Abstract
Der foreslås en ny metode til fast fase ekstraktion (SPE) af vandprøver miljøet. Den udviklede prototype er omkostningseffektiv og brugervenlig, og gør det muligt at udføre en hurtig, automatiseret og enkel SPE. Præ-koncentrerede opløsning er kompatibel med analyse ved immunoassay, med en lavt indhold af organisk opløsningsmiddel. Der beskrives en fremgangsmåde til udvinding og præ-koncentration af naturlige hormon 17β-østradiol i 100 ml vandprøver. Omvendt fase SPE udføres med octadecyl-silica sorbent og eluering udføres med 200 pi methanol 50% v / v. Eluenten fortyndes ved tilsætning af di-vand for at sænke mængden af methanol. Efter fremstilling manuelt SPE-søjle, er den samlede procedure udføres automatisk inden for 1 time. Ved afslutningen af processen, er østradiol koncentrationen måles ved anvendelse af et kommercielt enzym-bundet immun- sorberende assay (ELISA). 100-fold pre-koncentration opnås, og methanolen indhold på kun 10% v / v. Fuld inddrivelser af molekyletopnås med 1 ng / L spiked deioniseret og syntetiske havet vandprøver.
Introduction
Prøve forberedelse er et vigtigt skridt i enhver analytisk proces. Især er nødvendige for at opnå præcise resultater og nå lave detektionsgrænser fjernelse af matrix effekter, formindskelse af interferens, og berigelse af analysanden. Hormonforstyrrende stoffer (EDC) er af særlig bekymring på grund af deres indsats på levende organismer, selv når til stede på meget lave niveauer i miljøet. Det naturlige hormon 17β-østradiol er til stede på EU vandforurening overvågningsliste og tilbøjelige til at blive føjet til listen over prioriterede stoffer er reguleret i henhold til rammedirektivet den europæiske Water. Fastfaseekstraktion (SPE) er almindeligt anvendt til analyse af små forurenende stoffer i vand, med både kemisk 1-5 (kromatografi, massespektrometri) og immunologiske 6-9 detektionsmetoder. Sidstnævnte tjente interesse inden for miljøkontrol, som immunoassays er tilgængelige i store række formater, er specifikke for tarFå analyt, og nå lave påvisningsgrænser. 6, 7, 10, 11 Forskellige enzymbundne immunosorbentassays (ELISA) er kommercielt tilgængelige og gør det muligt at analysere flere prøver på én gang på en multi-brønds plade. Proceduren består i successive reaktionstrin, der kan tage et par timer. Slutproduktet af reaktionen kan detekteres optisk at bestemme koncentrationen af målmolekylet baseret på en kalibreringskurve.
Klassiske SPE procedurer omfatter sorptionsmiddel pre-condition, prøve udvinding, vaskning, eluering, og koncentration ved fordampning af eluenten. Opløsningsmidlet anvendt til fortynding af denne ekstrakt vælges afhængigt af påvisningsmetoden. For immunologiske metoder, mængden af organiske opløsningsmidler påvirkninger på det kraftigste følsomhed af metoden. 12
Ud over den genopretning og de præ-koncentration forestillinger, metoden skal også være enkel og omkostningseffektiv. Automatisering af procedure hjælper med at reducere menneskelige-relaterede fejl. I vores tidligere arbejde 13 introducerede vi vores prototype til automatiseret SPE, og vores metode blev anvendt til analysen af det naturlige hormon 17β-østradiol i havet vandprøver. Med den nuværende video vil vi gerne fremhæve de tekniske fordele ved vores metode sammenlignet med traditionelle off-line og on-line SPE, og dens særlige kompatibilitet med detektion ved immuno-reaktioner. Vi beskriver protokollen anvendes på vandprøver til påvisning af 17β-estradiol. SPE udføres med octadecyl-silica (C18) sorbent fase og eluering udføres med fortyndet methanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Følgende protokol beskriver SPE udført på 100 ml vandprøve med C18 sorptionsmiddel og eluering med 50% v / v methanol. Den berigede fortyndes prøven at nå 10% v / v methanol inden analyse med et enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) kit.
1. Forberedelse af reagenser
- Forbered vandprøverne
- Forud for enhver anden trin, filtrere hver 100 ml vandprøve med 0,2 um porestørrelse filtre.
- Spike prøven med ønskede koncentration ved at fortynde passende volumen af referenceopløsning i en mængde vand. For eksempel fremstilling af 100 ml vand prøve med 100 ng / l E2 ved at fortynde 3,3 pi E2 referenceopløsning i en koncentration på 300 ug / l. Denne opløsning fortyndes ti gange for at få en prøve tilsat 10 ng / L E2. Fortynd sidstnævnte yderligere ti gange for at opnå en prøve på 100 ml med 1 ng / l E2.
- Placer filtrerede prøve (umodificeret eller spidse) i en glasflaske med GL45 tråd. Brug prøven på samme dag. Tage en lille fraktion, der skal analyseres med ELISA at estimere startkoncentration.
- Forbered 300 pi eluent ved fortynding methanol i (di) vand deioniseret til 50% v / v i en stram rør.
2. Forberedelse af SPE kolonne
- Der fremstilles en 20 mg / ml suspension af octadecyl-silica sorbentpartikler ved tilsætning første 1.600 pi methanol og derefter 400 pi di-vand til 40 mg omvendt fase sorbent. Tæt lukke låget og omrør med en vortex.
- Installation af nederste membran i kolonne
- Vælg en Nylon membran med porestørrelse 11 um og placere den på et dobbelt lag af anti-støv væv. Med en diameter stempel 3 mm, skære to små dele i membranen.
- Snup en af de små membraner med en flad-end filter pincet og placere den på den ene side af kolonnen.
- Skru fladbundede stik med røret og stram. Membranen er now på plads, og sorbenten kan tilsættes sikkert. Tegn en pil på kroppen af kolonnen peger mod den ende, hvor membranen blev anbragt.
- Forberedelse af pakkede sorberende kolonnen
- Fastgør kolonne på holderen med pil, der peger mod bunden. Kolonnen skal indstilles så lodret som muligt.
- Påsætter en afladet 10 ml engangssprøjte til enden af røret i kolonnen ved hjælp af Luer-Lock stik.
- Forbered en mikro-pipette med en 20-200 pi tip, indstille lydstyrken til 100 pi. Denne pipettespidsen format er tilpasset til størrelsen af sorbenten kolonnen skal forberedes. Proceduren vil være vanskeligere med større pipettespidser såsom dem, der anvendes med 1 ml pipetter.
- Agitere sorbenten suspension med en vortex og hurtigt pipetteres 100 pi i centrum på søjlen. Under injektion, aspireres forsigtigt hele pipetterede løsning igennem membranen ved hjælp af sprøjten med den anden hånd. På dette stalder, skal opløsningen fylde sprøjten være fri for partikler, og en partikel seng kan med tiden blive observeret i kolonnen.
- Gentag denne proces 2 flere gange ved omrøring råmassesuspensionen mellem alle pipetteringstrin at sikre homogen suspension af partikler i opløsningen. Den resulterende kolonne indeholder 6 mg sorptionsmiddel.
- Når de 300 pi suspension er blevet indlæst og tørret ved sugning med sprøjten, holde sprøjten i position og placere den anden nylonmembran på toppen ved hjælp af pincet med den anden hånd.
- Skru ned det andet stik med rør og bortskaffes sprøjten. SPE-søjle er klar til brug.
3. Forberedelse af systemet
- Stram SPE kolonne på enheden ved hjælp af Luer-Lock stik. Pilen skal pege i samme retning som den, der vises på enheden.
- Tilslut flasken indeholdende prøven til anordningen ved at skrueforudsat GL45 sikkerhed hætten på det.
- Indlæs 200 pi eluent i »Eluent 'reservoir.
- Belastning 800 pi di-vand i »udvanding« reservoir.
- Placer en flaske ved udløbet affald til opsamling af behandlet vand under ekstraktionstrinnet. Formatet er ikke vigtigt, men mængden skal være tilstrækkelig stor med hensyn til prøvevolumenet.
- Placer en lille hætteglas ved føleren stikkontakt med volumen kapacitet på 1,5 ml minimum. En maksimal volumen på 1 ml vil være for lille, da bobler vil danne på dette stikkontakten, når indsamling beriget eluent og fortynding buffer.
- Kontroller, at trykregulatoren er i lukket stilling ved at dreje den manuelt, reverse uret, indtil yderligere bevægelse er ikke mulig.
4. SPE med Prototype
- Tænd prototypen ved at trykke på knappen på bagsiden.
- Forberedelse af brugergrænsefladen og vælge programmet
- Åbn brugergrænsefladen. Vælgekommunikationen porten på computeren, som enheden er tilsluttet fra listen, og klik på knappen 'Næste'.
- Indtast værdierne 580 for pset og 30 for dpset. Pumpen vil tilpasse sig opretholde trykket i tryksystem og reservoirer ved 580 ± 30 mbar, når der køres.
- Vælg den automatiske tilstand.
- I den automatiserede tilstand hjørne, indlæse programmet filen i boksen 'konfigurationsfil vej «.
- Justering af trykregulatoren
- Start pumpen.
- Drej manuelt trykregulatoren indtil den aflæste værdi for preg er ringere, men tæt på 320 mbar.
- Stop pumpen.
- Start af SPE proceduren
- Tryk på 'start' i automatiseret tilstand hjørne. Pumpen vil tænde og udvinding, eluering og fortyndingstrin vil automatisk følge hinanden. Hele proceduren for en 100 ml prøve udføres i 50 min.
- Kontroller værdien af preg. Det skal være i intervallet 320-350 mbar under udvinding skridt for at sikre en optimal flow-rate.
- Luk lille hætteglas og opbevares ved 4-5 ° C i mørke indtil analyse. Foretage analyser i følgende 30 timer for at forhindre nedbrydning af analytten.
- Bortskaf det behandlede vand.
- Rengøring af systemet
Bemærk: Efter hver ekstraktion procedure systemet skal rengøres for at undgå krydskontaminering.- Der fremstilles en 10 ml opløsning af methanol 70% v / v i en GL 45 glasflaske.
- Tag SPE kolonne og sæt slangen med stik.
- I den automatiserede tilstand, skal du vælge "rensning" fil, og start den med samme tryk indstillinger.
5. Påvisning af estradiol Koncentration med ELISA
- Forbered kalibreringsprøver med koncentrationer som angivet i protokollen tilvejebragt med ELISA-kit, der anvendes. Forbered en calibration sæt med samme matrix som prøven, og en kalibreringssæt med methanol 10% v / v.
- Dispensere den nødvendige mængde prøve i brøndene på pladen, ifølge producentens anvisninger. Brug kalibreringsprøver, umodificerede og spikede vandprøver, der blev filtreret, men ikke behandlet med SPE, og berigede prøver i methanol 10% v / v. Bruge 3 brønde pr prøve at reducere fejl i forbindelse med analysen.
- Følg angivelserne i protokollen, der leveres med kittet for tilsætning af reaktanter, inkubationstid, vask og yderligere omsætning med enzymet.
- Læs det optiske signal i hver brønd ifølge kit producenten af instruktioner med en pladelæser instrument og indsamlingsmetoder.
- Bruge softwaren af pladelæser instrument til at passe kalibreringskurverne og bestemme E2-koncentrationen i den oprindelige prøve med samme matrix, og de berigede prøver med methanol 10% v / v.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproducerbarhed sorbent pakning blev evalueret ved tørring og vægtning af pipetterede sorbent i hætteglas og resultatet er vist i figur 1. Reproducerbarhed injektionstidspunktet blev testet for 100 ml prøver, som vist i figur 2. Koncentration i indledende og præ- koncentreret tilsat prøverne blev bestemt ved anvendelse af et kommercielt ELISA-kit for 17β-estradiol og er vist i figur 3.
Den foreslåede procedure indebærer brugeren for udarbejdelsen af sorbenten fase (figur 1). Sorbentpartiklerne holdes mellem to membraner til mekanisk stabilitet og er tæt pakket ved tryk, der påføres med en sprøjte under pipettering af suspensionen i kolonnen. Den resulterende kolonne indeholder en optimeret mængde af 6 mg af den valgte sorbent med kun 6% fejl på denne værdi. Dette trin fungerer ogsåsom sorberende condition, da suspensionen er udarbejdet i bevilgede opløsningsmiddelbetingelser.
Efter udarbejdelsen og installation af SPE kolonne på systemet, og indlæsning af løsninger i de relevante reservoirer, er præ-koncentrationen procedure fuldt automatiseret og kræver i alt mindre end 1 time for en 100 ml prøve (figur 2). Ekstraktion udføres i 40 ± 8 min. Kun to parametre er stadig påvirket af brugeren, udarbejdelsen af den pakkede sorptionsmiddel og indstillingen af strømningshastigheden. Den første ville blive løst ved at anvende store metoder skala til kolonne opspind. Den anden er relateret til manuel justering af trykregulatoren, som bestemmer trykværdien anvendes til at drive de løsninger gennem systemet. Denne fejlkilde ville blive elimineret ved at gennemføre en elektronisk trykregulator.
Med hensyn til forestillinger, PRe-koncentrationsfaktor opnået, er 100. For det første er 500-fold forkoncentrering gøres ved eluering ekstraktet fra sorbenten med 50% v / v methanol. Derefter blev en 5-gange fortynding udføres ved tilsætning af di-vand. Denne fortynding reducerer opløsningsmiddelindholdet og bevarer immunoassay følsomhed. Når man ser på kalibreringskurverne af ELISA (figur 3A), er det klart, at methanol-forholdet i beriget prøve ikke påvirker følsomheden af immunoassayet. Et repræsentativt resultat af præ-koncentration er vist i figur 3. Metoden blev anvendt til di-vand og kunstig havvand prøver tilsat 1 ng / l 17β-estradiol. Medens prøven koncentrationerne under detektionsgrænsen, præ-koncentration metoden med succes bringer disse prøver i området assayet (30 - 30.000 ng / L). Genfindelse blev opnået ved at sammenligne den endelige koncentration med teoretiske spiked koncentration. Inddrivelser af 128% ± 22% og 107% ±6% blev beregnet for di-vand og kunstigt havvand (figur 3B).
Figur 1. Illustration og reproducerbarhed af fremgangsmåden til pakning sorbent. Der er tre trin: fastgør den første nylonmembran med den første konnektor, intravenøse sorbenten suspension og lukker søjlen ved at indsætte den anden membran og stik. Den resulterende kolonne indeholder 6 mg sorbent med 6% standardafvigelse (n = 6 forberedt og vægtede kolonner). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Trin-for-trinillustration af fremgangsmåden med reproducerbarhed af tid til prøve injektion. er løsningen inputs er lagt i reservoirer eller flaske. De to udgange er behandlet prøve (affald) og den berigede prøve, som er kompatibel til analyse ved immunoassay med lavt indhold af opløsningsmidler. Den samlede procedure er automatiseret og tager lidt mindre end 1 time (n = 31 med standardafvigelse). Indflydelsen af brugeren på strømningshastigheden er fremhævet med blå bogstaver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Resultaterne af præ-koncentration af E2 og analyse ved ELISA. (A) Kalibreringskurver i ELISA og punkter målt for 1 ng / L spiked di-vand (i) og kunstig havvand (ii) efter Enrichment. (B) Tilbagebetalinger opnået for 1 ng / L spiked di-vand (i) og kunstig havvand (ii) prøver efter berigelse (n = 4). Fejlsøjlerne er standardafvigelser i forbindelse med antallet af replikater og 3 brønde på ELISA-pladen, der blev anvendt til at bestemme koncentrationen i hver prøve. Dette tal har været ændret siden (13). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ny metode til fremstilling af vandprøver efterfulgt af analyse under anvendelse af immunoassay blev foreslået. Instrumentet gør det muligt at udføre fastfaseekstraktion i en automatiseret og brugervenlig måde.
Filtrering af prøven vand før injektion i systemet er kritisk. Eventuelle partikler stadig til stede i løsning vil potentielt medføre tilstopning af fluide netværket og hindre SPE kolonne. Et andet vigtigt skridt er udarbejdelsen af SPE kolonne. Mængden af partikler i kolonnen er afgørende for at opnå de bedste resultater muligt. Der skal udvises særlig omhu ved udarbejdelsen af suspensionen af sorbentpartikler, for at undgå agglomerering af partiklerne. Dette opnås ved at tilsætte første opløsningsmiddelfraktionen til den tørre sorbent, og derefter fraktionen di-vand. Derefter under pakning trin, er det vigtigt at blande suspensionen godt, mens opsugning af 100 pi med pipetten. Ved slutningen af SPE proprocedure, korrekt rengøring af systemet er kritisk. For det første forhindrer krydskontaminering, når der arbejdes med forskellige prøver, og for det andet undgår risikoen for bio-forurening af instrumentet, når det ikke anvendes.
Som omtalt i indledningen, er brugen af immuno-detektionsmetoder til analyse af små forurenende molekyler i miljøet udvide. Disse metoder nå rammerne af registreringer i den lave ng / L niveauer 7, 11 og har den fordel at være meget specifik. Sådanne metoder anvendes i kombination med kemiske metoder, for det meste massespektrometri relaterede teknikker. 14, 15 Sidstnævnte må ikke begrænse anvendelsen af organisk opløsningsmiddel og drage fordel af automatiserede SPE-systemer, der gør det muligt at nå de krævede høje pre-koncentration faktorer. Til sammenligning immunoassays er mere følsomme over for assaypufferen sammensætning og mangler tilpasset prøveforberedelse teknikker til at lette processen. Vores modul er dedikeret til analysen af small molekyler ved immunoassay.
Med vores automatiserede metode, er en 100-fold berigelse af prøven opnået, og tillader at detektere analytten i ELISA koncentrationsområde. Hvis disse præ-koncentration forestillinger synes lav i forhold til traditionelle SPE, de passer perfekt til kravene for immuno-detektion. Desuden instrumentet har et lille fodaftryk (25 cm x 15 cm x 10 cm) og billig i forhold til typiske manuelle eller automatiske SPE opsætninger. 13 Hvis det er nødvendigt, kan throughput til analyse multipel prøve derfor forhøjes med at bruge et par enheder parallelt. En anden mulighed ville være at designe en metode til mindre mængder af prøven og eluent, hvilket ville reducere den nødvendige tid til proceduren. Nogle andre begrænsninger blev drøftet gennem beskrivelse af resultaterne. Der er stadig to trin, hvor brugeren er involveret, både i forbindelse med graden af udviklingen af denne prototype og vil blive løst ved at gøre et skridt videre mod acommercial enhed. Pakningen af sorbenten fase gøres manuelt. Metoden blev imidlertid vist sig at være let og reproducerbar. Vi er overbeviste om, at engangs kolonner kunne produceres, hvis systemet blev produceret på et højere plan.
Sammenfattende har vi beskrevet en ny metode til at udføre SPE på en kompakt, automatiseret enhed. Vi har vist sit potentiale til analyse af vandprøver ved immunoassay ved beskrivelsen af et udtræk og præ-koncentration metode, der anvendes til påvisning af 17β-estradiol med et kommercielt ELISA-kit. Metoden er brugervenlig og omkostningseffektiv, og kunne i fremtiden blive anvendt på linje med biosensorer (arbejde i gang). Vi forventer vores platform vil gøre det muligt at udføre lignende fast fase ekstraktion procedurer på mere komplekse prøvematricer af stor relevans for overvågning af hormonforstyrrende stoffer, såsom mad eller urin. Vi er overbeviste om vores system vil understøtte anvendelsen af etablerede og kommende immuno-detektionsmetoder iinden for miljøanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 - 3,000 ng/L |
References
- Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
- Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
- Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
- Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
- Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
- Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
- Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
- Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
- Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
- Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
- Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
- Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
- Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
- Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
- Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).
