sonraki analizler yapılmadan önce, hücre kültüründe bir zaman gerektiren ya mevcut yöntemlere kıyasla, FACS-bazlı sıralama ile fibroblastlar izole etmek için bir araç sunmaktadır. Fibroblast sıralama için cildin hasat gerekli süre yaklaşık 6 saattir; Bununla birlikte, hasat kullanılan farelerin sayısı, bu tahmin etkileyecektir.

Protokolde birkaç nokta özellikle dikkat gerektirir. İlk izolasyon prosesi esnasında sindirimi ve santrifüjün ardından sindirim ve süpernatan üst lipit tabakanın çıkarılmasından önce, derinin yağ çıkarılması ile, adiposit kirlenmesini sınırlayıcıdır. Bazı lipid bileşenleri tüpler plastik duvarlar uygun ve daha sonra pelet yıkamadan kontamine olabilir hücreleri topaklanır sonra Ayrıca yeni tüplere değiştirmek için yararlı olabilir. İkinci nokta epidermis ayrı dermise titiz bakım gerektirirepidermal-dermal kavşakta boyunca. Epidermal hücreler kirlenmesine FACS tükenmesi stratejisi tarafından silinecektir rağmen, burada kontaminasyonu sınırlamak için bir çaba hala yapılmalıdır.

Bu yaklaşımın sınırlamalar geçerli soy paneli tarafından yakalanan değildir hücrelerin kontamine potansiyel varlığı bulunmaktadır. Soy antikorları (CD31, CD45, Tıe2, Ter119, EpCAM) konjuge flüoroforun seçerken, araştırmacılar diğer yüzey işaretleyici yaptıkları isteyebilirsiniz analizleri dikkate dikkat etmelisiniz. Ek lekeleri seçilen nesilli antikoru florofor farklı kanalları olmalıdır. Genel olarak, daha fazla analiz için uygun dalga boyunda bir çok aralığını koruyan bir yere konjugat olduğu PacBlue bulundu. Soy antikor florofora canlılık boya Matching dalga boylarında ek dizi korur. Örneğin, canlılık boya DAPI heyecanlandıran ve PacBlue benzer dalga boylarında fluoresces. Bu şekilde, tüm DAPI posas ve soy antikor pozitif hücreler etkin bir hedef kitle olarak sadece canlı fibroblastlar bırakarak, tek bir kapısı kullanarak ortadan kaldırılabilir. Aynı zamanda, hücrelerin bilinmeyen bir dereceye kadar, bir süre sınırlı miktarda ve muhtemel etkileri, gen ekspresyonu için izolasyon prosedürü sırasında FBS maruz kaldığı dikkat edilmelidir.

Inclusively tüm fibroblast nüfus için sıralamak yeteneği gerçekten bu tam olarak anlaşılamamıştır hücre tipi heterojenitesini sorgulamak için bir fırsat oluşturmaktadır. Bu normal fizyoloji bağlamında uygulanmasını yanı sıra aşırı fibrozis ve anormal fibroblast davranışlarını içeren hastalıkların bir çeşitlilik vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma (HPL için) NIH hibe R01 GM087609, (MTL) (HPL için) Anthony Shu, NIH hibe U01 HL099776 onuruna Ingrid Lai ve Bill Shu bir Hediyesi, Hagey Laboratuvarı için bir hibe ile kısmen desteklenmiştir Pediatrik Rejeneratif Tıp ve Meşe Vakfı (MTL, GCG ve HPL). GGW Tıp Stanford School, Stanford Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı tarafından desteklenen ve NIGMS eğitim bursu GM07365 oldu. ZNM Plastik Cerrahi Vakfı Araştırma Bursu Grant ve Hagey Aile Fonu tarafından desteklenmiştir. MSH California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) Klinik Fellow eğitim bursu TG2-01159, Çene Hastalıkları Cerrahlar American Society (ASMS) / Çene-Yüz Cerrahları Vakfı (MSF) Araştırma Bursu Ödülü ve Transplantasyon ve Doku Mühendisliği Bursu Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058
Collagenase IV Gibco 17104-019
Elastase Abcam ab95133
DMEM Life Technologies A14430-01
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
40 μm filters Fisher Scientific 08-771-1
70 μm filters Fisher Scientific 08-771-2
100 μm filters Fisher Scientific 08-771-19
CD31 BioLegend 102421
CD45 BioLegend 103125
Tie2 BioLegend 124005
Ter-119 BioLegend 116233
EpCAM (CD326) eBioscience 48-5791
DAPI Invitrogen D3571
propidium iodide (PI viability stain) BioLegend 421301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
  2. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
  3. Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
  4. Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
  5. Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
  6. Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
  7. Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
  8. Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
  9. Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
  10. Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
  11. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
  12. Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
  13. Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
  14. Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
  15. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
  16. Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
  17. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
  18. Cormack, D. H. Ham's Histology. J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).
  19. Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
  20. Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
  21. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
  22. Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
  23. Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
  24. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
  25. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. e4425 (2013).
  26. Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. (2014).
  27. Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. (2015).
  28. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (2010).
  29. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
  30. Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
  31. Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. (2015).
FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).More

Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter