Summary
المقدمة هنا هو وصف موحد من التقنيات التي يمكن استخدامها لتطوير وتحويل وإدارة، واختبار بروتين تعبير مغاير للخميرة الخباز بروبيوتيك boulardii.
Introduction
الكائنات الحية الدقيقة بروبيوتيك وسيلة للفضول المحتملة للبكفاءة واقتصاديا تقديم البروتينات مغاير إلى الجهاز الهضمي. هذه الكائنات قادرة على قيد الحياة المرور عبر الجهاز الهضمي بعد لا استعمار النتيجة 1، مما الجرعات التي تسيطر عليها والحد من التعرض للدواء أعربت. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على مهندس بسهولة هذه الكائنات لإنتاج البروتين مغاير على نطاق واسع يجعل لهم بديل اقتصادي لجزيئات تسليم الاصطناعية. ومع ذلك، وضع مثل هذا النهج، كما ثبت مؤخرا باستخدام سلالة العوز الغذائي في خميرة بروبيوتيك boulardii 2، يتطلب معرفة التقنيات المخبرية لا جنبا إلى جنب تقليديا ضمن دراسة معينة، بدءا من الخميرة وعلم الأحياء الجزيئي لتقنيات التعامل مع الحيوانات وأساليب المناعية. وهكذا على الرغم من أن الإجراءات الفردية صفها هنا ليست في حد ذاتها جديدةبروتوكولات المختبر، والهدف من هذا المخطوط هو تقديم مقدمة موحد لالتقنيات اللازمة للاختبار التجريبي من الخميرة بروبيوتيك بوصفها وسائل إيصال المخدرات إلى الجهاز الهضمي الفئران. تقدم هو عبارة عن تجميع من بروتوكولات أساسية ل: 1) توليد سلالات متحولة بعامل نمائي من الخميرة التي يمكن بسهولة التلاعب بها وراثيا. 2) التحول من الثقافات الخميرة للتعبير عن بروتين مغاير. 3) إدارة الخميرة المؤتلف إلى الأمعاء من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم. و4) استعادة قابلة للحياة الخميرة بروبيوتيك المؤتلف من الأمعاء الفئران وتقييم بروتين تعبير مغاير لها.
أولا، على الرغم من أن العديد من الأساليب الإيجابية والسلبية اختيار جود للتلاعب أنواع من الخميرة، واختيار السلبية مثل من خلال استخدام علامات بعامل نمائي يزيد كلا من الكفاءة والسهولة التي الخميرة يمكن أن تتحول ومختارة. اختيار الإيجابية للtransformants باستخدام المضادات الحيوية، بالتعاونntrast، ويزيد بشكل كبير من تكلفة الخميرة التلاعب. وعلاوة على ذلك، يمكن اختيار من الخميرة على وسائل الاعلام الصلبة التي تحتوي على المضادات الحيوية تسمح لزيادة نمو المستعمرات الخلفية هو دون تغيير النسبية لاختيار من الخميرة بعامل نمائي على انخفاض الاصطناعية من وسائل الاعلام الصلبة (الملاحظات غير منشورة). الخميرة العوز الغذائي لسلالات التي تفتقر إلى الانزيمات الهامة لتركيب الأحماض الأمينية الأساسية أو اليوراسيل. هذه الخميرة يمكن أن تنمو إلا إذا استكملت مع الأيض في عداد المفقودين أو الجينات الأيض، مما يمكن اختيار السلبية عند مطلي الخميرة على انخفاض الاصطناعية من وسائل الإعلام التي تفتقر إلى التمثيل الأيضي الأساسي. العديد من خميرة تستخدم عادة سلالات مختبر الخباز هي في الواقع بالفعل طفرات العوز الغذائي 3. الصناعية والسريرية، وسلالات الخميرة بروبيوتيك، ومع ذلك، وعادة ما تكون بدئية الاغتذاء مع القدرة على تجميع كل العناصر الغذائية اللازمة. لتمكين التلاعب الجيني أكثر كفاءة هذه الخميرة، الجينات بعامل نمائي يمكن استهداف انتقائيلتوليد سلالات التي يمكن اختيارها دون المضادات الحيوية. استهداف معين من الجينات علامة بعامل نمائي يمكن أن يتحقق من خلال تعطيل الجينات بوساطة PCR-الاعتماد على إعادة التركيب مثلي أو أكثر في الآونة الأخيرة من خلال كريسبر / Cas9 تستهدف 4-6. بدلا من ذلك، يمكن أن الطفرات الأشعة فوق البنفسجية تولد بسرعة طفرات العوز الغذائي حتى في سلالات الخميرة التي تحول مع البلازميدات متعددة يصعب من الناحية الفنية 7. في حين وصفت PCR استهداف وكريسبر / Cas9 على نطاق واسع في أماكن أخرى، قدم في جزء واحد من هذا المخطوط هو بروتوكول مفصلة وصف نهج الطفرات الأشعة فوق البنفسجية لخلق سلالات بعامل نمائي من شأنها أن تسمح لاختيار السلبية بدلا من اختيار المضادات الحيوية الإيجابية من transformants الخميرة.
الخطوة الضرورية التالية في استخدام هذه السلالات بعامل نمائي للتسليم عن طريق الفم من بروتين مغاير هي خميرة التحول مع البلازميد. منذ التحول الناجح الأول من عمريspheroplasts ر ذكرت لخميرة الخباز في عام 1978 8، تم التعرف على العديد من التعديلات لزيادة الكفاءة والسهولة التي أنواع من الخميرة يمكن تعديلها وراثيا. استخدام Electroporation للللتحول الناجح من الحمض النووي في س. ووصف الخباز لأول مرة في عام 1985 (9) ومنذ ذلك الحين تم تحسينها من خلال إضافة حضانة 1 M السوربيتول إلى خلايا الدعم osmotically 10. وقد تبين كفاءة Electroporation للوعلاوة على ذلك تعتمد على أنواع من الخميرة والتوتر، عدد الخلايا ومرحلة النمو، وحجم Electroporation لل، والقوة الميدانية، ومخازن محددة 11. الليثيوم خلات (LiOAc) التحول، ووصف في الأصل من قبل إيتو وآخرون 12، من بين بروتوكولات التحول الأكثر شيوعا كما أنه لا يتطلب أي معدات خاصة. وأظهرت التحليلات الإضافية أن كفاءة LiOAc التحول الخميرة يزيد كثيرا عندما يتم جمع الخلايا في منتصف سجل مرحلةالنمو والحرارة صدمة في وجود البولي ايثيلين جلايكول (PEG) والحمض النووي في 42 ° C 12. حضانة من الخميرة سليمة كاملة مع PEG أمر ضروري للتحول كفاءة، ربما من خلال تحسين مرفق من الحمض النووي لغشاء الخلية وكذلك عن طريق التأثيرات الأخرى على الغشاء 13. كما الليثيوم نفسه يزيد من نفاذية خلايا سليمة (14). على الرغم من أن معظم المختبرات س. يمكن بسهولة سلالات الخباز أن تتحول باستخدام LiOAc التحول 3، أنواع الخميرة الأخرى قد تحولت بشكل أكثر كفاءة باستخدام بروتوكولات بديلة. Pichia pastoris، على سبيل المثال، هو الأكثر حولت بكفاءة عن طريق Electroporation للبدلا من LiOAc تحول 13. ومن الأهمية بمكان، بالتالي، لاختبار متعددة طرق التحول ولتحسين فترات الحضانة وتركيزات كاشف عند محاولة تعديل وراثيا سلالة الخميرة uncharacterized. وبالتالي هذا المخطوط يصف كل من LiOAc آرansformation و electroporation عن تقنيات لتحويل متحولة العوز الغذائي والنوع البري س. boulardii. وتوجه القراء المهتمين إلى الاستعراضات التي جرت مؤخرا لتوصيف دقيق لتطور خميرة التحول، بروتوكولات بديلة، وإجراء المزيد من المناقشات آليات العمل الممكنة 13،15. التحول من الخميرة مع ترميز البلازميد بروتين كشفها بسهولة ضروري علاوة على ذلك لاختبار المصب من أجل ضمان التعبير السليم وظيفة البروتين مغاير. يمكن اختيار البروتينات المختلفة لا تعد ولا تحصى تبعا للغرض النهائي للدراسة العلاجية والأجسام المضادة المتاحة للكشف عن البروتين immunoblotting، ELISA، وغيرها من التقنيات. بروتوكولات لهذه التقنيات قد تم وصفها بدقة في أي مكان آخر 16،17، ويمكن استخدامها لتحديد مستويات الإنتاج البروتين مغاير من الخميرة تتحول بالمقارنة مع منحنيات القياسية. لأغراض التظاهر ولاظهارإنتاج الناجح لبروتين يستخدم جدا عادة في الأحياء الخميرة، تقدم هذه المخطوطة التحول مع البروتين ترميز البلازميد فلوري الأخضر (GFP)، والذي يسمح للكشف لاحقا باستخدام المجهر مضان.
نفس القدر من الأهمية لإنتاج الكائنات الحية بروبيوتيك التي تعبر عن بروتين مغاير هو الإدارة السليمة والكشف عن هذه الكائنات الدقيقة داخل أنسجة الجهاز الهضمي، كما هو موضح في الأجزاء الثلاثة والأربعة. إدارة الخميرة المؤتلف من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم تسمح لتوريد كميات رقابة من الخميرة مباشرة إلى المعدة، والتي من C57BL / 6 الفئران غير قادرين على التقيؤ 18 بشكل طبيعي. ومع ذلك، غير لائق التعامل مع الحيوانات وأنبوب تغذية يمكن أن يؤدي إلى تلف المريء وثقب، انثقاب المعدة، وإدارة القصبة الهوائية، والالتهاب الرئوي التنفسي 19،20. تقنية الفقراء والخبرة يمكن أن تزيد علاوة على ذلك التباين في الاستجابات المناعية الفئران ودورة الفتشوب التجريبيةLTS، التي نسبت إلى إجهاد الحيوان على أنبوب تغذية عن طريق الفم 21،22. الممارسة في الأسلوب السليم يمكن أن يخفف بالتالي ليس فقط عدم الراحة الحيوان، ولكن يمكن أيضا زيادة دقة النتائج التجريبية. توضح هذه المخطوطة وتوضح التعامل مع الحيوانات وأنبوب تغذية عن طريق الفم لإعطاء جرعات تسيطر عليها من الخميرة المؤتلف.
وأخيرا، من المهم جدا لتأكيد التسليم الناجح الخميرة المؤتلف من خلال تحليل الأنسجة اللمفاوية وجود الخميرة والبروتينات مغاير. الأنسجة المناعية الجهاز الهضمي التي يمكن أن معظم بسهولة ومتوقع أن تدرس لوجود الخميرة هي البقع باير ل. بقع باير هي الأجهزة اللمفاوية الثانوية على طول الأمعاء الدقيقة التي هي المواقع الرئيسية من الاستجابة المناعية المخاطية تحريض 23. يتم نقل مولدات المضادات من التجويف transcellularly من خلال microfold (M) الخلايا في البشرة ويتم إطلاقها في البقع باير، وبالتالي فضح أرفقد مستضد الخلايا المعوية محتويات اللمعية. على الرغم من امتصاص الجسيمات عبر الظهارة المعوية يمكن أيضا أن يتحقق من الخلايا الكأسية، وقد ثبت أن هذه الخلايا أن تأخذ فقط حتى الجسيمات أقل من 0.02 ميكرون في القطر 24. تمديد التشعبات بطريق الظهارة من CD103 + الخلايا الجذعية (DC) أيضا تناول جزيئات صغيرة من الأمعاء التجويف 25. ومع ذلك، هناك حاليا أي تقارير التي تبين أن CD103 + البلدان النامية يستغرق جزيئات أكبر من البكتيريا. وهكذا، الخميرة بروبيوتيك سليمة، من الحجم المتوسط بين 3-6 ميكرون في القطر، من المرجح أن يتم تناولها من قبل الخلايا M وتحويلها إلى بقع على باير ل. وصفت هنا هو بروتوكول لجمع وفحص بقع باير لالخميرة المؤتلف قابلة للحياة، على الرغم من أن هذا الإجراء يمكن أيضا أن تتكيف بسهولة لتقييم امتصاص البكتيريا بروبيوتيك.
وباختصار، تقييم الخميرة بروبيوتيك المؤتلف للتسليمالبروتينات rapeutic إلى الأمعاء تتطلب إجادة في التقنيات المخبرية التي تمتد البيولوجيا الجزيئية إلى التعامل مع الحيوان وعلم المناعة. المقدمة هنا هي بروتوكولات ل1) توليد وفحص سلالات الخميرة بعامل نمائي والتي يمكن بسهولة اختيار سلبا بدون المضادات الحيوية، 2) بروتوكولات بديلة لتحويل الخميرة ويمكن التعبير عن بروتين مغاير، 3) مظاهرات تقنيات التعامل مع الحيوانات السليمة وأنبوب تغذية عن طريق الفم ل تسليم المعدي من الخميرة المؤتلف، و4) بروتوكولات لتشريح التصحيح باير والكشف عن الخميرة المؤتلف قابلة للحياة والبروتين مغاير وظيفية. جنبا إلى جنب، وهذه البروتوكولات يسمح لتوليد واختبار الخميرة سلالة الكائنات الحية المجهرية قادرة على تقديم البروتين العلاجي مغاير إلى الجهاز الهضمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الأشعة فوق البنفسجية الطفرات لتوليد العوز الغذائي سلالات الخميرة
- توليد منحنيات البقاء على قيد الحياة لتحديد الجرعات المطلوبة من الأشعة فوق البنفسجية
- إعداد YPD (خلاصة الخميرة ببتون سكر العنب) وسائل الاعلام والكواشف الأخرى المدرجة في الجدول 1 وفقا للاجراءات المتبعة 26 و تطعيم المستعمرات واحد إلى 5-10 مل من وسائل الاعلام YPD. احتضان الثقافات على طبل الأسطوانة عند 30 درجة CO / N من التشبع لا يقل عن 8 ساعة.
- تحديد تركيز خلية من الثقافات O / N باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق تمييع الخلايا 01:10 في المياه في كوفيت البلاستيكية. تمييع الخلايا إلى تركيز من 10 7 خلية / مل في 20 مل من الماء المقطر المعقم.
- صب الخلايا المخفف في البلاستيك طبق بتري معقمة و، مع إزالة الغطاء، وضع لوحة 14 سم تحت لمبة الأشعة فوق البنفسجية.
- كشف الخلايا التسلسلي 5000 μJ و 10،000 جرعات μJ من الأشعة فوق البنفسجية، واستخراج 500 ميكرولتر من الخلايا بعد كل زيادة مثل أن الخلايايتم أخذ عينات بعد التعرض ل0 μJ، 5000 μJ، 10000 μJ، 15000 μJ، 20000 μJ، 25000 μJ، 30000 μJ، 40000 μJ، و 50،000 μJ من الأشعة فوق البنفسجية. نقل استخراج عينات من الخلايا إلى العقيمة 1.5 مل الأنابيب وتمييع متسلسل في 01:10 الزيادات في الماء المعقم.
- بيليه الخلايا في كل تخفيف بواسطة الطرد المركزي في microcentrifuge في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة. نضح طاف و resuspend في حجم 100 ميكرولتر من المناسب الماء المعقم للتصفيح خلايا الخميرة. ماصة حجم كامل من الخلايا معلق على لوحات تحتوي على YPD وسائل الاعلام الصلبة واستخدام رش عقيمة لتوزيع بالتساوي الخلايا عبر كل لوحة.
- التفاف حواف لوحة في بارافيلم لمنع جفاف وسائل الإعلام وبطانات في رقائق الألومنيوم لمنع الصور تنشيط وإصلاح الطفرات المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية. احتضان لوحات رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام للسماح لنمو مستعمرات الخميرة قابلة للحياة (الشكل 1).
- عد العدد. dص من المستعمرات، اختياريا مع مساعدة من القلم إلى علامة من المستعمرات عدها، من ناحية عقد مكافحة الإلكترونية القلم، أو عداد الوقوف مع التكبير. مؤامرة كنسبة مئوية من مجموع الخلايا مطلي في كل جرعة μJ من الأشعة فوق البنفسجية لتوليد منحنى البقاء على قيد الحياة للخميرة المشع (الشكل 2).
ومن المتوقع أن يتطلب جرعات أقل من الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة لسلالات مضاعفا للوصول إلى نفس بقاء في المئة فرداني سلالات الخميرة: ملاحظة. سلالة من الخميرة تفتقر الوظيفية الإنزيمات إصلاح الحمض النووي، مثل rad1 س. الخباز متحولة، ويمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة إيجابية تدل على وجود أشعة فوق البنفسجية بجرعات منخفضة جدا. - تحديد جرعة من الأشعة فوق البنفسجية الطفرات لاستخدامها في فحص بالإشارة إلى منحنى بقاء أنشئت في 1.1.7. القيمة x نقطة على طول منحنى البقاء على قيد الحياة حيث ص يساوي 50 هي جرعة الأشعة فوق البنفسجية التي 50٪ من الخميرة البقاء على قيد الحياة. فحص المسوخ في هذا بقاء منخفض في المئة قد يؤدي إلىعائدات أعلى من السلالات المتحورة بنجاح، ولا سيما بالنسبة للخميرة مضاعفا. الجرعة البقاء على قيد الحياة 50٪ للWT س. boulardii، كما هو مبين في الشكل 2، ما يقرب من 18000 μJ.
ملاحظة: على الرغم من أن مثل هذه الجرعات العالية للأشعة فوق البنفسجية تزيد من احتمال حدوث الطفرات في جينات مسارات الخلوية الأخرى من الجين علامة العوز الغذائي من الفائدة، ويجب أن يكون هذا العيب متوازنة مع الحاجة للحث على الطفرات في نسختي الجين علامة العوز الغذائي. لسلالات فرداني التي نسخة جين واحد فقط يجب أن تحور، وفحص في البقاء على قيد الحياة العالي في المئة، مثل عند 90٪، يقلل من احتمال حدوث الطفرات إضافية ولا يزال يسمح لتوليد ما يكفي من طفرات العوز الغذائي.
- الطفرات الأشعة فوق البنفسجية والكشف عن سلالات الخميرة بعامل نمائي
- إعداد الخميرة كما هو موضح في الخطوات 1.1.1-1.1.3.
- كشف الخميرة لجرعة من الأشعة فوق البنفسجية الموافق 50٪ البقاء على قيد الحياة، كما هو محدد في 1.1.8. لWT س. boulardii، هذه الجرعة واق العزم على أن ما يقرب من 18،000 μJ (الشكل 2).
- جمع 1 مل كميات من الأشعة فوق البنفسجية معرضا للاشعاع الخميرة وبيليه بواسطة الطرد المركزي في microcentrifuge في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة. طاف و resuspend الخلايا نضح في 100 ميكرولتر الماء المعقم.
- اختيار من المسوخ
- في حالة استخدام اختيار مثل مع ura3 - طفرات العوز الغذائي، لوحة معرضا للاشعاع الخميرة على وسائل الإعلام التي تحتوي على حمض 5-fluoroorotic (5 FOA) لتحديد الخلايا التي تفتقر إلى إنزيم Ura3 وظيفية.
ملاحظة: أي الخميرة التي تحتوي على نسخ الوظيفية Ura3 تحويل 5 FOA إلى السم 5 فلورويوراسيل، مما يؤدي إلى موت الخلايا ويسمح لسهولة اختيار ura3 - المستعمرات التي تفتقر إلى ظيفية Ura3 27. نهج اختيار مماثلة ممكنة لLYS2 وLYS5، علامات وMET2 وMET15 باستخدام وسائل الإعلام التي تحتوي على حمض α aminoadipic 28؛ TRP1. 5-الفلوريةحمض anthranilic 29؛ و30،31 ميثيل الزئبق، على التوالي. - ماصة 100 ميكرولتر من الخلايا معلق على الحد الأدنى من وسائل الإعلام التي تحتوي على 5 FOA واستخدام رش عقيمة لبالتساوي معطف لوحة. التفاف لوحات في بارافيلم واحتضان رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام للسماح لنمو مستعمرات الخميرة قابلة للحياة.
- تأكيد ura3 - النمط الظاهري من أي مستعمرة تظهر على 5 FOA لوحات من restreaking على YPD، اليوراسيل - ولوحات 5 FOA (الشكل 3). استخدام غيض من مسواك العقيمة لجمع جزء من مستعمرة واحدة ثم اسحب بلطف الخلايا عبر YPD جديدة، اليوراسيل - وألواح 5 FOA. مرة أخرى احتضان لوحات ملفوفة رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام.
ملاحظة: سوف تظهر المستعمرات قابلة للحياة كما أثيرت، ما يقرب من زوائد دائرية في حين أن الخلايا غير قابلة للحياة سوف تظهر فقط باعتبارها تشويه مبهمة من دون أي زوائد رفعت (الشكل 3).
- في حالة استخدام اختيار مثل مع ura3 - طفرات العوز الغذائي، لوحة معرضا للاشعاع الخميرة على وسائل الإعلام التي تحتوي على حمض 5-fluoroorotic (5 FOA) لتحديد الخلايا التي تفتقر إلى إنزيم Ura3 وظيفية.
- قرار مجلس الأمنeening من المسوخ
- إذا توليد متحولة العوز الغذائي الذي طرق اختيار غير متوفرة، وإعداد مسلسل 1:10 التخفيفات من الأشعة فوق البنفسجية معرضا للاشعاع خلايا الخميرة في الماء المعقم وماصة التخفيفات على وسائط YPD، وذلك باستخدام مفرشة معقمة لبالتساوي معطف لوحة.
- التفاف لوحات في بارافيلم واحتضان رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام. تحديد أي تخفيف يسمح لنمو المستعمرات الفردية التي يمكن بسهولة تمييزها عن بعضها البعض، وعادة ما لا يزيد عن حوالي 100 المستعمرات في لوحة.
- الطفرات الأشعة فوق البنفسجية كرر العينات الخميرة كما هو موضح في 1.2.1-1.2.3 ولوحة الخلايا في هذا التخفيف العزم. ماصة الخميرة المخفف على وسائط YPD، واستخدام رش عقيمة لتوزيع الخلايا، واحتضان لوحات ملفوفة رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام.
- الشاشة لauxotrophs بواسطة الطلاء نسخة على وسائط انتقائية تفتقر المستقلب من الفائدة. أولا، تأمين وسادة مخملية معقمة على موقف لوحةوعكس لوحة مع الأشعة فوق البنفسجية المستعمرات المشع على المخمل، بمناسبة التوجه لوحة.
- بعد ذلك، عكس لوحة جديدة تفتقر المستقلب من الفائدة على المخمل وبخفة اضغط لأسفل لنقل الخلايا من المخمل إلى اللوحة. متجر لوحة أصلية في 4 درجات مئوية. التفاف واحتضان لوحة جديدة رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام.
- كبديل لطلاء طبق الاصل، المسوخ الشاشة عن طريق المستعمرات إعادة تسليط الضوء-من YPD على وسائط انتقائية. استخدام غيض من مسواك العقيمة لجمع جزء من مستعمرة واحدة وبلطف سحب الخلايا عبر لوحة YPD الطازجة وطبق تفتقر المستقلب من الفائدة. مرة أخرى احتضان لوحات ملفوفة رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-4 أيام.
يجب الحرص على اختيار المستعمرات واحد ومسحة من المستعمرات عدة مرات للتأكد من السكان متجانسة من الخلايا بعامل نمائي الحقيقية: ملاحظة.
- اختيار من المسوخ
- مزيد من تأكيد النمط الظاهري للخلايا المشع inoculatجي المستعمرات واحد إلى 5-10 مل من كل من YPD وسائل الإعلام التي تفتقر إلى المستقلب المناسب (على سبيل المثال، في اليوراسيل - وسائل الإعلام لura3 - متحولة). احتضان على طبل الأسطوانة عند 30 درجة CO / N لتأكيد نمو الخلايا في وسائل الإعلام YPD ولكن ليس في غياب الأيض.
ملاحظة: على الرغم من أن أنماط النمو على وسائل الاعلام الصلبة وينبغي أن تبين بوضوح الخميرة الوضع العوز الغذائي، فمن الممكن لبعض الخميرة على تحمل الضغوط وتشكيل الصغيرة، والمستعمرات بطيئة النمو على وسائل الاعلام الصلبة لكن حتى الآن لم تحمل نفس الشروط في وسائل الإعلام السائل (الملاحظات غير منشورة). ولذلك، ينبغي إجراء التلقيح في الثقافات السائلة على التأكد تماما أنماط النمو من الأشعة فوق البنفسجية المشع المسوخ. - للتخزين على المدى الطويل من طفرات العوز الغذائي أكد وإعداد مخزون الجلسرين من الخلايا بتلقيح إلى 10 مل YPD واحتضان على يا بكرة طبل / N عند 30 درجة مئوية. خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 2500 x ج ونضح وسائل الإعلام. Resuspend الخلايا في 50٪معقم الجلسرين تصفيتها، ونقل إلى cryovial، ومخزن في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: الأشعة فوق البنفسجية mutagenized الخميرة يحتمل أن تحتوي على طفرات في جينات متعددة أخرى مما كانت عليه في علامة بعامل نمائي من الفائدة. قبل المتابعة مع استخدام طفرات العوز الغذائي التحقق منها، وينبغي مواصلة تحليل هذه السلالات من خلال التسلسل الجيني وتقييم مقاومة لدرجة الحموضة، وتؤكد حمض الصفراء، وغيرها من الخصائص ذات الصلة إلى سلالات بروبيوتيك، كما هو موضح في مكان آخر (2). بالإضافة إلى ذلك، استخدام التماثل PCR أو كريسبر / Cas9 استهداف ليتحور بشكل أكثر انتقائية ينبغي اعتبارها بديلا للأشعة فوق البنفسجية الطفرات 4 علامات بعامل نمائي - 6.
التحول 2. الخميرة
- LiOAc التحول من الخميرة
- تطعيم مستعمرات الخميرة واحدة إلى 5-10 مل من وسائل الاعلام YPD واحتضان على طبل الأسطوانة عند 30 درجة CO / N.
- للحث على نمو المرحلة سجل وزيادة كفاءة امتصاص البلازميد، ديتيرمينى تركيز الخلية باستخدام معمل لقياس 1:10 التخفيف من الخلايا في الماء المعقم في كفيت بلاستيكية. تمييع O / N الثقافات إلى OD 600 من 0،16-،2 (حوالي 2 × 10 6-2،5 × 10 6 خلية / مل) في 50 مل من YPD الطازج الحار واحتضان الخلايا على شاكر منصة المداري المقرر أن 200 دورة في الدقيقة وحتى الثقافة تصل إلى ما يقرب من 1 × 10 7 خلية / مل، عادة حوالي 4 ساعات.
ويمكن قياس كفاءة التحول بوصفها وظيفة من عدد وحدات الخميرة مستعمرة تشكيل تحولت بنجاح (كفو) في ميكروغرام من البلازميد: ملاحظة. زيادة كفاءة النتائج في مستعمرات أكثر تتحول في ميكروغرام من البلازميد. Subculturing خلايا الخميرة وجمع خلال مرحلة النمو السجل هو أحد العوامل التي تزيد من كفاءة تحويل 12. - بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 3 دقائق.
- نضح طاف ونقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل عن طريق إعادة التعليق على بيلوآخرون في 1 مل من الماء المعقم.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة في microcentrifuge، نضح في وطاف غسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق العازلة في 1 مل TE / LiOAc (تريس EDTA LiOAc).
- كرر خلايا الطرد المركزي و resuspend العازلة في TE / LiOAc إلى تركيز 2 × 10 9 خلايا / مل.
- تحضير مخاليط التحول مع كل من العناصر التالية: 50 ميكرولتر من الخميرة مستعدة في المخزن TE / LiOAc، 5 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل (10 ميكروغرام / ميكرولتر)، و 1 ميكرولتر من البلازميد (1 ميكروغرام). ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد قد يكون معاير عن زيادة كميات من الحمض النووي قد يؤدي أو لا يؤدي إلى زيادة كفاءة تحويل 32
ملاحظة: للحصول على سلالة الخميرة متحولة تفتقر إلى علامة بعامل نمائي واحد، البلازميد واحد فقط ترميز علامة يمكن أن تتحول في العينة. وعلاوة على ذلك، استخدام ترميز البلازميد بروتين اكتشافها بسهولة، مثل GFP، سوف تسمح لتحديد كفاءة للطي السليم والتعبير عن العلاقات العامة مغايرotein من سلالة الخميرة لاحقا إلى التحول. - لكل إعداد، إضافة 300 ميكرولتر من PEG / LiOAc / TE ودوامة تماما. حضانة خلايا سليمة مع PEG أمر ضروري لكفاءة تحويل 13.
- احتضان الاستعدادات عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الإثارة عن طريق وضع أنابيب microcentrifuge في كوب وضعت على منصة شاكر المداري في 200 دورة في الدقيقة.
- إضافة 35 ميكرولتر من DMSO إلى كل رد فعل والصدمة الحرارية الخلايا لمدة 15 دقيقة في 42 ° C حمام الماء. ورغم أن هناك تقارير متضاربة من فائدة إضافية تتمثل في DMSO 33، وقد تبين الصدمة الحرارية من خلايا الخميرة سليمة لزيادة كبيرة في كفاءة تحويل 12.
- غسل الخلايا عن طريق التكوير عن طريق الطرد المركزي كما هو الحال في 2.1.5، الشفط أو pipetting لمن طاف، وإعادة التعليق في 1 مل من الماء المعقم. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لتفريق بيليه الخلية.
ملاحظة: فمن الأهمية بمكان لإزالة تماما طاف لأن استخدام وسائل الإعلامد في توليد خلايا المختصة يمكن أن تمنع نمو الخميرة وتشكيل مستعمرة. - كرر التكوير خلية كما هو الحال في 2.1.5، نضح طاف، و resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر الماء المعقم. ماصة حجم الكامل على طبق من ذهب انتقائية واستخدام رش العقيمة إلى معطف بالتساوي لوحة مع الخميرة تحويلها.
- التفاف حواف الصفائح المطلية في بارافيلم لمنع جفاف وسائل الإعلام واحتضان رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2 أيام للسماح لنمو خلايا الخميرة تحول. ناجح، والتحول الفعال واختيار بعامل نمائي من خميرة الخباز ينتج عدد كبير من المستعمرات في إعداد التحول، على الرغم من أن العائد يمكن أن يكون أقل من ذلك بكثير لسلالات أخرى (الشكل 4).
- لوحات متجر الخميرة على المدى القصير (عادة 1-3 أسابيع) رأسا على عقب وغطت في 4 درجات مئوية. إعداد مخزون الجلسرين من الخميرة تتحول كما هو موضح في 1.2.5 لتخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: لمزيد من الدراسات اختبار تحولت CFU ضرورية لتحديد الاستقرار البلازميد وتقييم التعبير الصحيح من البروتين مغاير. أوصاف دقيقة للاستقرار البلازميد 34، واستخدام immunoblotting للكشف عن البروتينات التشويه والتحريف تعافى من عينات خلية 17، انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) للكشف عن مطوية بشكل صحيح ثلاثة بروتينات الأبعاد 16، واستخدام GFP في الدراسات الخميرة 35 متاحة في أي مكان آخر. الشكل 6 يظهر صورة ممثل التعبير GFP ناجحة في S. حولت الخباز بالنسبة لخلايا هو دون تغيير. استخدام هذا البروتين الفلوري يعتبر وسيلة واحدة لتحديد كفاءة الناجح إنتاج البروتين مغاير.
- Electroporation للمن الخميرة
- تطعيم مستعمرات الخميرة واحدة إلى 5-10 مل من وسائل الاعلام YPD واحتضان على طبل الأسطوانة عند 30 درجة CO / N.
- تحديد تركيز الخلية باستخدام معمل لقياس 1:10 التخفيف من الخلايا في الماء المعقم. ديالثقافات العود O / N في 100 مل جديدة وسائل الاعلام YPD الحارة إلى OD 600 أي ما يعادل حوالي 0.3. احتضان الثقافات الفرعية في 30 درجة مئوية على مجموعة منصة شاكر المداري إلى 200 دورة في الدقيقة حتى التوصل الى OD 600 من حوالي 1.6، عادة 4-5 ساعة. وكل ثقافة فرعية 100 مل توليد خلايا مكيفة يكفي لمدة سنتين ردود فعل التحول.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 3 دقائق. نضح طاف وغسل الخلايا عن طريق إعادة التعليق في 50 مل جليد الماء المعقم البارد. تكرار غسل كتبها التكوير الخلايا، الشفط طاف، وإعادة التعليق في 50 مل جليد الماء المعقم البارد النقي.
- بيليه الخلايا مرة أخرى و resuspend في 50 مل كريم عازلة Electroporation للالباردة (1 M السوربيتول، 1 ملم CaCl 2).
- كرر تدور كما هو الحال في 2.2.3، طاف نضح، والخلايا resuspend في 20 مل 0.1 M LiOAc / 10 ملي DTT. احتضان تعليق الخلية على طبل الأسطوانة عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حضن مسبق من الخلايا في LiOAc وDTT تآزر يزيد منكفاءة Electroporation لل36.
- بيليه الخلايا كما هو الحال في 2.2.3، وإزالة طاف، وتغسل عن طريق إعادة التعليق في 50 مل كريم عازلة Electroporation للالباردة. كرر خلايا الطرد المركزي و resuspend في الجليد عازلة Electroporation للالباردة إلى الحجم النهائي من 1 مل.
- إعداد على الجليد: مكيفة خلايا الخميرة، cuvettes Electroporation للمعقمة، والبلازميد. فورا بعد إعادة تعليق النهائي من خلايا مكيفة في المخزن Electroporation لل1 مل، والجمع بين 400 ميكرولتر خلايا الخميرة مكيفة مع ما يقرب من 1 ميكروغرام من البلازميد وإضافة إلى الجليد الباردة 0.2 ميكرون كفيت electroporation. استخدام كميات متزايدة من الحمض النووي قد يزيد قليلا كفاءة تحويل 11. احتضان رد فعل على الجليد لمدة 5 دقائق، ثم electroporate مع مجموعة electroporator إلى 2.5 كيلو فولت و 25 μF.
ملاحظة: كما هو موضح في 2.1.7، الخميرة سلالة متحولة تفتقر إلى علامة بعامل نمائي واحدة يمكن أن تتحول مع البلازميد واحد فقط ترميز علامة تحور في العينة. أيضا، وذلك باستخدامالبلازميد الذي يشفر بروتين كشفها بسهولة مثل GFP يسمح لتحديد كفاءة للطي السليم والتعبير عن بروتين مغاير لاحقا إلى التحول. - نقل electroporated الخلايا في 8 مل من 1: 1 خليط من YPD: 1 M السوربيتول وتسمح للخلايا لاحتضان على طبل الأسطوانة عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- بيليه الخلايا كما هو الحال في 2.2.3 و resuspend في 100 ميكرولتر 1: 1 YPD: 1 M السوربيتول. لوحة حجم الكامل على وسائط انتقائية تحتوي على 1 M السوربيتول، والتفاف حواف الصفائح في بارافيلم، واحتضان لوحات رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2-5 أيام للسماح لنمو خلايا الخميرة تحول.
ملاحظة: فمن الأهمية بمكان أن اختبار الخميرة تتحول إلى تقييم التعبير الصحيح من البروتين مغاير، كما هو موضح في 2.1.14 و2.2.7.
3. بالتزقيم عن طريق الفم من الفئران مع الخميرة المحولة
- تنفيذ كافة إجراءات رعاية الحيوانات والتعامل معها وفقا لدليل لرعاية واستخدام مختبر أحدimals والحيوان الرعاية المؤسسية وموافقة اللجنة الاستخدام.
- إعداد الثقافات O / N الخميرة، فحقن المستعمرات واحد من الخميرة بعامل نمائي تتحول إلى 5-10 مل من وسائل الاعلام انتقائية. احتضان الثقافات O / N لا يقل عن 8 ساعة على طبل الأسطوانة عند 30 درجة مئوية حتى المشبعة.
ملاحظة: استخدام ترميز البلازميد البروتينات اختبار مثل GFP تسمح لسهولة البروتين اختبار التعبير في الخميرة gavaged، كما هو موضح في 4.7. - لتحريض القصوى التعبير البروتين وللحث على النمو مرحلة السجل، وإعداد ثقافات فرعية من O / N الثقافات عن طريق تمييع إلى OD 600 أي ما يعادل حوالي ،16-،2 في 50 مل من وسائل الاعلام المناسب كما هو موضح في 2.1.2.
- تحديد تركيز خلايا subcultured كما هو الحال في 1.1.2 وضبط 10 9 خلية / مل. إعداد جرعة 100 ميكرولتر لكل الماوس، مع بضع مئات من حجم اضافية ميكرولتر لكل مجموعة لتحسين دقة وسهولة تحميل عينة.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2500 x ج ل3 دقائق أو في microcentrifuge في 16000 x ج لمدة 1 دقيقة. نضح وطاف Resuspend الخلايا بإضافة حجم مساو من الماء المعقم وpipetting صعودا وهبوطا بلطف.
- إصلاح إبرة قياس أنبوب تغذية مناسبة (22 G لمدة 15-20 ز الفئران) على 1 مل العقيمة حقنة وتحميل الخميرة عينة، ويجري التأكد من القضاء على أي فقاعات ووضع المكبس إلى زيادة 100 ميكرولتر. تحميل حقنة إضافية مع الماء المعقم إلى السيطرة على الفئران أنبوب تغذية والتحقق من وجود أي الخميرة فاسد.
- التقاط الماوس ليكون gavaged استخدام اليد غير المسيطرة، مع السبابة والإبهام استيعاب بإحكام الجلد حول الرقبة (الشكل 6A). دس الذيل تحت الاصبع الصغير لمنع الحركة من الجزء السفلي من الجسم. تأكد من أن قبضة آمنة وتحظر الماوس من التحرك رأسه من أجل منع تلف الأنسجة الداخلية خلال تسمين.
ملاحظة: تقدير مدى ضرورة إدخال الإبرة أنبوب تغذية عن طريق الضغط على إبرة ضد الماوس بحيثلمبة هو حتى مع عملية الخنجري من القص. وبإدراج هذا طول الإبرة يسمح عادة لمبة أنبوب تغذية الإبرة ليدخل إلى جوفه. - باستخدام يدك المهيمنة، تضاف برفق الإبرة أنبوب تغذية في المريء الماوس عن طريق زيارة خاطفة الإبرة على طول سقف الفم والجزء الخلفي من الحلق، وحفظ قليلا إلى يسار الوسط. انتظر الماوس لابتلاع لمبة من الإبرة والسماح للإبرة لينزل أبعد قليلا إلى نقطة يقدر في 3.7 (الشكل 6B). إذا شعرت أي مقاومة أثناء إدخال الإبرة بالتزقيم أو إذا الماوس في أي وقت يبدأ في اللحظات، وإزالة بلطف الإبرة ومحاولة للعثور على المريء مرة أخرى.
- بعد الماوس قد ابتلع لمبة من الإبرة أنبوب تغذية، خفض بلطف المكبس حقنة لإدارة 100 ميكرولتر (10 8 كفو) من الخميرة مباشرة إلى المعدة الماوس.
ملاحظة: على الرغم من الفئران غير قادرة على القيء أي من الحل gavaged بعد تناوله 18،19 21،37. الإدراج الصحيح للإبرة أنبوب تغذية، وكذلك ضبط مستوى الصوت واللزوجة من الحل، يمكن أن تساعد في الحد من الجزر وضمان الجرعات دقيقة. - بعناية إزالة الإبرة أنبوب تغذية من المعدة الماوس والمريء وعودة الماوس إلى القفص. تأكد من أن الماوس يتنفس ويتحرك بشكل طبيعي بعد أنبوب تغذية للتأكد من أن الإبرة بالتزقيم تم إدراج بشكل صحيح في جميع أنحاء الداخلي والذي يستنشق أي حل.
4. حصاد بقع الفئران باير وعزل المستعمرات الخميرة الصالحة
- في الوقت المناسب بعد نقطة أنبوب تغذية، وعادة 4 ساعات، وافقت الفئران التضحية باستخدام IACUC الأساليب. تحقق من عدم وجود استجابة بعد قرصة أخمص القدمين، واستخدام مقياس الثانوية مثل خلع عنق الرحم للتضحية الماوس. ويمكن أيضا اختبار نقطة زمنية إضافية، حيث أظهرت العديد من الدراسات أن كفاءة وتوقيت تصلاتخاذ عبر الظهارة هي الجسيمات التي تعتمد 38،39.
- وضع الماوس مع البطن تتعرض بشكل كامل وتعقيم منطقة البطن عن طريق الرش مع 70٪ ETOH. جعل شق عرضية من خلال الفراء والجلد مع مقص، والحرص على عدم الاضرار بأي الأنسجة الداخلية. نقب يدويا شق فتح المزيد لفضح الصفاق، بطانة المصلي رقيقة تغطي أعضاء البطن. رفع بلطف الصفاق وجعل شق عرضي لفضح الأمعاء.
- بعناية واستخدام الملقط حادة لإثارة الأمعاء الدقيقة بعيدا عن الشرايين المساريقي، والدهون، والأنسجة الأخرى. كشف الأمعاء الدقيقة من المعدة، في الربع العلوي الأيسر من البطن الماوس، لالأعور، وجيب كبير من الأنسجة المعوية في بداية الأمعاء الغليظة.
- عزل البقع باير من خلال النظر لمدة 1-3 ملم بقع دائرية تقريبا من الأنسجة مبهمة على طول الأمعاء الدقيقة (الشكل 7). عن طريق المصارف الإنمائية المتخصصة تشريح المنحنيسورس، قطع قبة التصحيح باير، وترك هامش للتأكد من أن أيا من المحيط الصفيحة المخصوصة التي يتم جمعها.
ملاحظة: معظم الفئران لديها ما بين 4-8 بقع باير مرئية بسهولة. وتنفيذ الإجراء في منطقة مع الإضاءة العلوية المباشرة زيادة السهولة التي بقع باير ويمكن تصور. - وجمع تشريح بقع باير في كامل Iscove لتعديل وسائل الإعلام (IMDM) Dulbecco و.
ملاحظة: فمن الأهمية بمكان أن استخدام تقنية معقمة وتشمل المضادات الحيوية في وسائل الإعلام جمع من أجل منع التلوث الجرثومي المعوي لوحات الخميرة. - بقع سلالة باير من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر من أجل القضاء على وسائل الاعلام جمع. بقع الغسيل باير مع IMDM كاملة جديدة خلال أنبوب 50 مل واستخدام المكبس من حقنة 1 مل لكسر برفق البقع باير ل. بيليه الخلايا المتوترة بواسطة الطرد المركزي عند 1800 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق. نضح طاف و resuspend الخلايا فيالحجم النهائي من ما يقرب من 100 ميكرولتر.
- تطبيق خلايا المتوترة على وسائط الخميرة انتقائية واستخدام رش لوحة لتوزيع بالتساوي الخلايا. التفاف حواف لوحة في بارافيلم واحتضان لوحات رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 2 أيام للسماح لنمو أي الخميرة قابلة للحياة تعافى من البقع باير الفئران و.
ملاحظة: مزيد من الدراسات بعد الشفاء من الخميرة من بقع باير "ضرورية للتأكد من أن سلالات قادرة على تقديم مطوية بشكل صحيح البروتين مغاير لهذه الأنسجة المناعية. كما هو موضح في 2.1.14، ويمكن أن تشمل هذه الأساليب immunoblotting، ELISA، أو المجهري مضان للكشف عن البروتينات الفلورية مثل GFP 2،40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
جيل من منحنى البقاء على قيد الحياة بعد اشعة فوق البنفسجية يتطلب الطلاء من خلايا الخميرة المخفف بحيث مستعمرة مميزة (كفو) قادرة على تشكيل. كل عينة 500 ميكرولتر التي تم جمعها على النحو المبين أعلاه يحتوي على حوالي 5 × 10 6 خلايا. ومع ذلك، أكثر من 100 المستعمرات في لوحة يصعب التمييز بدقة. تصفيح عينة غير مخفف وكذلك مسلسل 1:10 التخفيفات من خلايا المشع مما يضمن كفو يمكن حصرها في كل جرعة الأشعة فوق البنفسجية، كما هو موضح في الشكل 1. وكفو العد، مضروبا في عامل التخفيف، ثم يتم مقسوما على العدد الكلي لل خلايا المشع الأصلية في كل عينة 500 ميكرولتر من أجل تحديد بقاء في المئة في كل جرعة. ويبين الشكل 2 النسبة المئوية محسوبة من النوع البري مضاعفا س. خلايا boulardii قادرة على البقاء على قيد الحياة 0 μJ، 5000 μJ، 10000 μJ، 15000 μJ، 20000 μJ، 22500 μJ، 25000μJ، 35000 μJ، و 50،000 μJ. وتضع هذه البيانات منحنى واضح يمكن استخدامها للعثور على جرعة الموافق 50٪ البقاء على قيد الحياة.
بعد اختيار جرعة الأشعة فوق البنفسجية والإشعاع من خلايا الخميرة، فمن الأهمية بمكان أن المستعمرات شاشة متحولة لتأكيد عدم وجود الجين علامة العوز الغذائي وظيفية. استخدام أسلوب الاختيار، كما هو موضح في 1.2.3.1 وهو مبين في الشكل (3)، ويزيد بشكل كبير من كفاءة تأكيد النمط الظاهري. يظهر مثال من اختيار URA3 أن يستفيد من تحويل 5 FOA إلى السم 5-FU التي كتبها Ura3 سليمة. هي نهج مماثلة متوفرة للLYS2 وLYS5، TRP1، وMET2 وMET15 وزيادة كفاءة الاختيار لهذه الطفرات. يجب الحرص على اختيار المستعمرات الفردية أثناء الفرز. نمو ثابت من المستعمرات متحولة على YPD و 5 FOA، ولكن ليس اليوراسيل -، لوحات indicatوفاق النمط الظاهري العوز الغذائي.
ويبين الشكل 4 كفاءة التحول لنوع البرية س. boulardii (بينالي الشارقة) نسبة إلى أحد المختبرات التي تستخدم عادة S. الخباز سلالة (بكالوريوس) باستخدام كل من LiOAc (LiOAc) و electroporation التقنيات (الكهربائية). على الرغم من أن LiOAc تحول فعال جدا لس. الخباز، كفاءة التحول للس. تم تحسين boulardii إلى حد كبير باستخدام Electroporation للالشكل استخدام البرامج 5 من المجهري مضان كطريقة سبيل المثال تحليل بروتين تعبير مناسب من الخميرة تحويلها. Brightfield (A) ومضان ترد (B) وصور للس. الخباز تحولت مع URA3 البلازميد ترميز GFP، مما يدل التعبير الوظيفي للبروتين مغاير من الخميرة تحويلها. الخلايا يمكن أن يجمد لتحسين التصور باستخدام coverslips المغلفة في كونكانافالين ألف (معطف 5 ميكرولتر من 2ملغ / مل محلول المخزون في الماء على كل ساترة 22 × 22 ميكرون والهواء الجاف).
ويبين الشكل 6A على C57BL 6 الماوس / عقدت للتو قبل للتسمين عن طريق الفم. من ناحية القبضات الظهر والرقبة من الفأرة هذا اعتقادا راسخا بأن الماوس غير قادر على تحريك الرأس في أي اتجاه. يسمح هذا عقد الإبرة أنبوب تغذية لتوضع بدقة ومع انخفاض مخاطر التعرض لتلف الأنسجة. ويبين الشكل 6B الإبرة أنبوب تغذية عقده عقب الماوس يبتلع الإبرة تسمين. بعد فترة الحضانة، والأمعاء الدقيقة من الفأرة التضحية يجب أن يكون مثار بعناية بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها، كما هو مبين في الشكل (7). ويسمح هذا التلاعب لسهولة تحديد بقع باير وللتشريح نظيفة من البقع دون تقاضي أية المحيطة بها الصفيحة المخصوصة. وأخيرا، ويبين الشكل 8 الانتعاش نموذجي قابلة للحياة الخميرة كفو من بقع باير ل.
جدول القائمة 1. الكواشف. صفها هي الكواشف اللازمة لجعل كل الحلول، وسائل الإعلام الخميرة ولوحات، ومخازن التحول المستخدمة في البروتوكولات في هذه المخطوطة.
الشكل 1. المستعمرات الخميرة نمت على وسائل الإعلام YPD. مثال YPD لوحة تظهر مستعمرة قابلة للحياة وحدة (كفو) من ص تشكيلالخميرة robiotic بعد اشعة فوق البنفسجية. وكانت مخففة خلايا بشكل متسلسل بحيث الفردية كفو يمكن تمييزها وفرزها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. منحنى البقاء على قيد الحياة للخميرة بروبيوتيك مضاعفا. عدد S. قابلة للحياة وقد تآمر boulardii كفو كنسبة مئوية من مجموع الخلايا مطلي لكل جرعة μJ من الأشعة فوق البنفسجية (خط الصلبة). الخط الأحمر العمودي يشير إلى μJ الأشعة فوق البنفسجية جرعة الموافق 50٪ بقاء هذه السلالة الخميرة. ومتحولة الخباز rad1 S.، التي لا يمكن إصلاح الأضرار الناجمة عن الطفرات الأشعة فوق البنفسجية، ويظهر كعنصر تحكم (خط متقطع). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </ أ>
الشكل 3. تأكيد ura3 - النمط الظاهري من الأشعة فوق البنفسجية المشع الخلايا على YPD، اليوراسيل -، و 5 FOA لوحات الخلايا من المستعمرات متحولة للأشعة فوق البنفسجية الفردي جمعت باستخدام غيض من مسواك العقيمة وبلطف يشوبه عبر YPD، اليوراسيل -، و 5 لوحات -FOA. وقد يشوبه الخلايا أولا في خطين معبر عمودي، ثم تم استخدام مسواك جديد لتمرير من خلال السطر الثاني ومواصلة نشر الخلايا حتى الخلايا الفردية منفصلة. وura3 صحيح - متحولة (موت) ينمو على وسائل الإعلام YPD وبحضور 5 FOA، ولكن ليس في غياب اليوراسيل. السيطرة ura3 - S. الخباز (ura3 -) وURA3 + سوب> S. وتظهر boulardii (URA3 +) للمقارنة وتأكيد الإعداد المناسب من وسائل الإعلام الخميرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. التحول كفاءة سلالات خميرة. نوع البرية س. boulardii (بينالي الشارقة) ومختبر س. تحولت الخباز سلالة (بكالوريوس) باستخدام LiOAc وصف (LiOAc) و electroporation البروتوكولات (الكهربائية). يتم رسم نتائج التي تم الحصول عليها يعني كفو في ميكروغرام البلازميد ترميز علامة مقاومة كانامايسين. وتشير الأشرطة إلى متوسط التجارب المكررة مع أشرطة الخطأ تصور الخطأ المعياري للمتوسط.وفاق / ftp_upload / 53453 / 53453fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. الوظيفي التعبير البروتين من الخميرة المحولة. س. وقد تم تحليل الخباز تحولت مع البلازميد فارغة (A) وGFP ترميز البلازميد (ب) باستخدام مجهر فلوري. مضان في خلايا الخميرة تحولت مع البلازميد GFP يشير الانتاج الناجح لGFP وظيفية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. التعامل الصحيح من C57BL / 6 الماوس لأنبوب تغذية عن طريق الفم. الفأر هو عقد tightlذ في يد غير المهيمنة مع الذيل مدسوس تحت الاصبع الصغير حتى لا حركة ممكنة (A). يتم إدخال إبرة أنبوب تغذية في البلعوم على طول سقف الفم. يسمح الماوس لابتلاع لمبة من الإبرة أنبوب تغذية، والسماح للحل لثم يدخل إلى جوفه كما الغطاس هو الاكتئاب (B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. إعداد وتشريح بقع باير ل. يظهر الأمعاء الدقيقة تشريح بعيدا عن الأعضاء الداخلية الأخرى والأنسجة، مع أسهم تشير إلى عدد قليل من البقع باير ل. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيرسيعلى هذا الرقم.
الرقم 8. الخميرة الشفاء من بقع باير ل. مثال كفو قابلة للحياة الكشف عن بعد التشريح، والتجانس، والطلاء الخلايا التصحيح الكلي باير لمن ماوس gavaged مع س. boulardii. كانت مطلية الخلايا على وسائل الإعلام الخميرة YPD والمحتضنة في 30 درجة مئوية لمدة 2 أيام. العائد نموذجي من كفو تعافى في الماوس أقل من 10. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معا، وبروتوكولات تصف الوثيقة الخطوات الأساسية اللازمة لتطوير واختبار بعامل نمائي سلالات الخميرة بروبيوتيك للتسليم من البروتين العلاجي مغاير إلى الأمعاء. هذا التلاعب واختبار الخميرة بروبيوتيك المؤتلف يتطلب تقنيات والموارد التي أي مختبر الفردية حاليا قد لا تكون مألوفة. وهكذا، على الرغم من أن العديد من الدراسات السابقة قد وصف البروتوكولات المذكورة أعلاه لعدة الخميرة والفأر السلالات، وهذه الأساليب لها عدم قدمت المعرفة المؤلفين في شكل مفصل، موحدة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا المخطوط يضع التركيز بشكل خاص على التكيف مع بروتوكولات موحدة الحالية للتلاعب الجيني للخميرة بروبيوتيك، التي تتميز بشكل أقل مما كانت عادة سلالات الخميرة المختبر. يجب أن يكون الأمثل العديد من الخطوات لكلا الطفرات (التي نوقشت في الجزء 1) والتحول (جزء 2) للتلاعب من هذا القبيل مضاعفا، بروبيوتيك الخميرة isolatوفاق. كما تناقش هذه المخطوطة المزالق المحتملة المرتبطة التعامل مع الحيوان (الجزء 3) وتشريح التصحيح أنسجة باير المناعية من الأمعاء الدقيقة (جزء 4).
عن العديد من سلالات الخميرة الصناعية وذات الصلة سريريا ليست قابلة للتكيف على الفور للتلاعب الجيني على نطاق واسع، فمن الضروري أولا لتوليد سلالات مثل طفرات العوز الغذائي التي يمكن زراعتها والمحدد دون المضادات الحيوية الغالية الثمن. الأشعة فوق البنفسجية الطفرات هي واحدة النهج بحيث يسمح للطفرة غير محددة سريعة من الجينات بعامل نمائي 7،41. يمكن بسهولة منحنيات البقاء على قيد الحياة أن تتولد (الشكلان 1 و 2) لتحديد الجرعة المناسبة لفحص المسوخ. ومع ذلك، فإن هذا النهج ينطوي على خطر التسبب في إيقاف الطفرات المستهدفة التي قد تؤثر على معدل النمو أو غيرها من الممتلكات من سلالة الخميرة. ويمكن بدلا من ذلك بالضربة القاضية الموجهة توليد باستخدام PCR يبني أو كريسبر نظام / Cas9. فحص لاحقة أو اختيار(الشكل 3) من المسوخ يسمح لتحديد الخميرة بعامل نمائي. استخدام مجموعة من الطلاء على وسائل الإعلام 5 FOA، على سبيل المثال، يسمح التخلص السريع من أي الخميرة لا تزال تحتوي على URA3 الجينات العوز الغذائي وظيفية. عندما يكون ذلك ممكنا، قد يكون هذا نهج اختيار أفضل من الشاشة، الأمر الذي يتطلب تحليل جميع المستعمرات التي تم إنشاؤها. إما اختيار أو الفرز، ومع ذلك، فإنه من الأهمية بمكان لأداء تسليط الضوء المتكرر للمستعمرات الخميرة الفردية على وسائط انتقائية لتأكيد حالة العوز الغذائي.
التحول من المسوخ ولدت ويمكن تحقيق ذلك من خلال بروتوكولات مختلفة. على الرغم من التحول LiOAc فعال في تحويل العديد من سلالات الخميرة، لا سيما بالنسبة للالأكثر شيوعا المختبر س. سلالات خميرة، بروتوكولات بديلة مثل Electroporation للقد تحول الخميرة الأخرى المعزولة مع قدر أكبر من الكفاءة (الشكل 4). يجب اختبار كل سلالة جديدة باليودنانوغرام بروتوكولات متعددة لتحديد الظروف المثلى للتحول. متفاوتة مرات حضانة وتركيز الحمض النووي، على سبيل المثال، يمكن أن تؤثر على كفاءة التحول الشاملة وينبغي اختبار والأمثل لكل سلالة 33.
أنبوب تغذية عن طريق الفم يسمح لتقديم جرعات تسيطر عليها هذه الخميرة المؤتلف مباشرة إلى الجهاز الهضمي الفئران، التي يمكن بعد ذلك أن يعاير لالخميرة والبروتينات مغاير الأنسجة المناعي. المناسبة تقنية أنبوب تغذية عن طريق الفم (الشكل 6) أمر بالغ الأهمية لتقليل الانزعاج الحيوانية وزيادة الدقة التجريبية. وعلاوة على ذلك، البقع باير هي المواقع الرئيسية لتقييم امتصاص الخميرة المؤتلف من الأمعاء. هذه المجموعات من الأنسجة المناعية المواقع الهامة لأخذ العينات مستضد وتحريض المخاطية الاستجابات المناعية. المستضدات كبيرة، بما في ذلك الخميرة 3-6 ميكرون في القطر، من المرجح أن يتم تناولها من قبل الخلايا M من بقع باير من أجل عبور الجاظهارة strointestinal وتتفاعل مع الخلايا المناعية. يجب توخي الحذر عند تشريح البقع باير لضمان أن الخلايا الوحيدة من داخل التصحيح بدلا من يتم جمع لمعة الأمعاء أو الصفيحة المخصوصة (الشكل 7). كما يجب اتخاذ مزيد من الخطوات التالية تشريح لتقييم التعبير السليم وظيفة البروتين مغاير في الخميرة تعافى (الشكل 8). إعداد البروتين الكلي من لست] الخميرة وimmunoblotting هو طريقة واحدة موحدة لتقييم التعبير البروتين. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا توفر المعلومات المتعلقة لطي البروتين وظيفة. لتقييم وظيفة البروتين، والخميرة يمكن أن تتحول مع GFP ترميز البلازميد وتحليلها تحت المجهر الفلورسنت بعد الشفاء من بقع باير لتقييم التعبير GFP وظيفي (الشكل 5).
وباختصار، تقدم هذه المخطوطة مجموعة موحدة من البروتوكولات التجريبية تفصيلية تغطي الخطوات جيئة وذهابام توليد طفرات العوز الغذائي لاستعادة الخميرة بروبيوتيك من الأمعاء الفئران. من خلال تجميع البروتوكولات التي لا تقع عادة ضمن منطقة واحدة من الخبرة، وهذه الأوصاف تسهيل إجراء مزيد من الدراسات اختبار الاستجابات المناعية لالخميرة بروبيوتيك صممت لناقلات تسليم المخدرات عن طريق الفم. ويأمل معدو الدراسة إلى أن هذه الدراسة تشجيع النقاش وتعزيز الاستفادة المثلى من الطرق التجريبية لكل سلالة الخميرة اختبارها، مما يمهد الطريق لنهج أكثر كفاءة في تطوير الرواية، والعلاجات المؤتلف على أساس بروبيوتيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
يعترف واضعو التمويل من خلال مركز الطفل للمناعة واللقاحات وجائزة مبتكر جديد المعاهد الوطنية للصحة (1DP2AI112242-01) منحت لتريسي J. الحمل. أشكر الكتاب أيضا ناتاليا P. Degtyareva للمساهمة سخية من rad1 س. الخباز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | BioRad | 170-2501 | Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures |
| New Brunswick Roller Drum | Eppendorf | M1053-4004 | Example of roller drum for yeast culture incubation |
| UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075-03 | Example stratalinker |
| Stuart Colony Counter SC6PLUS | 11983044 | Fisher Scientific | Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen |
| Scienceware Colony Counter | F378620002 | Bel-Art Scienceware | Hand held colony counter pen |
| Replica plating device | Fisherbrand | 09-718-1 | Example of replica plating stand and pads |
| Velveteen squares | Fisherbrand | 09-718-2 | |
| L shaped sterile cell spreaders | Fisherbrand | 14665230 | |
| Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes | Sigma-Aldrich | D7656-1ML | Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation |
| Gavage needles | Braintree Scientific | N-PK 002 | For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used |
| 1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe | Becton Dickinson | BD 309659 | |
| Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps | Electron Microscopy Sciences | 77937-28 | Example of blunt forceps needed for dissection |
| Straight and curved dissection scissors | Electron Microscopy Sciences | 72966-02 and 72966-03 | Examples of scissors needed for dissection |
| IMDM | Life technologies | 12440053 |
References
- Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
- Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).
- Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. , (1991).
- DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
- Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).
- Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).
- Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
- Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).
- Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).
- Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
- Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).
- JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
- Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).
- Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).
- Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
- Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).
- Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).
- McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).
- Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
- Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).
- Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
- Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16 (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
- Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
- Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).
- McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14 (4), 401-435 (1996).
- Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
- Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
- Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
- Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13 (12), (1994).
- Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).
- Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).
- Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).
