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Developmental Biology

小鼠皮肤成纤维隔离用流式细胞仪

doi: 10.3791/53430 Published: January 7, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

成纤维细胞是负责分泌细胞外基质的原则细胞类型和许多器官和组织的重要组成部分。成纤维细胞的生理和病理背后临床实体,包括的纤维化在多个器官,增生性疤痕以下烧伤,缺血心脏功能的损失,和癌症间质的形成的频谱。然而,成纤维细胞仍然是一个不良的特征类型的细胞,主要是由于其固有的异质性。成纤维细胞的分离现有方法需要的时间在细胞培养的深刻影响细胞的表型和行为。因此,许多研究调查的成纤维细胞生物学依靠在体外操作 ,不准确捕获体内成纤维细胞的行为。为了克服这个问题,我们开发了一种基于FACS的协议,用于成纤维细胞的成年小鼠的背部皮肤,不需要细胞培养物中分离,由此preservi纳克生理转录和每个细胞的蛋白质组曲线。我们的策略允许通过一个谱系负栅极排斥非间充质细胞系(林- ),而不是一个积极的选择策略,以避免预选的成纤维细胞亚群的或富集表达特异性表面标志,并尽可能具有包容性跨越这个异类细胞类型。

Introduction

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成纤维细胞经常定义形态作为坚持以塑料基板梭形细胞。成纤维细胞是负责合成和重塑细胞外基质在胚胎和成年器官1中的原理的细胞类型。成纤维细胞因此至关重要哺乳动物发育和细胞外环境是影响相邻存在于各组织和器官中的细胞类型的行为有助于基本上。

成纤维细胞也落后造成巨大的临床负担的医疗条件多样化的主要细胞类型。病理的成纤维细胞活性的损害正常组织功能,并且包括组织和器官的纤维化(如肺和肝),疤痕下列皮肤伤口愈合,动脉粥样硬化,全身性硬化症,和形成血管损伤后2-5粥样硬化斑块的。特别是伤口愈合,急性和慢性,涉及ðeposition既不酷似也不功能类似正常组织周围,并导致发病率显著跨不同病理状态的疤痕组织。损伤后,存在成纤维细胞的肌成纤维细胞,以过渡,然后分泌结构ECM成分,发挥对邻近的细胞类型旁分泌效果,并且通过沉积疤痕组织6恢复机械稳定性。

在皮肤组织存在于跨越发育时间伤口修复的质量解剖部位之间和显著变化。在人生的前两三个月的胎儿愈合,不留疤痕;然而,从和整个成年期的晚期,治愈人类与疤痕。位点特异性,除了年龄特异性,在伤口愈合的差异存在。在口腔中的伤口改造以最小的疤痕形成7,8-,而皮肤伤口内的瘢痕组织沉积是显著9。争议仍然存在Çoncerning环境与对伤口愈合的结果本地的成纤维细胞的固有性质的在问候年龄和位置10,11的相对影响。定在小鼠口服与皮肤真皮和早期胚胎(E15)愈合的显著差异与购买胚胎(E18)真皮,它很可能是在某些发育年龄和各种解剖部位之间在成纤维细胞的种群特性存在差异。

1986年,哈罗德·F.德沃夏克假定肿瘤伤口不愈合12。 Dvorak的结论是,肿瘤行为类似于伤口在主体和通过激活伤口愈合的主机的响应诱导其基质。许多研究以来研究了成纤维细胞,以癌13-15的进展的贡献,但如在伤口愈合中,身份并有助于皮肤CA的基质隔室的成纤维细胞的胚胎起源的情况下rcinomas还没有得到充分的界定。在回答这个问题负有鉴于最近的研究暴露肿瘤相关成纤维细胞作为抗癌治疗16潜在有效靶点医疗相关性。

识别和前瞻性隔离赋有纤维化潜力体内成纤维细胞系是实现有效地操纵其范围广泛的急性和慢性疾病损伤反应的一个重要步骤。在1987年,科马克表明两个亚群的成纤维细胞,一种驻留在乳头和一个网状真皮层17,18内内。第三个亚群被发现在毛囊19,20的毛乳头区毛囊有关。当进行培养,成长潜力,形态和生长因子/细胞因子,这些成纤维细胞亚型表现出不同型材21-24。

迄今为止,研究探讨成纤维细胞,他terogeneity在很大程度上未能充分表征体内成纤维细胞之间的发育和功能的多样性。这部分地是对培养的成纤维细胞种群的依赖和细胞培养物或阳性选择的不是由所有的成纤维细胞25表示的自表面受体的基础上的均化效果的结果。从我们的实验室最近的一项研究证实了深刻的表面标志,并在培养与未培养成纤维细胞中分离的流式细胞仪为基础的分离方法,在此手稿26呈现转录变化。

接着,我们确定了鼠背真皮内的特定的成纤维细胞谱系并确定此谱系,通过ENGRAILED-1的胚胎表达的定义,主要负责在背部皮肤结缔组织沉积。期间急性和慢性纤维化形式,包括伤口愈合,癌症间质的形成,和谱系的功能辐射诱发的纤维化27。鲜明的成纤维细胞系的表征具有治疗旨在调节纤维化的行为至关重要的意义。

而不是使用依赖在体外操作 ,以实现细胞分离28,29的现有协议,收获协议图1)这里详述将有助于成纤维细胞更准确地捕捉和表型的行为的体内产率信息进行分析。

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Protocol

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该协议遵循经对实验动物的斯坦福大学行政专家组的方法。

1.消化鼠真皮

  1. 安乐死小鼠麻醉后颈椎脱位与腹膜内注射氯胺酮100mg / kg的甲苯噻嗪+ 20mg / kg的+乙酰丙嗪3毫克/公斤。
    注意:各种年龄和背景都可以使用。
  2. 刮脸和脱毛的背部皮肤。大约100,000细胞可以从一块背部皮肤的60毫米×100毫米的分离。
  3. 淹没鼠标在70%的乙醇和地点上的无尘,无菌的表面干燥。
  4. 立即用无菌解剖剪刀收获背小鼠皮肤。在雌性小鼠,避免包括乳腺组织。
  5. 开始尾根部,使用镊子帐篷向上皮肤和沿超筋膜平面解剖之前进行横向切割。
  6. 小心避免,同时包括任何收获皮下脂肪皮。检查皮肤收获任何皮下脂肪,仔细用解剖刀的钝边刮它。
  7. 冲洗在优碘收获的皮肤后跟五倍PBS洗涤在冰上。
    注意:保持皮肤接近无菌尽可能避免污染是非常重要的。
  8. 使用剃刀刀片和解剖在无菌培养皿剪刀直至样品是用2-3毫米件的均匀一致性剁碎皮肤。
  9. 制备50个含20ml胶原酶IV锥形管以1毫克/毫升的DMEM的浓度。划分真皮成每管五只小鼠的基础上的管中。
  10. 搅拌样品,在37℃剧烈而培养1小时在任一水浴或烘箱。
  11. 从培养箱中取出样品,并通过10ml的无针注射器3-5x在无菌罩。
  12. 将样品放回培养箱中在37℃,剧烈摇晃另外30分钟。
  13. 在无菌罩,使用10毫升吸管吸取样品上下3-5x。通过一个100微米的过滤器将样品吸取到一个新的50ml锥形管中。
  14. 通过将20ml的10%FBS的DMEM通过相同的过滤器,以最大限度地提高细胞产量和使总体积至40ml。离心机以300g于4℃下8分钟。
  15. 用无菌玻璃吸管时,注意先删除之前,剩余的上清液上层脂肪层去除上清。
    注意:该步骤是关键的,以减少脂肪细胞污染。
  16. 重悬粒料在20毫升10%FBS的DMEM。
  17. 通过一个70微米的过滤器通过细胞/ DMEM悬液。
  18. 冲洗过滤器,用10毫升10%FBS的DMEM和离心机的过滤悬浮液以300g于4℃下8分钟。
  19. 用无菌玻璃吸管,再次小心地第一除去任何剩余的脂肪层除去上清液。
  20. 如果有显著红细胞污染(颗粒是明显红),重新悬浮小球在20毫升的ACK裂解缓冲液孵育5分钟,在室温。否则,跳到步骤24。
  21. 加的FACS缓冲液(PBS,10%胎牛血清,0.1%叠氮化钠)等体积(20毫升)中,然后混合,并保持5毫升一份留作未染色对照。离心剩余的样品以300g于4℃下8分钟。
  22. 除去上清液,把沉淀在冰上。细胞可以被冷冻向下此时如果FACS时间不可用。

通过流式细胞仪2.隔离成纤维细胞

  1. 使500微升血统抗体孵育组合的每个颗粒。 ,CD45(1:200),Tie2的(1:50),泰尔:通过第一加法475微升FACS缓冲液含有DNA酶(10微克/毫升)至管,然后加入荧光团共轭的CD31(100 1)这样做-119(1:200),和EpCAM的(1:100)的抗体,以实现各稀释为每个抗体。
  2. 重悬在500μl的谱系抗体孵育混合物每个颗粒孵育该悬浮液在冰上20分钟。
  3. 添加5毫升FACS缓冲液含有DNA酶(10微克/毫升)的样品并轻轻混匀。离心机以300g于4℃下8分钟。
  4. 去除上清,洗涤细胞沉淀用5ml FACS缓冲液含有DNA酶(10微克/毫升),并使用相同的条件离心机如在步骤26。
  5. 重悬在含有DNA酶(10微克/毫升)加入500μlFACS缓冲液中的颗粒和放下作为生存力染料控制一个50微升等分试样。
  6. 选择的生存力染料添加到剩余的样品中为所选择的染料指示的浓度。
  7. 进行FACS分析31和用于存活力染料- / CD31 - / CD45 - / Tie2- /泰尔-119- / EpCAM-细胞(参见图2A)排序。排序直接进入流式细胞仪缓冲。

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Representative Results

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这种方法图1)的有效性已经在许多方面,它可以详细检查在我们最近的出版物27中得到验证。这些措施包括分选的细胞和细胞的大量和新鲜排序细胞的单细胞转录分析的免疫细胞化学。成纤维细胞进行排序,而不是直接更准确地依赖于文化的捕捉它们在体内的表型。使用谱系阴性耗竭的方法图2A),而不是阳性选择方法避免预选特定亚群。这种方法的值由Rinkevich 等人 27被最近证明,识别在先前未描述的真皮水平CD26阳性的成纤维细胞的存在。

为了证实培养成纤维细胞的过程中导致基因表达显著的变化,我们用微阵列培养的成纤维细胞比较未培养成纤维细胞。我们培养成纤维细胞该分离由两种技术,在该手稿和一个公知的组织外植体协议28详述的活的收获协议。全转录组微阵列分析显示,培养的成纤维细胞中分离由实况收获(C.LH)和组织外植(C.TE)方法具有相似的高度处与皮尔森乘积矩相关系数的全基因组范围的水平(R 0.92)(图2B)。相比较而言,培养的成纤维细胞活收获的未培养成纤维细胞(U.LH)显著差异。 C.LH与U.LH之间的比较产生了0.61的R,而C.TE与U.LH的比较得到的0.64(图2B)的河这些结果建立分析活收获成纤维细胞,而不是培养的成纤维细胞的重要性。对于使用此协议和培养的成纤维细胞未培养的分离之间的转录和蛋白质组的差异更完整的分析,参阅沃姆斯利<EM>等人26

图1
图1.概述成纤维细胞的分离。参与此基于FACS的分离方案的主要步骤的示意图。重复使用的沃姆斯利许可,GG 活成纤维细胞收获揭示体外 组织工程表面标志物移位。 C部分,方法 ,DOI:10.1089 / ten.TEC.2014.0118(2014) 点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.流式细胞仪和微阵列分析。基于碘化丙啶站(A)FACS门控策略显示选择的单细胞(左图),选择了活细胞都进不去(中图),并选择沿袭消极的CD31,CD45,Tie2的,TER119和EpCAM的基础上成纤维细胞(右图)的。( 二)未培养活收获(U.LH)与培养的活收获的微阵列分析(C.LH)与培养的组织块(C.TE)成纤维细胞。基因表达U.LH(N = 3),C.LH之间的相似性(N = 3),和C.TE(n = 3时),通过皮尔逊积差相关系数(r)测定成纤维细胞种群。 [C.LH与C.TE:R = 0.92]; [C.LH与U.LH:R = 0.61]; [C.TE与U.LH:R = 0.64]。重复使用的沃姆斯利许可,GG 活成纤维细胞收获揭示体外 组织工程表面标志物移位。 C部分,方法 ,DOI:10.1089 / ten.TEC.2014.0118(2014) 点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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在这个手稿中描述的协议提供了通过基于FACS分选来分离成纤维细胞,在比较现有方法,这两种选择的亚群或随后的分析之前需要时间在细胞培养物的方法。从收获的皮肤所需的成纤维细胞的分选的时间是约6小时;然而,在收获用于小鼠的数目将影响这一估计。

有几个点在协议中需要特别的照顾。第一是由以下中的分离过程的消化和离心除去脂肪消化和除去上清液的上部脂质层的前皮肤限制性脂肪细胞污染。它也可能是有帮助改变到新管将细胞沉淀一些脂质组分附着在管子的塑料壁和可能污染后续沉淀洗涤后。第二点涉及到无微不至的关怀,从表皮分离真皮沿表皮真皮交界处。虽然污染表皮细胞将由FACS耗尽策略被除去,以努力这里限制污染仍然应该制成。

这种方法的限制包括污染不是由当前谱系面板捕获的细胞的可能存在。当选择缀合谱系抗体(CD31,CD45,Tie2的,TER119,EpCAM的 )的荧光,研究人员必须小心考虑其他表面标志物分析,他们可能要执行。其他污渍必须是从选定的谱系抗体的荧光团不同的渠道。在一般情况下,我们发现PacBlue是一种理想的缀合物,可以保留一个广泛用于进一步分析可用波长。生存能力染料匹配的谱系抗体荧光波长保留一个额外的范围。例如,生存力染料DAPI激发并发出荧光以相似波长PacBlue。在这种方式下,所有的DAPI婆sitive和谱系抗体阳性细胞可以使用单栅极被有效地消除,仅留下可行的成纤维细胞作为目标人群。还应当指出的是,细胞分离过程的时间有限的量和此可能影响基因表达的过程中暴露于FBS,一个未知的程度。

到(含)排序为所有的成纤维细胞群体的能力代表了一个机会,以真实地询问这个知之甚少细胞类型的异质性。这具有在正常生理学范围内的应用程序,以及各种涉及过度纤维化和成纤维细胞的异常行为的疾病。

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Acknowledgments

这项工作是由美国国立卫生研究院资助R01 GM087609(到HPL),由英格丽·莱和比尔舒纪念安东尼·舒(到HPL),美国国立卫生研究院资助U01 HL099776(以MTL)的礼品,在Hagey实验室的资助部分支持小儿再生医学和橡树基金会(至MTL,GCG和HPL)。 GGW是由斯坦福大学医学院,斯坦福大学医学院的科学家培训项目的支持,并NIGMS培训资助GM07365。 ZNM是由整形外科基金会研究奖学金资助和Hagey家族基金的支持。 MSH是由美国加州再生医学研究所(CIRM)临床研究员的培训补助TG2-01159,颌面外科医生协会(ASMS)/颌面外科基金会(MSF)研究基金奖,并在移植与组织工程研究金支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058
Collagenase IV Gibco 17104-019
Elastase Abcam ab95133
DMEM Life Technologies A14430-01
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
40 μm filters Fisher Scientific 08-771-1
70 μm filters Fisher Scientific 08-771-2
100 μm filters Fisher Scientific 08-771-19
CD31 BioLegend 102421
CD45 BioLegend 103125
Tie2 BioLegend 124005
Ter-119 BioLegend 116233
EpCAM (CD326) eBioscience 48-5791
DAPI Invitrogen D3571
propidium iodide (PI viability stain) BioLegend 421301

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References

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