שיטה פשוטה למיצוי שלב המוצק האוטומטי של דגימות מים לניתוח החיסוני של מזהמים קטנים

Abstract

שיטה חדשה להפקה מוצקה שלב (SPE) של דגימות מים סביבתיות מוצעת. אב הטיפוס שפותח הוא יעיל וחסכוני וידידותיות למשתמש, ומאפשר לבצע SPE מהיר, אוטומטי ופשוט. הפתרון מראש מרוכז תואם ניתוח על ידי immunoassay, עם תוכן ממס אורגני נמוך. שיטה מתוארת לחילוץ ומראש ריכוז של 17β-אסטרדיול הורמון טבעי במיליליטר 100 דגימות מים. שלב הפוך SPE מתבצע עם סופג octadecyl-סיליקה וelution נעשה עם 200 μl של מתנול 50% V / V. Eluent מדולל על ידי הוספת di-מים כדי להפחית את הכמות של מתנול. לאחר ההכנה ידנית עמודת SPE, ההליך הכולל מתבצע באופן אוטומטי בשעה 1. בסופו של התהליך, ריכוז אסטרדיול נמדד באמצעות assay מסחרי צמוד אנזים חיסוני-סופג (ELISA). טרום ריכוז של פי 100 מושגת ותוכן מתנול רק 10% V / V. החלמה מלאה של המולקולההם השיגו עם 1 ננוגרם / L ממוסמר דגימות מי ים דה מיוננים וסינתטיות.

Introduction

לדוגמא הכנה היא צעד חשוב בכל תהליך אנליטי. בפרט, הסרת אפקטי מטריקס, ההפחתה של הפרעות, והעשרה של אנליטי נחוצות כדי להשיג תוצאות מדויקות ולהגיע גבולות נמוכים של גילוי. תרכובות האנדוקרינית לשבש (EDCs) הן מדאיגות במיוחד בשל פעולתם באורגניזמים החיים, גם כאשר הרמות נמוכות מאוד בהווה בסביבה. 17β-אסטרדיול ההורמון הטבעי קיים בזיהום המים האיחוד האירופי רשימת מעקב ונוטה להוסיף לרשימה של חומרי עדיפות מוסדרים באירופה המים מסגרת ההוראה. מיצוי שלב מוצק (SPE) מיושם בדרך כלל לניתוח של מזהמים קטנים במים, עם שני הכימית ^1-5 (כרומטוגרפיה, ספקטרוסקופיית מסות) ושיטות זיהוי חיסוניות ^6-9. האחרון זכה להתעניינות בתחום הניטור סביבתי, כimmunoassays זמין במגוון רחב של פורמטים, הם ספציפיים לת"אאנליטי r קבל, ולהגיע לגבולות נמוכים של גילוי. ^{6, 7, 10, 11} מבחני שונים אנזים קשור immunosorbent (ELISA) זמינים מסחרי ולאפשר לנתח דגימות מרובות בבת אחת על צלחת רב גם. ההליך מורכב בצעדי תגובה רצופים שיכול לקחת כמה שעות. המוצר הסופי של תגובה יכול להיות מזוהה אופטי כדי לקבוע את הריכוז של מולקולת היעד המבוססת על עקומת כיול.

נהלי SPE קלאסיים כוללים סופג מראש אוויר, חילוץ מדגם, כביסה, elution, וריכוז על ידי אידוי של eluent. הממס המשמש לדילול של תמצית זו נבחר בהתאם לשיטת זיהוי. לשיטות חיסוניות, הסכום של השפעות ממס אורגניות מאוד את הרגישות של השיטה. ¹²

בנוסף להתאוששות וההופעות טרום ריכוז, השיטה גם צריכה להיות פשוט ועלות יעילה. אוטומציה של procedurדואר עוזר להפחית שגיאות הקשורות לאדם. בעבודה הקודמת שלנו ¹³ הצגנו אב הטיפוס שלנו לSPE האוטומטי, והשיטה שלנו הייתה מוחלת על הניתוח של 17β-אסטרדיול ההורמון הטבעי בדגימות מי ים. עם הווידאו הנוכחי ברצוננו להדגיש את היתרונות הטכניים של השיטה שלנו בהשוואה לoff-line מסורתי ועל שורת SPE, והתאימות המסוימת שלה עם זיהוי על ידי חיסוני תגובות. אנו מתארים את הפרוטוקול מיושם על דגימות מים לגילוי 17β-אסטרדיול. SPE מתבצע עם octadecyl-סיליקה שלב סופג (C18) וelution מתבצע עם מתנול המדולל.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את SPE בוצע על 100 מדגם מיליליטר מים עם סופג C18 וelution עם 50% מתנול V / V. המדגם המועשר מדולל להגיע 10% מתנול V / V לפני ניתוח עם אנזים קשור immunosorbent assay ערכה (ELISA).

1. הכנת ריאגנטים

1. הכן את דגימות המים
   1. לפני כל צעד אחר, לסנן כל דגימת 100 מיליליטר מים עם מסנני גודל 0.2 מיקרומטר נקבובית.
   2. ספייק המדגם עם ריכוז רצוי על ידי דילול הנפח מתאים של פתרון התייחסות לכמות מים. לדוגמא, להכין של דגימת מים עם 100 L / ng של E2 100 מיליליטר ידי דילול 3.3 μl של פתרון התייחסות E2 בריכוז של 300 מיקרוגרם / ליטר. לדלל את הפתרון הזה עשר פעמים כדי לקבל מדגם ממוסמר עם 10 ng / L E2. לדלל אחרון זה עוד עשר פעמים כדי לקבל מדגם של 100 מיליליטר עם 1 ננוגרם / L E2.
   3. מניחים את המדגם המסונן (ללא שינוי או ממוסמר) בבקבוק זכוכית עם Gחוט L45. השתמש במדגם באותו היום. קח חלק קטן כדי להיות מנותח עם ELISA להעריך ריכוז ראשוני.
2. הכן 300 μl של eluent על ידי דילול מתנול במי דה מיונן (di-) 50% v / v בצינור הדוק.

2. הכנת טור SPE

1. הכן 20 מ"ג / מיליליטר השעיה של חלקיקים סופגים octadecyl-סיליקה ידי הוספת 1,600 μl הראשון של מתנול ולאחר מכן 400 μl של di-מים עד 40 מ"ג של סופג שלב הפוך. חוזקה לסגור את המכסה ולהתסיס עם מערבולת.
2. התקנת הקרום התחתון בעמודה
   1. בחר קרום ניילון אחד עם הגודל נקבובית 11 מיקרומטר ולמקם אותו בשכבה כפולה של רקמות נגד אבק. עם אגרוף קוטר 3 מ"מ, לחתוך שני חלקים קטנים בקרום.
   2. תפוס את אחד מהקרומים הקטנים עם מלקחיים מסנן שטוח סוף ומניח אותו בצד אחד של הטור.
   3. הברג את המחבר שטוח תחתון עם הצינור ולהדק. הקרום הוא now במקום וניתן להוסיף סופג באופן מאובטח. צייר חץ בגוף של ההצבעה הטור לקראת הסוף שבו הקרום הוצב.
3. הכנת הטור הסופג ארוז
   1. אבטח את הטור על בעל עם החץ מצביע לכיוון החלק התחתון. העמודה חייבת להיות מוגדרת כאנכי ככל האפשר.
   2. צרף ריק 10 מיליליטר מזרק חד פעמי לסוף הצינור של הטור, באמצעות המחברים luer הנעילה.
   3. הכן מיקרו-פיפטה עם קצה 20-200 μl, להגדיר את הנפח ל -100 μl. פורמט קצה פיפטה זה מותאם לגודל של העמודה הסופגת להיות מוכנות. ההליך יהיה קשה יותר עם טיפים פיפטה גדולים כגון אלה המשמשים עם 1 מיליליטר טפטפות.
   4. להתסיס את ההשעיה הסופגת עם מערבולת, ומהירות pipet 100 μl במרכז בטור. בעוד הזרקה, לשאוב בעדינות כל פתרון pipetted שוקת הקרום באמצעות המזרק ביד השנייה. ברחוב זהגיל, הפתרון מילוי המזרק צריך להיות ברור של חלקיקים, וחלקיקי מיטת סופו של דבר יכולה להיות שנצפה בעמודה.
   5. חזור על תהליך זה פי 2 יותר על ידי התססה מניית ההשעיה בין כל הצעדים על מנת להבטיח pipetting השעיה הומוגנית של החלקיקים בתמיסה. הטור וכתוצאה מכיל 6 מ"ג של סופג.
   6. כאשר 300 μl של השעיה הוטענו ומיובש על ידי aspirating עם המזרק, לשמור את המזרק בעמדה ולמקם את קרום ניילון השני בחלק העליון על ידי שימוש במלקחיים ביד השנייה.
   7. לדפוק את המחבר השני עם צינור ולהשליך את המזרק. טור SPE מוכן לשימוש.

3. הכנת המערכת

1. הדק את טור SPE במכשיר על ידי שימוש במחברי luer הנעילה. החץ חייב להיות מצביע לאותו כיוון כמו זה שמוצג על המכשיר.
2. חבר את הבקבוק המכיל את המדגם למכשיר על ידי ההברגהסיפק כובע בטיחות GL45 על זה.
3. לטעון 200 μl של eluent במאגר 'eluent'.
4. עומס 800 μl של di-מים במאגר "הדילול".
5. הנח בקבוק ביציאת הפסולת כדי לאסוף את המים מעובד במהלך שלב חילוץ. הפורמט הוא לא חשוב, אבל הנפח צריך להיות מספיק גדול ביחס לנפח הדגימה.
6. הנח בקבוקון קטן ביציאת החיישן עם קיבולת הנפח המינימלית של 1.5 מיליליטר. נפח מרבי של 1 מיליליטר יהיה קטן מדי כבועות יהוו בשקע זה בעת איסוף eluent המועשר וחיץ דילול.
7. ודא וסת הלחץ היא במצב סגור על ידי הפיכתו באופן ידני, להפוך כיוון השעון עד תנועה נוספת אינה אפשרית.

SPE 4. עם אבטיפוס

1. הפעל את אב הטיפוס על ידי לחיצה על הכפתור בצד האחורי.
2. הכנת ממשק המשתמש ובחירת התכנית
   1. פתח את ממשק המשתמש. בחריציאת התקשורת של המחשב שאליו המכשיר מחובר מהרשימה, ולחץ על הכפתור "הבא".
   2. הזן את הערכים 580 לpset ו -30 לdpset. המשאבה תתאים לשמירה על לחץ במערכת ומאגרי הלחץ ב580 ± 30 mbar בעת הפעלה.
   3. בחר את המצב האוטומטי.
   4. בפינת המצב האוטומטית, לטעון את קובץ התכנית ב'נתיב קובץ התצורה "תיבה.
3. התאמת וסת הלחץ
   1. התחל המשאבה.
   2. הפעל ידני את וסת הלחץ עד הערך לקרוא לpreg הוא נחותה, אבל קרוב ל -320 mbar.
   3. עצור את המשאבה.
4. החל הליך SPE
   1. "התחל" לחץ בפינת המצב האוטומטית. המשאבה תעבור על והצעדים חילוץ, elution ודילול באופן אוטומטי לעקוב אחרי זה. ההליך כולו למדגם 100 מיליליטר מתבצע ב -50 דק '.
   2. ודא את הערך של preg. זה חייב להיות בטווח 320 - 350 mbar במהלך שלב החילוץ כדי להבטיח ספיקה אופטימלית.
   3. סגור את הבקבוקון הקטן וחנות ב 4-5 מעלות צלזיוס בחושך עד לניתוח. ביצוע ניתוח בשעה 30 הבאה כדי למנוע השפלה של אנליטי.
   4. השלך את המים מעובד.
5. ניקוי המערכת
   הערה: לאחר כל הליך חילוץ המערכת צריכה לנקות כדי למנוע זיהום צולב.
   1. הכן פתרון 10 מיליליטר של מתנול 70% v / v בבקבוק זכוכית 45 GL.
   2. נתק את טור SPE ולחבר את צינורות עם מחברים.
   3. במצב האוטומטי, בחר את קובץ 'הניקוי' ולהפעיל אותו עם אותו הגדרות לחץ.

5. איתור של ריכוז אסטרדיול עם ELISA

1. הכן את דגימות כיול עם ריכוזים כמפורט בפרוטוקול מצורף לערכת ELISA המשמשת. הכן calibra אחדtion להגדיר באותה מטריצה ​​כמדגם, וכיול אחת להגדיר עם מתנול 10% V / V.
2. לוותר את הסכום הדרוש של מדגם בבארות בצלחת, על פי הוראות יצרן. השתמש בדגימות כיול, דגימות מים ללא שינוי וממוסמרים שסוננו אבל לא מעובד עם SPE, והעשירו את הדגימות במתנול v 10% / V. השתמש 3 בארות לדגימה כדי להפחית את השגיאה הקשורים לassay.
3. בצע את הסימנים של הפרוטוקול המסופק בערכה לתוספת של מגיבים, זמן דגירה, כביסה ותגובה נוספת עם האנזים.
4. קראו את האות האופטי בכל טוב על פי הוראות יצרן הערכה עם מכשיר צלחת קורא ולאסוף את הנתונים.
5. השתמש בתוכנה של מכשיר צלחת הקורא כדי להתאים את עקומות הכיול ולקבוע את ריכוז E2 במדגם הראשוני עם אותו המטריצה, ובדגימות מועשרים עם מתנול 10% נ / נ.

Representative Results

שחזור של אריזה סופגת הוערך על ידי ייבוש ושקלול הסופג pipetted בבקבוקוני זכוכית והתוצאה מוצגת באיור 1. שחזור של זמן הזרקה נבדקה עבור דגימות 100 מיליליטר, כפי שמוצגת באיור 2. ריכוז ובראשוני מראש מרוכז ממוסמר דגימות נקבעו על ידי שימוש בערכת ELISA מסחרית ל17β-אסטרדיול ומוצגות באיור 3.

ההליך המוצע כרוך המשתמש להכנת השלב הסופג (איור 1). החלקיקים הסופגים מתקיימים בין שני קרומים ליציבות מכאנית והם ארוזים בצפיפות על ידי הלחץ המופעל עם המזרק בזמן pipetting ההשעיה בעמודה. הטור וכתוצאה מכיל כמות מותאמת של 6 מ"ג של סופג נבחר עם שגיאה רק 6% על ערך זה. צעד זה גם פועלכסופג אוויר, כמו ההשעיה מוכנה בתנאי ממס הופקע.

לאחר ההכנה וההתקנה של עמודת SPE במערכת, וטעינת הפתרונות במאגרים המתאימים, ההליך טרום-הריכוז הוא אוטומטי לחלוטין ודורש בשעה פחות מ 1 סך 100 מיליליטר מדגם (איור 2). הפקה מתבצעת ב± 40 8 דקות. רק שני פרמטרים עדיין מושפעים על ידי המשתמש, הכנת הסופגת ארוז וההגדרה של הספיקה. הראשון היה להיפתר על ידי שימוש בשיטות בקנה מידה גדולות לייצור טור. השני קשור להתאמה הידנית של ווסת הלחץ, הקובעת את ערך הלחץ להשתמש בכונן הפתרונות באמצעות המערכת. מקור זה של שגיאה יחוסל על ידי יישום וסת לחץ אלקטרונית.

לגבי הופעות, יחסי הציבורגורם דואר הריכוז הושג הוא 100. ראשית, לפני הריכוז 500 פי נעשה על ידי משחררי לחלץ מסופג עם 50% מתנול / נ נ. אז דילול 5 פעמים-מתבצע על ידי הוספת di-מים. דילול זו מפחית את תוכן הממס ומשמר את רגישות immunoassay. כשמסתכלים על עקומות הכיול של ELISA (איור 3 א), ברור שיחס מתנול במדגם המועשר אינו משפיע על הרגישות של immunoassay. תוצאת נציג של טרום ריכוז מוצגת באיור 3. השיטה יושמה לדגימות די-מים ומי ים המלאכותי ממוסמר עם 1 ננוגרם / L של 17β-אסטרדיול. בעוד ריכוזי המדגם הם מתחת לגבול של גילוי, שיטת קדם-הריכוז מביאה הצלחת דגימות אלה בטווח של assay (30 - L / 30,000 ng). ההחלמה התקבלו על ידי השוואת הריכוז הסופי עם ריכוז ממוסמר תיאורטי. החלמה של 128% ± 22% ו -107% ±6% חושבו לdi-מים ומי ים מלאכותי בהתאמה (איור 3).

איור איור 1. ושחזור של השיטה לאריזה סופגת. ישנם שלושה שלבים: הבטחת קרום ניילון הראשון עם המחבר הראשון, הזרקת ההשעיה הסופגת, וסוגר את הטור על ידי החדרת הקרום והמחבר השני. הטור וכתוצאה מכיל 6 מ"ג של סופג עם 6% סטיית תקן (n = 6 מוכנים ועמודות משוקללים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. צעד-אחר-צעדאיור של ההליך עם שחזור של זמן להזרקת מדגם. תשומות הפתרון נטענים במאגרים או הבקבוק. שתי יציאות הן מדגם מעובד (פסולת) ומדגם המועשר, אשר תואם לניתוח על ידי immunoassay עם תוכן ממס נמוך. ההליך הכולל הוא אוטומטי ולוקח מעט פחות משעה 1 (n = 31 עם סטיית תקן). ההשפעה של המשתמש בזרימת השיעור מודגשת עם דמויות כחולות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. תוצאות של טרום-הריכוז של E2 וניתוח על ידי ELISA. () עקום כיול של ELISA ונקודות שנמדדו לL / ng 1 ממוסמר di-מים (i) ומי ים מלאכותי (ii) לאחר enrichment. שחזורים (ב ') התקבלו לng 1 / L ממוסמר di-מים (i) ומי ים מלאכותי (ii) דגימות לאחר העשרה (n = 4). הברים שגיאת סטיית התקן נובעת ממספר החזרות והבארות 3 על צלחת ELISA ששמשו כדי לקבוע את הריכוז בכל דגימה. נתון זה שונה מ( ^13). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

שיטה חדשה להכנת דגימות מים ואחריו ניתוח באמצעות immunoassay הוצעה. המכשיר מאפשר לבצע מיצוי שלב מוצק בצורה אוטומטית וידידותי למשתמש.

הסינון של דגימת המים לפני הזרקתו למערכת הוא קריטי. כל חלקיקים שעדיין קיימים בפתרון היה פוטנציאל לגרום לסתימה של רשת fluidic ולחסום את טור SPE. צעד חשוב נוסף הוא ההכנה של טור SPE. כמות החלקיקים בעמודה היא קריטית כדי להשיג את הביצועים הטובים ביותר אפשריים. יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת הכנת ההשעיה של חלקיקים סופגים, כדי למנוע הצטברות של החלקיקים. זו מושגת על ידי הוספה ראשונה חלק הממס לסופג היבש, ולאחר מכן החלק די-מים. לאחר מכן, במהלך שלב האריזה, חשוב לערבב את ההשעיה גם בעוד aspirating עם פיפטה 100 μl. בסופו של Pro SPEcedure, ניקוי המערכת כראוי הוא קריטי. ראשית, הוא מונע זיהום צולב בעבודה עם מדגמים שונים, ושנית זה ימנע את הסיכון של יו-זיהום של המכשיר כאשר הוא לא בשימוש.

כפי שנאמר במבוא, השימוש בשיטות חיסוני זיהוי לניתוח של מולקולות מזהמים קטנות בסביבה מתרחב. שיטות אלה להגיע גבולות לתגליות ברמות L / ng הנמוכים ^{7, 11} ויש לי את היתרון של להיות מאוד ספציפי. שיטות אלה משמשות בשילוב עם שיטות כימיות, בעיקר בטכניקות הקשורות ספקטרומטר המסה. ^{14, 15} האחרונים אינו מגבילות את השימוש בממס אורגני ותועלת ממערכות SPE אוטומטית המאפשרים להגיע לגורמים טרום-הריכוז הגבוהים הנדרשים. לשם השוואה, immunoassays רגיש יותר להרכב חיץ assay וחוסר מותאם טכניקות הכנת מדגם כדי להקל על התהליך. מודול שלנו מוקדש לניתוח שלמולקולות קניון על ידי immunoassay.

בשיטה האוטומטית שלנו, העשרה פי 100 מהמדגם מושגת והיתרים כדי לזהות אנליטי בטווח ריכוז ELISA. אם הופעות טרום ריכוז אלה נראים נמוכות בהשוואה לSPE המסורתי, הם להתאים בצורה מושלמת את הדרישות לגילוי חיסוני. יתר על כן, יש לו את המכשיר טביעת רגל קטנה (25 סנטימטרים X 15 סנטימטרים X 10 סנטימטרים) ועלות נמוכה בהשוואה להגדרות ידניות או אוטומטי SPE טיפוסיים. ¹³ במידת צורך, את התפוקה לניתוח מדגם מרובה ולכן יכולה להיות מוגברת על ידי שימוש בכמה מכשירים במקביל. אפשרות נוספת תהיה לעצב שיטה לכמויות קטנות יותר של מדגם וeluent, אשר יפחיתו את הזמן דרוש להליך. כמה מגבלות אחרות נדונו דרך התיאור של התוצאות. יש עדיין שני שלבים שבו המשתמש הוא מעורב, שניהם צמודים למידת פיתוח של אב טיפוס זה וייפתרו על ידי ביצוע צעד אחד נוסף לקראת ACמכשיר ommercial. האריזה של השלב הסופג מתבצעת באופן ידני. השיטה עם זאת הוצגה להיות קל ושחזור. אנו בטוחים כי עמודות חד פעמיות יכולות להיות מיוצרות אם המערכת הייתה מיוצרת בקנה מידה גבוהה יותר.

לסיכום, יש לנו תארנו שיטה חדשה לביצוע SPE במכשיר קומפקטי, אוטומטי. אנחנו הוכחנו את הפוטנציאל שלה לניתוח של דגימות מים על ידי immunoassay דרך התיאור של שיטת חילוץ ומראש ריכוז להחיל זיהוי של 17β-אסטרדיול על ידי ערכת ELISA מסחרית. השיטה היא ידידותי למשתמש וחסכוני, ויכולה בעתיד להיות מיושמת בקנה אחד עם חיישנים (עבודה בתהליך). אנו מצפים הפלטפורמה שלנו תאפשר לבצע הליכי מיצוי שלב מוצק דומים במטריצות מורכבות יותר מדגם רלוונטי גבוהות לניטור של EDCs, כגון מזון או בשתן. אנו משוכנעים המערכת שלנו תומכת ביישום של שיטות חיסוני איתור שהוקמו וקרובות בתחום הניתוח סביבתי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm particle diameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, range 30 - 3,000 ng/L