Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

Published: February 8, 2016 doi: 10.3791/53453
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

Summary

אנו מציגים כאן תיאור אחיד של טכניקות שיכולות לשמש לפיתוח, לשנות, לנהל, ולבדוק ביטוי חלבון Heterologous של boulardii Saccharomyces שמרים פרוביוטיים.

Introduction

מיקרואורגניזמים פרוביוטיים הם אמצעי פוטנציאל מסקרן של יעיל וחסכוני ומספק חלבונים Heterologous בבני האדם במערכת העיכול. אורגניזמים אלה מסוגלים לשרוד מעבר דרך מערכת העיכול עדיין לא ליישב אותו 1, מה שמאפשר מינון מבוקר הגבלת החשיפה לתרופה לידי ביטוי. יתר על כן, את היכולת להנדס אלה אורגניזמים בקלות לייצר חלבון Heterologous בקנה מידה גדול הופך אותם חלופה חסכונית חלקיקי משלוח סינטטיים. עם זאת, פיתוח של גישה כזו, כפי שהודגם לאחרונה באמצעות זן auxotrophic של Saccharomyces שמרים פרוביוטיים 2 boulardii, דורש ידע של טכניקות מעבדה לא משולבים באופן מסורתי בתוך מחקר נתון, החל שמרים וביולוגיה מולקולרית לטכניקות טיפול בבעלי חיים ושיטות אימונולוגיות. לכן למרות נהלי הפרט המתוארים כאן אינם כשלעצמם רומןפרוטוקולי מעבדה, מטרה של כתב היד הזה הוא להציג הקדמה מאוחדת לטכניקות דרושי בדיקה ניסיונית של שמרי פרוביוטיים כרכב תרופה ניתנת מערכת עיכול Murine. מסופק הוא אוסף של פרוטוקולים חיוניים: 1) הפקה של זנים מוטנטים auxotrophic של שמרים שיכולים בקלות להיות מניפולציות גנטיות; 2) שינוי של תרביות שמרים להביע חלבון Heterologous; 3) הממשל של שמרים רקומביננטי למעי gavage דרך הפה; ו -4) התאוששות של שמרים פרוביוטיים קיימא רקומביננטי מהמעי murine והערכה של ביטוי חלבון Heterologous שלהם.

ראשית, אם כי שיטות בחירה חיובית ושלילית רבות קיימות עבור המניפולציה של מיני שמרים, סלקציה שלילית כגון באמצעות סמני auxotrophic מגבירה היא את היעילות ואת הקלות שבה שהמרים ניתן להפוך נבחר. סלקציה חיובית של transformants באמצעות אנטיביוטיקה, בשיתוףntrast, מגביר באופן משמעותי את העלות של מניפולציה שמרים. יתר על כן, בחירה של שמרים על תקשורת מוצקה המכילה אנטיביוטיקה יכולה לאפשר צמיחה מוגברת של מושבות רקע untransformed ביחס בחירה של שמרי auxotrophic על ירידה סינטתית החוצה תקשורת מוצקה (תצפיות לא פורסם). שמרי Auxotrophic הם זנים אשר חסרים אנזימים קריטיים לסינתזה של חומצות או אורציל האמינו חיוניות. כזה שמרים יכולים לגדול רק אם השלים עם המטבוליט החסר או גני מטבוליים, ובכך לאפשר סלקציה שלילית כאשר שמרים מצופית על ירידה סינטתית החוצה תקשורת כי חסרה את המטבוליט החיוני. רבים נפוצים זני מעבדת שמר אפייה הם למעשה כבר auxotrophic מוטנטים 3. תעשייתי, קליני, ואת זני שמרים פרוביוטיים, לעומת זאת, הם בדרך כלל prototrophic עם היכולת לסנתז את כל החומרים המזינים הנדרשים. כדי לאפשר מניפולציה גנטית יעילה יותר של שמרים כאלה, גני auxotrophic ניתן לכוון באופן סלקטיביכדי ליצור זנים שיכולים להיבחר ללא אנטיביוטיקה. מיקוד ספציפי של גני סמן auxotrophic יכול להיות מושג באמצעות שיבוש גנטי בתיווך PCR להסתמך על רקומבינציה הומולוגי או ולאחרונה דרך CRISPR / Cas9 מיקוד 4 - 6. לחלופין, mutagenesis UV יכול במהירות ליצור מוטציות auxotrophic אפילו זני שמרים עבורו טרנספורמציה עם פלסמידים מרובים מבחינה טכנית קשה 7. למרות שהמיקוד PCR ו CRISPR / Cas9 תוארו בהרחבה במקומות אחרים, המופיעים בחלק אחד של כתב היד הזה הוא פרוטוקול מפורט המתאר גישה mutagenesis UV כדי ליצור זנים auxotrophic שיאפשרו סלקציה שלילית ולא חיובית מבחר אנטיביוטי של transformants שמרים.

הצעד הכרחי הבא בשימוש זנים auxotrophic כזה למסירה אוראלי של חלבון Heterologous הוא טרנספורמציה שמרים עם DNA פלסמיד. מאז השינוי המוצלח הראשון של עצירהspheroplasts t ודווח שמר האפייה בשנת 1978 8, שינויים רבים מתאפיינים כדי להגביר את היעילות ואת הקלות שבה מינים שמרים יכולים להיות מהונדסים גנטית. השימוש electroporation עבור טרנספורמציה מוצלחת של ה- DNA לתוך ס cerevisiae תואר לראשונה בשנת 1985 9 ומאז שופר באמצעות התוספת של 1 M דגירת סורביטול לתאי התמיכה אוסמוטי 10. יעילות Electroporation יתר הוכח תלוי מינים שמרים ומתח, מספר תא בשלב של צמיחה, נפח electroporation, עוצמת שדה, או מאגר ספציפי 11. הטרנספורמציה יצטט ליתיום (LiOAc), תארה במקור על ידי איטו et al. 12, היא בין פרוטוקולי השינוי הנפוצים ביותר כפי שהוא דורש שום ציוד מיוחד. ניתוחים נוספים הראו כי יעילות הטרנספורמציה שמרים LiOAc מגדיל מאוד כאשר התאים נאספים בשלב אמצע יומןהצמיחה וחום מזדעזעים בנוכחות פוליאתילן גליקול (PEG) ו- DNA על 42 מעלות צלזיוס 12. דגירה של שמרים שלמים ללא רבב עם PEG חיונית שינוי יעיל, ואולי באמצעות שיפור מצורף של DNA על קרום תא, כמו גם באמצעות אפקטים אחרים על הממברנה 13. ליתיום עצמו גם מעלה את החדירות של תאים שלמים 14. למרות שרוב המעבדה ס זני cerevisiae ניתן להפוך בקלות באמצעות LiOAc טרנספורמציה 3, מיני שמרים אחרים עשויים להשתנות בצורה יעילה יותר תוך שימוש בפרוטוקולים חלופי. pastoris Pichia, למשל, הוא הכי טרנספורמציה ביעילות דרך electroporation ולא טרנספורמציה LiOAc 13. זה חיוני, אפוא, לבדוק מספר שיטות של שינוי וכדי לייעל תקופות דגירה וריכוזיות מגיב כאשר מנסים לשנות גנטי זן שמרי uncharacterized. כתב יד זה וכך מתאר הוא LiOAc transformation ו electroporation כמו טכניקות הטרנספורמציה של מוטציה auxotrophic וסוג בר ס boulardii. קוראים מעוניינים מופנים סקירות אחרונות לתיאורים יסודיים של האבולוציה של טרנספורמציה שמרים, פרוטוקולים חלופיים, ודיונים נוספים של מנגנוני פעולה אפשריים 13,15. טרנספורמציה של שמרים עם קידוד פלסמיד חלבון שניתן לזיהוי בקלות הוא יתר חיוני לבדיקה במורד הזרם כדי להבטיח ביטוי הולם ותפקוד של חלבון Heterologous. חלבונים השונים מיריאד ניתן לבחור בהתאם את המטרה הסופית של המחקר הטיפולי ואת הנוגדנים זמינים לגילוי חלבון על ידי immunoblotting, ELISA, וטכניקות אחרות. פרוטוקולים עבור טכניקות אלו תוארו ביסודיות במקום אחר 16,17, והוא יכול לשמש כדי לקבוע רמות של ייצור חלבון Heterologous משמרים טרנספורמציה בהשוואת עקומות סטנדרטיות. להדגמה ולהראותייצור מוצלח של חלבון מאוד נפוץ בביולוגיה שמרים, כתב היד הזה מציג טרנספורמציה עם חלבון פלואורסצנטי ירוק קידוד פלסמיד (GFP), אשר מאפשר זיהוי שלאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

לא פחות חשוב בייצור של אורגניזמים פרוביוטיים המבטאים חלבון Heterologous הוא המנהל תקין זיהוי של מיקרואורגניזמים אלה בתוך רקמות עיכול, כמתואר חלק שלושה וארבעה. מנהל של שמרי רקומביננטי gavage דרך הפה מאפשר אספקה ​​של כמויות מבוקרות של שמרים ישירות לקיבה, שממנו C57BL / 6 עכברים אינן מסוגלות באופן טבעי של הקאות 18. עם זאת, טיפול בבעלי חיים פסולים gavage עלולים להביא לניזק ושט ניקוב, ניקוב קיבה, ממשל קנה נשימה, ושאיפת דלקת ריאות 19,20. טכניקה וחוסר ניסיון מסכנה יתר יכולים להגדיל השתנות בתגובות murine חיסוניות resu הניסיוןLTS, אשר יוחס מתח חיה על gavage פי 21,22. עיסוק בטכניקה הנכונה ולכן לא יכול רק להחליש חוסר נוחות לבעל חיים, אלא גם יכול להגדיל את הדיוק של תוצאות ניסוי. כתב יד זה מתאר ומדגים טיפול בבעלי חיים ו gavage הפה עבור הממשל של מינונים מבוקרים של שמרים רקומביננטי.

לבסוף, הוא חיוני, כדי לאשר מסירה מוצלחת של שמרי רקומביננטי ידי ניתוח רקמות הלימפה לנוכחות שמרים וחלבון Heterologous. הרקמות החיסוניות העיכול שיכול בקלות על וכצפוי להיבדק לנוכחות של שמרים הן הטלאים של Peyer. טלאים של Peyer הם איברים הלימפה משני לאורך המעי הדק כי הם אתרים מרכזיים של אינדוקציה התגובה החיסונית ברירית 23. אנטיגנים מן לומן מועברים transcellularly דרך microfold (M) תאי האפיתל ומשתחררים לתוך טלאים של Peyer, ובכך חושפים הקףאנטיגן ד הצגה לתאי מעי תוכן לומינל. למרות ספיגת חלקיקים על פני האפיתל במעי יכול גם להיות מושגת על ידי תאי גביע, תאים אלה הוכחו חלקיקים תופסים רק פחות מ 0.02 מיקרומטר בקוטר 24. דנדריטים Transepithelial הוארכו מ CD103 + תאים דנדריטים (DC) גם תופס חלקיקים קטנים מן המעי לומן 25; עם זאת, אין כיום דיווחים הוכחת כי CD103 + DCs תופס חלקיקים גדולים יותר מאשר חיידקים. לכן, ללא שינוי שמרים פרוביוטיים, בגודל ממוצע בין 3-6 מיקרומטר קוטר, הם הסיכוי הטוב ביותר להיות נלקח על ידי תאים M והועבר טלאים של Peyer. מתואר כאן הוא פרוטוקול לאיסוף והקרנת הטלאים של Peyer עבור שמרי רקומביננטי קיימא, למרות ההליך זה יכול גם להיות מותאם בקלות להערכת ספיגה של חיידקים פרוביוטיים.

לסיכום, להערכת שמרים פרוביוטיים רקומביננטי עבור משלוח שלחלבונים rapeutic למעי דורש מיומנות בטכניקות מעבדה פורש ביולוגיה מולקולרית כדי טיפול ואימונולוגיה חיה. הפרוטוקולים שהוצגו כאן הם עבור 1) הדור והקרנת זני שמרים auxotrophic אשר ניתן לבחור באופן שלילי בקלות ללא אנטיביוטיקה, 2) פרוטוקולים חלופיים להפוך שמרים ולאפשר ביטוי חלבון Heterologous, 3) הפגנות של טכניקות טיפול בבעלי חיים נאותה gavage אוראלי משלוח intragastric של שמרים רקומביננטי, ופרוטוקולים 4) לנתיחה תיקון של Peyer וסינון עבור שמרים רקומביננטי קיימא וחלבון Heterologous פונקציונלי. בשילוב, פרוטוקולים אלה יאפשרו לדור ובדיקה של זן שמרים פרוביוטיים מסוגל לספק החלבון התרופתי Heterologous בבני האדם במערכת העיכול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. mutagenesis UV כדי ליצור זני שמרים Auxotrophic

  1. צור עקומות הישרדות לקבוע המנות הדרושות של קרינה UV
    1. כן YPD (דקסטרוז peptone תמצית שמרים) תקשורת ריאגנטים אחרים המפורטים בטבלה 1 על פי נהלים קבועים 26 ולחסן מושבות אחת לתוך 5-10 מיליליטר של תקשורת YPD. דגירה תרבויות על תוף רולר ב 30 מעלות CO / N לרוויה במשך שעה לפחות 8.
    2. קבע את ריכוז התא של תרבויות O / N באמצעות ספקטרופוטומטר ידי דילול תאים 1:10 ב מים קובט פלסטיק. לדלל תאים לריכוז של 10 מיליליטר 7 תאים / ב 20 מ"ל מים מזוקקים סטריליים.
    3. יוצקים תאים מדולל לתוך צלחת פטרי פלסטיק סטרילית, עם מכסה הסיר, מניחים את צלחת 14 ס"מ מתחת נורת UV.
    4. לחשוף לתאים סדרתי 5,000 μJ ו -10,000 מנות μJ של קרינה UV, לחילוץ 500 μl של תאים לאחר כל תוספת כזו שתאינדגמים לאחר החשיפה 0 μJ, 5,000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ, 25,000 μJ, 30,000 μJ, 40,000 μJ, ו -50,000 μJ של UV הקרנה. העברת חילוץ דגימות תאים כדי סטרילית 1.5 מ"ל צינורות לדלל סדרתי בשעה 1:10 במרווחים במים סטריליים.
    5. גלולת תאים כל דילול על ידי צנטריפוגה ב microcentrifuge XG 16,000 דקות 1. supernatant ו resuspend לשאוב בנפח 100 μl של מים סטריליים המתאים עבור ציפוי תאי שמרים. פיפטה הווליום של תאי resuspended לצלחות המכילות מדיה מוצקה YPD ולהשתמש מפזר סטרילית להפיץ תאים באופן שווה על פני כל צלחת.
    6. עוטף קצות צלחת Parafilm כדי למנוע התייבשות של תקשורת אטמי בנייר אלומיניום כדי למנוע צילום מחדש ותיקון של מוטציות הנוצר על-ידי UV. במהופך דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-4 ימים כדי לאפשר צמיחה של מושבות שמרים קיימא (איור 1).
    7. ספירת number של מושבות, לחלופין בעזרת עט כדי לסמן את מושבות נספרות, עט לדלפק אלקטרוני כף יד, או דלפק לעמוד עם הגדלה. מגרש כאחוז של תאים הכוללים מצופה בכל מנת μJ של הקרינה UV כדי ליצור עקומת הישרדות של שמרים מוקרנים (איור 2).
      הערה: זני שמרים הפלואידים ניתן לצפות לדרוש מינונים נמוכים יותר של יחסי קרינה UV זנים דיפלואידי להגיע לאותו הישרדות אחוזים. זן של שמרים חסרי אנזימים לתיקון דנ"א פונקציונליים, כגון rad1 ס מוטציה cerevisiae, יכול לשמש כביקורת חיובית כדי לציין את נוכחותו של קרינה UV במינונים נמוכים מאוד.
    8. לקבוע את המינון של mutagenesis UV לשמש להקרנה על ידי פנייה עקומת ההישרדות הוקמה בשנת 1.1.7. ערך x של הנקודה לאורך עקומת ההישרדות שבו y שווה 50 הוא מנת הקרינה UV שבה 50% של שמרים לשרוד. הקרנת מוטנטים לשרוד אחוז הנמוך זה עלולה לגרוםתשואה גבוהה יותר של זני מוטציה בהצלחה, במיוחד עבור שמרי דיפלואידי. מינון ההישרדות 50% עבור WT ס boulardii, כפי שמוצג באיור 2, הוא כ -18,000 μJ.
      הערה: למרות מינונים גבוהים UV כזה להגביר את הסיכון של מוטציות בגנים עבור מסלולים תאיים אחרים מאשר גני סמן auxotrophic עניין, החסרון הזה חייב להיות מאוזן מול הצורך להשרות מוטציות בשני העותקים של גן סמן auxotrophic. עבור זנים הפלואידים שבו רק עותק גן אחד חייב להיות מוטציה, מיון בבית הישרדות אחוזה, כגון 90%, מקטין את הסיכון של מוטציות נוספות ועדיין מאפשר דור מספק של מוטציות auxotrophic.
  2. mutagenesis UV והקרנת עבור זני שמרים auxotrophic
    1. כן שמרים כמתואר בשלבי 1.1.1-1.1.3.
    2. לחשוף שמרים למינון של קרינה UV המתאים הישרדות 50%, כפי שנקבע 1.1.8. עבור WT ס boulardii, ווה מינון זהנחוש להיות כ 18,000 μJ (איור 2).
    3. אסוף 1 מ"ל כרכים של UV מוקרן שמרים גלולה ידי צנטריפוגה ב microcentrifuge XG 16,000 דקות 1. לשאוב תאים supernatant ו resuspend במים סטריליים 100 μl.
      1. בחירה של מוטציות
        1. אם משתמשים בבחירה כגון עם URA3 - מוטציות auxotrophic, צלחת מוקרן שמרים על גבי מדיה המכילים חומצה 5-fluoroorotic (5-פואה) כדי לבחור עבור תאים חסר אנזים URA3 פונקציונלי.
          הערה: כל שמרים המכילים עותקים תפקודיים של URA3 ימירו 5-פואה אל רעלן 5-fluorouracil, המוביל מוות של תאים ומאפשרים לבחירה קלה של URA3 - מושבות חסרות URA3 תפקודית 27. גישות מבחר מקבילות אפשריות עבור LYS2 ו LYS5; TRP1; ו MET2 וסמני MET15 באמצעות מדיה המכילה חומצת α-aminoadipic 28; 5-fluoroanthranilic חומצה 29; ו 30,31 מתיל-כספית, בהתאמה.
        2. פיפטה 100 μl של תאים resuspended על גבי מדיה מינימלי המכיל 5-פואה ולהשתמש מפזר סטרילי שווה לצפות את הצלחת. גלישת צלחות Parafilm דגירה במהופך על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-4 ימים כדי לאפשר צמיחה של מושבות שמרים קיימא.
        3. אשר את URA3 - הפנוטיפ של כל מושבה המופיעה על צלחות של 5 פואה ידי restreaking על YPD, אורציל - וצלחות 5-פואה (איור 3). השתמשו בקצה קיסם סטרילי לאסוף חלק מושבה אחת ובעדינות לגרור את התאים ברחבי YPD טרי, אורציל -, וצלחות 5-פואה. שוב דגירת צלחות עטופות במהופך על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-4 ימים.
          הערה: מושבות בת קיימא תופענה כפי שהועלה, בערך גידולים חוזרים בעוד תאים קיימא שאינו יופיעו רק בתור הכפשה אטומה ללא גידולים העלה (איור 3).
      2. Screening של מוטציות
        1. אם שהניב מוטצית auxotrophic עבורו שיטות בחירה אינן זמינות, להכין דילולי 1:10 סידוריים של UV מוקרנים תאי שמרים במים סטריליים פיפטה דילולים גבי מדיה YPD, באמצעות מפזר סטרילי שווה לצפות את הצלחת.
        2. גלישת צלחות Parafilm דגירה במהופך על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-4 ימים. לקבוע אילו דילול מותר לצמיחה של מושבות בודדות שניתן להבחין בקלות בין זה לזה, בדרך כלל לא יותר מ כ 100 מושבות בכל צלחת.
        3. mutagenesis UV חזור של דגימות שמרים כמתואר תאים 1.2.1-1.2.3 צלחת בדילול נחוש זה. פיפטה השמרים בדילול גבי מדיה YPD, השתמש מפזר סטרילי כדי לפזר את התאים, דגירת צלחות עטופות במהופך על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-4 ימים.
        4. מסך עבור auxotrophs ידי העתק ציפוי על גבי מדיה סלקטיבית חסר המטבוליט של עניין. ראשית, להבטיח כרית קטיפה סטרילית על עמדת צלחתו להפוך את הצלחת עם מושבות מוקרנות UV על הקטיפה, סימון אורינטצית הצלחת.
        5. בשלב הבא, להפוך צלחת טריה חסרת המטבוליט של עניין על הקטיפה לחץ קל כלפי מטה כדי להעביר תאים מן הקטיפה לצלחת. אחסן את הקלישאה המקורית על 4 מעלות צלזיוס. עוטפי דגירת הצלחת החדשה במהופך על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-4 ימים.
        6. כחלופה ציפוי העתק, מוטציות המסך על ידי מושבות מחדש קוים מפוספסים מ YPD על גבי מדיה סלקטיבית. השתמש בקצה קיסם סטרילי לאסוף חלק מושבה אחת ובעדינות לגרור את התאים על פני צלחת YPD טריה וצלחת חסרת המטבוליט של עניין. שוב דגירת צלחות עטופות במהופך על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-4 ימים.
          יש להקפיד לבחור מושבות פס החוצה מושבות אחת מספר פעמים כדי לאשר אוכלוסייה הומוגנית של תאי auxotrophic נכונים: הערה.
    4. בהמשך לאשר את הפנוטיפ של התאים מוקרנים על ידי inoculating מושבות אחת לתוך 5-10 מיליליטר שניהם YPD ומדיה חסרת המטבוליט המתאים (למשל, ב אורציל - המדיה עבור URA3 - מוטציה). דגירה על תוף רולר ב 30 מעלות CO / N כדי לאשר הצמיחה של תאים בתקשורת YPD אבל לא בהיעדר המטבוליט.
      הערה: למרות דפוסי צמיחה על תקשורת מוצקה צריכות מצביעות בבירור שמרים מעמד auxotrophic, זה אפשרי עבור כמה שמרים לסבול מדגיש ויוצרים קטנים, איטיות מושבות הגוברות על התקשורת מוצקה אך עדיין לא לסבול אותם התנאים בתקשורת נוזלית (תצפיות לא פורסם). חיסון לתוך תרבויות נוזליות ולכן יש לבצע כדי לאשר דפוסי צמיחה ביסודיות של מוטציות מוקרנות UV.
    5. עבור אחסון לטווח ארוך של מוטציות auxotrophic אישר, להכין מלאי גליצרול ידי תאים יחסנו אל 10 מ"ל YPD דוגרים על O תוף רולר / N ב 30 מעלות צלזיוס. תאים גלולה ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 2500 XG התקשורת ואת לשאוב. תאים Resuspend ב 50%גליצרול מסונן סטרילי, להעביר cryovial, ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: שמרי UV mutagenized פוטנציאל מכילים מוטציות בגנים מרובות אחרות מאשר בסמן auxotrophic עניין. לפני שתמשיך עם שימוש מוטנטים auxotrophic מאומת, זנים אלה יש לנתח עוד יותר באמצעות רצף הגן והערכה של התנגדות pH, מדגיש חומצות מרה, ומאפיינים נוספים הרלוונטיים זנים פרוביוטיים, כמתואר במקום אחר 2. בנוסף, השימוש הומולוגיה PCR או CRISPR / Cas9 מיקוד יותר סלקטיבי להשתנות סמנים auxotrophic צריך להיחשב כאלטרנטיבה mutagenesis UV 4 - 6.

טרנספורמציה שמרים 2.

  1. טרנספורמציה LiOAc של שמרים
    1. לחסן מושבות שמרים בודדות לתוך 5-10 מיליליטר של תקשורת YPD ו דגירה על תוף רולר ב 30 מעלות CO / N.
    2. כדי לגרום לצמיחת שלב יומן ולהגביר את היעילות של ספיגת פלסמיד, דהריכוז termine תא באמצעות ספקטרופוטומטר למדוד 1:10 דילול של תאי מים סטריליים קובט פלסטיק. לדלל O / N תרבויות כדי OD 600 של 0.16-0.2 (כ 2 x 10 6 - 2.5 x 10 6 תאים / מ"ל) ב 50 מ"ל של YPD חם טרי דגירה תאים על שייקר פלטפורמה מסלולית מוגדר 200 סל"ד עד שהתרבות ומגיע לכ מ"ל 1 x 10/7 תאים, בדרך כלל סביב 4 שעות.
      הערה: יעילות טרנספורמציה ניתן למדוד כפונקציה של מספר יחידות המושבה להרכיב שמרים טרנספורמציה בהצלחה (CFU) לכל מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד. מספר תוצאות יעילות במושבות טרנספורמציה יותר לכל מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד. Subculturing תאי שמרים ואיסוף במהלך צמיחת שלב יומן גורם אחד מגביר יעילות שינוי 12.
    3. גלולת תאים על ידי צנטריפוגה ב 2500 XG במשך 3 דקות.
    4. לשאוב את התאים supernatant ולהעביר צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ידי resuspending פלet ב 1 מ"ל מים סטריליים.
    5. תאים גלולה ידי צנטריפוגה ב XG 16,000 דקות 1 ב microcentrifuge, לשאוב supernatant ולשטוף תאים על ידי resuspension ב 1 מ"ל TE / LiOAc חיץ (טריס EDTA LiOAc).
    6. חזור תאים צנטריפוגה ו resuspend במאגר TE / LiOAc לריכוז של 2 x 10 9 תאים / מ"ל.
    7. הכן תערובות טרנספורמציה עם כל אחד מאלה: 50 μl של שמרים מוכן במאגר TE / LiOAc, 5 μl של ה- DNA המוביל (10 מיקרוגרם / μl), ו 1 μl של ה- DNA פלסמיד (1 מיקרוגרם). מיקרוגרם של פלסמיד DNA עשויה להיות טיטרציה כמו הגדלת כמויות של DNA עשויה או לא עשויה להוביל יעילות השינוי צמח ב -32
      הערה: עבור זן שמרים מוטנטים חסרי סמן אחד auxotrophic, רק פלסמיד אחד המקודד את הסמן ניתן להפוך לדגימה. יתר על כן, השימוש של קידוד פלסמיד חלבון שניתן לזיהוי בקלות, כגון GFP, יאפשר זיהוי יעיל של קיפול ראוי וביטוי של יחסי ציבור Heterologousotein ידי זן שמרים לאחר השינוי.
    8. לכל הכנה, להוסיף 300 μl של PEG / LiOAc / TE ו מערבולת ביסודיות. הדגירה של תאים שלמים עם PEG חיונית שינוי יעיל 13.
    9. דגירת הכנות על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם תסיסה על ידי נחת הצינורות microcentrifuge בכוס הניחה על שייקר פלטפורמת מסלולית ב 200 סל"ד.
    10. להוסיף 35 μl של DMSO לכל הלם התגובה וחום תאים במשך 15 דקות באמבט מים C ° 42. אמנם ישנם דיווחים סותרים של הערך המוסף של DMSO 33, הלם חום של תאי שמרים ללא פגע הוכח להגדיל יעילות שינוי מאוד 12.
    11. שטפו תאים על ידי pelleting באמצעות צנטריפוגה כמו 2.1.5, aspirating או pipetting את supernatant, ו resuspending ב 1 מ"ל מים סטריליים. פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לפזר את התא גלולה.
      הערה: זה קריטי כדי להסיר את supernatant ביסודיות כי שימוש בתקשורתד ביצירת תאים מוסמכים יכול לעכב את הצמיחה שמרים היווצרות מושבה.
    12. pelleting תא חזור כמו 2.1.5, לשאוב supernatant, ו resuspend התאים במים סטריליים 100 μl. פיפטה הווליום לצלחת סלקטיבי ולהשתמש מפזר סטרילי שווה לצפות את הצלחת עם שמרי טרנספורמציה.
    13. עוטפי קצוות של צלחות מצופות Parafilm כדי למנוע התייבשות של תקשורת דגירה במהופכת על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים כדי לאפשר צמיחה של תאי שמרים טרנספורמציה. טרנספורמציה מוצלחת, יעילה בחירת auxotrophic של cerevisiae Saccharomyces מניב מספר הגבוה של מושבות בכל הכנת טרנספורמציה, למרות תשואה יכולה להיות חלשה יותר זנים אחרים (איור 4).
    14. חנות צלחות שמרים לטווח קצר (בדרך כלל 1-3 שבועות) במהופך מכוסה על 4 מעלות צלזיוס. הכן מניות גליצרול של שמרים טרנספורמציה כמתואר 1.2.5 עבור אחסון לטווח ארוך.
      CF מחקרים נוספים טרנספורמציה בדיקות: הערהU נחוץ כדי לקבוע יציבות הפלסמיד ולהעריך ביטוי הולם של חלבון Heterologous. תיאורים יסודיים של יציבות פלסמיד 34, שימוש immunoblotting לזהות חלבונים מפוגלים התאוששו דגימות תאים 17, אנזים מקושר assay immunosorbent (ELISA) כדי לזהות מקופל כראוי שלושה חלבונים ממדיים 16, ושימוש GFP במחקרים שמר 35 זמינים במקומות אחרים. איור 6 מציג תמונה מייצגת של הביטוי GFP מוצלח טרנספורמציה ס ביחס cerevisiae לתאי untransformed. שימוש חלבון כגון ניאון הוא אמצעי אחד בקביעת ייצור חלבון Heterologous מוצלח ביעילות.
  2. Electroporation של שמרים
    1. לחסן מושבות שמרים בודדות לתוך 5-10 מיליליטר של תקשורת YPD ו דגירה על תוף רולר ב 30 מעלות CO / N.
    2. קביעת ריכוז התא באמצעות ספקטרופוטומטר למדוד 1:10 דילול של תאים במים סטריליים. diלאוטה O / N תרבויות 100 מ"ל טריים תקשורת YPD חמה השווה OD 600 של 0.3 כ. דגירה תת תרבות על 30 מעלות צלזיוס על סט שייקר פלטפורמה מסלולית 200 סל"ד עד שמגיעים OD של 600 1.6 כ, בדרך כלל 4-5 שעות. כל תת 100 מיליליטר יפיק מספיק תאים הותנו שני תגובות טרנספורמציה.
    3. גלולת תאים על ידי צנטריפוגה ב 2500 XG במשך 3 דקות. לשאוב supernatant ולשטוף תאים על ידי resuspending ב 50 מים סטריליים קר מ"ל קרח. חזור על לשטוף על ידי pelleting תאים, aspirating supernatant, ו resuspending במים סטריליים קרים כקרח טרי 50 מ"ל.
    4. גלולת תאים שוב resuspend ב 50 מ"ל קרח המאגר קר electroporation (1 M סורביטול, 1 מ"מ CaCl 2).
    5. ספין חזור כמו 2.2.3, לשאוב supernatant, ותאי resuspend ב 20 מ"ל 0.1 M LiOAc / 10 מ"מ DTT. דגירת השעית תא על תוף רולר על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. Preincubation של תאי LiOAc ו DTT בסינרגיה מגדיל אתהיעילות של electroporation 36.
    6. גלולה התאים כמו 2.2.3, להסיר supernatant, ולשטוף ידי resuspending ב 50 חיץ electroporation קר מ"ל קרח. חזור תאי צנטריפוגה ו resuspend במאגר electroporation הקר כקרח לנפח סופי של 1 מיליליטר.
    7. הכן על הקרח: תאי שמרים מותנה, cuvettes electroporation סטרילי, ו- DNA פלסמיד. מיד לאחר resuspension הסופי של תאים ממוזגים חיץ electroporation 1 מ"ל, לשלב 400 μl מותנה תאי שמרים עם כ 1 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד ולהוסיף קר כקרח 0.2 מיקרומטר קובט electroporation. שימוש כמויות מוגברות של ה- DNA עשוי להגדיל יעילות שינוי מעט 11. דגירת תגובה על קרח למשך 5 דקות, ולאחר מכן electroporate עם סט electroporator ל -2.5 קילו וולט ו -25 μF.
      הערה: כפי שתואר 2.1.7, זן שמרים מוטנטים חסרי אחד סמן auxotrophic ניתן להפוך עם רק פלסמיד אחד המקודד את סמן מוטציה לדגימה. כמו כן, באמצעותפלסמיד המקודד חלבון שניתן לזיהוי בקלות כגון GFP מאפשר זיהוי יעיל של קיפול ביטוי הולם של חלבון Heterologous לטרנספורמציה שלאחר מכן.
    8. העברת electroporated תאים לתוך 8 מ"ל של 1: תערובת 1 של YPD: 1 M סורביטול ולאפשר לתאים כדי לדגור על תוף רולר על 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
    9. תאים גלולה כמו 2.2.3 ו resuspend ב 100 μl 1: 1 YPD: 1 M סורביטול. פלייט ווליום על גבי מדיה סלקטיבית המכיל 1 M סורביטול, לעטוף הקצוות של צלחות Parafilm, דגירה צלחות במהופך על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-5 ימים כדי לאפשר צמיחה של תאי שמרים טרנספורמציה.
      הערה: זה קריטי כדי הבדיקה טרנספורמציה שמרים להעריך ביטוי הולם של חלבון Heterologous, כמתואר 2.1.14 ו 2.2.7.

3. Gavage אוראלי של עכברים עם שמרים טרנספורמציה

  1. ביצוע כל הטיפול בבעלי חי נהלי טיפול בהתאם המדריך לטיפול ושימוש מעבדתיים מזimals וטיפול מוסדיים בעלי חיים ואישור ועדת שימוש.
  2. הכן O / N תרביות שמרים ידי יחסנו מושבות אחת של שמרים auxotrophic להפוך 5-10 מ"ל של התקשורת סלקטיבית. דגירה תרבויות O / N במשך שעה לפחות 8 על תוף רולר על 30 מעלות צלזיוס עד רווי.
    הערה: שימוש חלבוני מבחן קידוד פלסמיד כגון GFP תאפשר על מנת להקל על בדיקות ביטוי חלבון שמרים gavaged, כמתואר 4.7.
  3. לזירוז מקסימאלי של ביטוי חלבון כדי לגרום לצמיחת שלב יומן, להכין תת-תרבויות מן O / תרבויות N ידי דילול ל OD 600 השווה לכ 0.16-0.2 ב 50 מיליליטר של המדיה מתאימה כמתואר 2.1.2.
  4. קבע את הריכוז של תאים subcultured כמו 1.1.2 ולהתאים עד 10 9 תאים / מ"ל. הכן מנה 100 μl עבור כל עכבר, עם כמה מאות μl נפח נוסף לכל קבוצה כדי לשפר את דיוק וקלות טעינת המדגם.
  5. תאים גלולה ידי צנטריפוגה ב 2500 XG עבור3 דקות או microcentrifuge בבית XG 16,000 דקות 1. לשאוב supernatant ותאי resuspend ידי הוספת נפח שווה של מים סטריליים בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
  6. תקן מחט gavage מד המתאים (22 G למשך 15-20 עכברים ז) על מדגם שמרים מזרק 1 מ"ל סטרילי עומס, להיות בטוח כדי לחסל כל בועות הבוכנה מוגדר תוספת 100 μl. טען מזרק נוסף עם מים סטריליים כדי עכברי שליטת gavage ולבדוק נוכחות של כל שמרים מזהמים.
  7. תרימי את העכבר להיות gavaged באמצעות היד הלא דומיננטית, עם האצבע והאגודל בחוזקה לתפוס את העור סביב הצוואר (איור 6 א). לקפל את הזנב תחת האצבע הקטנה כדי למנוע תנועה של פלג הגוף התחתון. הקפד כי האחיזה מאובטחת ואוסרת את עכבר הזזת הראש שלה על מנת למנוע ניזק לרקמות פנימיות במהלך gavage.
    הערה: להעריך כמה רחוק את מחט gavage צריך להיות מוכנס על ידי החזקת המחט נגד העכבר כךהנורה הוא אפילו עם לתהליך xiphoid של עצם החזה. הכנסת אורך זה של מחט בדרך כלל תאפשר נורת מחט gavage להיכנס לקיבה.
  8. שימוש ביד הדומיננטית, הכנס את המחט gavage בעדינות לתוך הוושט העכבר על ידי לדוג את המחט לאורך הגג של הפה האחורי של הגרון, שמירה מעט שמאלה מהמרכז. חכה בעכבר כדי לבלוע את הנורה של מחט ולאפשר את המחט לרדת מעט יותר עד לנקודה המוערכת ב 3.7 (6B איור). אם כל התנגדות מורגשת במהלך החדרת מחט gavage או אם העכבר בכל עת מתחיל להשתנק, בעדינות להסיר את המחט שוב ​​מנסה למצוא את הוושט.
  9. לאחר העכבר בלע את הנורה של מחט gavage, בעדינות לוחץ על מתג המזרק לנהל 100 μl (10 8 CFU) של שמרים ישירות לקיבת העכבר.
    הערה: למרות עכברים אינם מסוגלים להקיא כל מהפתרון gavaged לאחר מתן 18,19 21,37. כניסה נכונה של מחט gavage, כמו גם התאמת עוצמת קול והצמיגות של הפתרון, יכול לעזור להגביל ריפלוקס ולהבטיח מינון מדויק.
  10. מוציאים בזהירות את המחט gavage מהקיבה העכבר והוושט ולהחזיר את העכבר לכלוב. בדוק ושהעכבר מתנשם ונע בדרך כלל לאחר gavage על מנת להבטיח כי המחט gavage הוכנס כראוי לאורך כל ההליך וכי אין פתרון היה aspirated.

4. קציר של התיקונים של Murine Peyer ובידוד של מושבות שמרים בת קיימא

  1. באותו gavage פוסט בנקודה המתאימה הזמן, בדרך כלל 4 שעות, עכברים הקרבה באמצעות IACUC אושרה שיטות. בדוק מחוסר ההיענות הבא קמצוץ בוהן, ולהשתמש מידה משתיים כגון נקע בצוואר רחם להקריב את העכבר. נקודות זמן נוספות יכולים גם להיבדק, כמו מחקרים רבים הראו יעיל כי ועיתוי של עדלקחת על פני האפיתל הוא חלקיק תלוי 38,39.
  2. הנח את העכבר עם הבטן עירום ועריה לעקר באזור הבטן על ידי ריסוס עם 70% EtOH. ביצוע חתך רוחבי דרך הפרווה והעור במספריים, נזהר שלא לפגוע בכל רקמות פנימיות. ידני לחטט החתך לפתוח עוד לחשוף הצפק, רירית דקה serosal המכסים את אברי הבטן. הרם בעדינות את הצפק ולעשות חתך רוחבי לחשוף את המעיים.
  3. בזהירות להשתמש במלקחיים בוטה כדי לגרות את המעי הדק מן העורקים mesenteric, שומן ורקמות אחרות. לחשוף את המעי הדק מהקיבה, ברבע השמאלי העליון של הבטן העכבר, אל cecum, בכיס גדול של רקמת המעי בתחילת המעי הגס.
  4. לבודד את התיקונים של Peyer ידי מחפש 1-3 מ"מ בערך טלאים עגולים של רקמות אטומות לאורך המעי הדק (איור 7). שימוש scis לנתיחה מעוקלsors, לחתוך את הכיפה של התיקון של Peyer, משאיר שולי כדי להבטיח שאף אחד השכבה הרירית המיוחדת שמסביב נאסף.
    הערה: יש רוב העכברים בין 4-8 בקלות הטלאים של גלוי Peyer. ביצוע הליך באזור עם תאורה עילית ישירה יגדיל את הקלות שבה טלאים של Peyer ניתן דמיינו.
  5. לאסוף גזור הטלאים של Peyer במדיה של Dulbecco השונה של שלמה Iscove (IMDM).
    הערה: זה קריטי כדי להשתמש בטכניקה סטרילית כוללים אנטיביוטיקה בתקשורת האוספת כדי למנוע זיהום חיידקים במערכת עיכול של צלחות שמרים.
  6. הטלאים של זני Peyer דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לחסל תקשורת אוספת. טלאים של שטפי Peyer עם IMDM שלם טרי על שפופרת 50 מ"ל ולהשתמש הבוכנה של מזרק 1 מ"ל לשבור בעדינות את המדבקות של Peyer. גלולת תאים מתוחים על ידי צנטריפוגה ב 1800 סל"ד במשך 7 דקות. לשאוב תאים supernatant ו resuspend בנפח סופי של כ 100 μl.
  7. החל תאים מתוחים על גבי מדיה שמרים סלקטיבית ולהשתמש מפזר צלחת להפיץ התאים באופן שווה. עוטפים קצוות צלחת Parafilm דגירה צלחות במהופך על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים כדי לאפשר צמיחה של כל שמרים קיימא התאוששה טלאים של Peyer בעכברים.
    הערה: מחקרים נוספים לאחר ההתאוששות של שמרי הטלאים 'Peyer נחוצים כדי לאשר כי הזנים מסוגלים לספק חלבון Heterologous מקופל כראוי לרקמות החיסוניות אלה. כפי שתואר 2.1.14, שיטות כאלה עשויים לכלול immunoblotting, ELISA, או מיקרוסקופ פלואורסצנטי לזהות חלבוני ניאון כגון GFP 2,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דור של עקומת הישרדות בעקבות הקרינה UV דורש ציפוי של תאי שמרים מדוללים כך להרכיב יחידות מושבה ברורות (CFU) מסוגלות ליצור. כל דגימה 500 μl שנאספו כמתואר לעיל מכיל כ 5 x 10 6 תאים; עם זאת, יותר מ -100 מושבות בכל צלחת שקשה להבחין במדויק. ציפוי מדגם חי וכן דילולי 1:10 סדרתי של תאים מוקרנים ובכך מבטיח כי CFU ניתן מנויים בכל מנת UV, כפי שמודגם באיור 1. את CFU לספור, מוכפל במקדם הדילול, מחולק מכן על ידי המספר הכולל של תאים מוקרנים מקוריים בכל מדגם 500 μl כדי לקבוע הישרדות אחוז בכל מנה. איור 2 מראים את האחוז המחושב של סוג בר דיפלואידי ס תאים boulardii מסוגל לשרוד 0 μJ, 5,000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ, 22,500 μJ, 25,000μJ, 35,000 μJ, ו -50,000 μJ. נתונים אלה להקים עקומת ברור שניתן להשתמש בהם כדי למצוא את המינון המתאים הישרדות 50%.

לאחר בחירת מינון UV הקרנה של תאי שמרים, זה קריטי מושבות מוטצית מסך כדי לאשר חוסר גן סמן פונקציונלי auxotrophic. שימוש בשיטת בחירה, כמתואר 1.2.3.1 ו שמוצג באיור 3, מגביר באופן משמעותי את היעילות של אישור הפנוטיפ. המוצג הוא דוגמה מבחר URA3 שמנצלת את ההמרה של 5-פואה אל רעלן 5-FU ידי URA3 ללא פגע. גישות מקבילות זמינות LYS2 ו LYS5; TRP1; ו MET2 ו MET15 ולהגביר את היעילות של בחירה עבור מוטציות אלה. יש להקפיד לבחור מושבות בודדות במהלך ההקרנה. הגידול העקבי של מושבות מוטציה על YPD ו -5 פואה, אבל לא אורציל -, indicat צלחותes פנוטיפ auxotrophic.

איור 4 מראה יעיל שינוי עבור הסוג בר ס boulardii (SB) ביחס מעבדה נפוצה ס זן cerevisiae (Sc) הן במודל LiOAc (LiOAc) ו electroporation טכניקות (אלקטרו). למרות שינוי LiOAc יעיל מאוד עבור ס cerevisiae, יעילות שינוי עבור ס boulardii הוא השתפר מאוד באמצעות electroporation. איור 5 הראה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כשיטת דוגמא לניתוח ביטוי חלבון נאות מפני שמרים טרנספורמציה. Brightfield (א) ו פלואורסצנטי (ב) תמונות מוצגות עבור ס cerevisiae טרנספורמציה עם GFP קידוד פלסמיד URA3, הוכחת ביטוי פונקציונלי של חלבון Heterologous מן שמרי טרנספורמציה. תאים יכולים להיות משותקת עבור ויזואליזציה טובה יותר באמצעות coverslips מצופה concanavalin (מעיל 5 μl של 2מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות במים על כל coverslip 22 x 22 מיקרומטר ואוויר יבש).

איור 6 א מראה עכבר C57BL / 6 החזיק בדיוק לפני gavage פה. היד תופסת את הגב והצוואר של עכבר כזה בתוקף כי העכבר הוא לא מסוגל להזיז את הראש לכל כיוון. אחיזה זו מאפשרת את המחט gavage להציב במדויק ועם ירידה בסיכון נזק לרקמות. איור 6 מראה את המחט gavage שנערך לאחר העכבר בולע את המחט gavage. לאחר תקופת הדגירה, המעי הדק של העכבר Sacrificed צריך להיות התגרו בנפרד בקפידה מתוך הרקמות הסובבות, כפי שמוצג באיור 7. מניפולציה זו מאפשרת זיהוי קל של טלאים של Peyer ועבור החיתוך נקי של טלאים ללא איסוף כל הסובבים שכבת רירית מיוחדת. לבסוף, איור 8 מראים התאוששות אופיינית CFU שמרים קיימא מן הטלאים של Peyer. פתרונות מדיה צלחה שמר ריאגנטים טרנספורמציה פוליאתילן גליקול (PEG) 50%: YPD: TE / LiOAc: 250 גרם PEG 3350 20 גרם peptone 50 מ"ל 10x TE 500 מ"ל מים סטריליים 20 גרם דקסטרוז 50 מ"ל 10x (1M) LiOAc סנן לעקר 10 גרם תמצית שמרים 400 מ"ל מים סטריליים מי L 1 סנן לעקר דוּד לַחַץ TE 10x: צלחות YPD: PEG / TE / LiOAc: 100 מ"מ טריס 20 גרם peptone 400 מ"ל 50% PEG 10 mM EDTA 20 גרם דקסטרוז 50 מ"ל 10x TE pH 7.5 לעקר מסנן 20 גרם אגר 50 מ"ל 10x (1M) LiOAc 10 גרם תמצית שמרים מי L 1 דוּד לַחַץ 20% גלוקוז: אורציל - תקשורת סלקטיבית Carrier DNA (SS DNA): 200 גרם דקסטרוז 2 גרם תערובת חומצות אמיניות חסר אורציל חנות ב -20 מעלות צלזיוס ו לפני שימוש חום במשך 1-2 דקות ב 100 מעלות צלזיוס כדי להמס גדילים ולאחסן על קרח מי L 1 6.7 g בסיס שמרים חנקן ללא חומצות אמינו סנן לעקר מי L 1 <tr> לעקר ידי מעוקר או סינון סטרילי הוסף 20% גלוקוז 01:10 לפני השימוש 50% גליצרול: אורציל - צלחות: חיץ Electroporation: 500 מ"ל גליצרול בבקבוק 250 מ"ל: 1 M סורביטול 500 מ"ל מים 2 גרם תערובת חומצות אמיניות חסר אורציל 1 מ"מ CaCl 2 דוּד לַחַץ 6.7 g בסיס שמרים חנקן ללא חומצות אמינו ממלאים במים מזוקקים 150 מ"ל מים חיטוי וחנות ב 4 ° C בבקבוק L 2: 20 גרם אגר 750 מ"ל מים צלוחיות החיטוי בנפרד, ואז לערבב יחד עם 100 מ"ל גלוקוז 20% IMDM השלם 5-פואה צלחות +: LiOAc / DTT 500 מ"ל מדיה של השתנה Dulbecco של Iscove חיטוי בבקבוק L 2: 0.1 M LiOAc 100x גלוטמין סטרפטומיצין 5 מ"ל פניצילין 20 גרם אגר 10 מ"מ DTT 500 μl 2-mercaptoethanol 750 מ"ל מים 10% חום מומתים בסרום שור עוברי לְעַרְבֵּב: 2.5 מ"ל נתרן פירובט 100 מ"מ 6.7 g בסיס שמרים חנקן ללא חומצות אמינו 2 גרם תערובת חומצות אמיניות בלי אורציל 150 מ"ל מים חמים כאשר קריר, להוסיף: 0.05 גרם אורציל אבקה 1 גרם של 5 פואה מערבבים ולסנן לעקר הוסף פתרון אגר autoclaved מערבבים עם 100 מ"ל 20% גלוקוז

רשימת טבלת 1. ריאגנטים. תתואר ריאגנטים הדרושים להכנה כל אחד מפתרונות, תקשורת שמרים וצלחות או מאגר טרנספורמציה המשמשים פרוטוקולים בכתב היד הזה.

איור 1
מושבות שמרי איור 1. גדלו על תקשורת YPD. צלחת YPD דוגמא מראה מושבת קיימא הקמת יחידות (CFU) של pשמרים robiotic לאחר קרינה UV. התאים דוללו כזה סדר כי פרט CFU ניתן להבחין ומנה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
עקומת איור 2. הישרדות עבור שמרים פרוביוטיים דיפלואידי. מספר ס ​​קיימא boulardii CFU כאחוז תאים מצופים הכוללים היה להתוות עבור כל מנת μJ של הקרינה UV (קו מוצק). הקו האדום האנכי מציין את UV μJ המינון המתאים הישרדות 50% של זן שמרים זה. מוטציה cerevisiae rad1 ס, אשר לא ניתן לתקן את הנזק מן mutagenesis UV, מוצג כביקורת (קו מקווקו). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </ A>

איור 3
איור 3. אישור של URA3 - פנוטיפ של UV מוקרן תאים על YPD, אורציל -, ו -5 פואה צלחות תאים ממושבות מוטציה UV בודדים נאספו באמצעות קצה של קיסם סטרילי ומפוספס בעדינות על פני YPD, אורציל -., ו -5 צלחות -FOA. תאים היה מפוספסים ראשון מזה שני קווים מצטלבים בניצב, אז קיסם החדש שמש לעבור דרך הקו השני ולהמשיך להפיץ תאים עד תאים בודדים להפריד. URA3 נכון - מוטציה (mut) גדל על התקשורת YPD ובנוכחות של 5-פואה, אבל לא בהיעדר אורציל. בקרת URA3 - ס cerevisiae (URA3 -) ו URA3 + sup> ס boulardii (URA3 +) מוצג להשוואה וכדי לאשר הכנה מתאימה של תקשורת שמרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. יעילות טרנספורמציה של זני Saccharomyces. סוג Wild ס boulardii (SB) ומעבדה ס זן cerevisiae (Sc) שהוסבו באמצעות LiOAc תיאר (LiOAc) ו electroporation (אלקטרו) פרוטוקולים. תוצאות הם זממו כמו ממוצע CFU השיג לכל מיקרוגרם של קידוד פלסמיד סמן התנגדות kanamycin. ברים להראות את הממוצע של ניסויים כפולים עם סורגים שגיאה המתארת ​​את סטיית התקן של הממוצע.es / ftp_upload / 53,453 / 53453fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. ביטוי חלבון פונקציונלי ידי שמרים טרנספורמציה. ס cerevisiae הפך עם פלסמיד ריק (א) ו- GFP קידוד פלסמיד (B) נותחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. קרינה בתאי שמרים הפכו עם פלסמיד GFP מציינת הפקה מוצלחת של ה- GFP תפקודי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. טיפול נכון של עכבר C57BL / 6 עבור gavage פה. העכבר הוא החזיק tightly ביד הלא דומיננטית עם הזנב התחוב מתחת האצבע קטנה כך שום תנועה אפשרי (א). מחט gavage מוכנסת לתוך הלוע לאורך הגג של הפה. העכבר הוא מותר לבלוע את הנורה של מחט gavage, המאפשר הפתרון ואז להיכנס לקיבה כמו הבוכנה היא מדוכאת (B). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
הכנה איור 7. ו דיסקציה של הטלאים של Peyer. המעי הדק מוצג גזור מן והאיברים הפנימיים האחרים ורקמות, עם חצים המצביעים כמה מן הטלאים של Peyer. אנא לחץ כאן כדי להציג versi גדולעל של נתון זה.

איור 8
איור 8. שחזור שמרים מ התיקונים של Peyer. דוגמא CFU הקיימא זוהה לאחר דיסקציה, המגון, הציפוי של תאי התיקון של סך Peyer מתוך עכבר gavaged עם ס boulardii. התאים היה מצופים על תקשורת שמרים YPD וטופחו על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. תשואה אופיינית של CFU התאושש לכל עכבר היא פחות מ 10. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יחד, הפרוטוקולים בזאת לתאר את הצעדים החיוניים הדרושים לפיתוח ובדיקה של זני שמרים פרוביוטיים auxotrophic למסירה של החלבון התרופתי Heterologous אל המעי. מניפולציה ובדיקה זו של שמרי פרוביוטיים רקומביננטי דורשים טכניקות ומשאבים שבה כל מעבדת פרט לא יכול כרגע להיות מוכרות. לכן, למרות מחקרים קודמים רבים תיארו את הפרוטוקולים הנ"ל עבור זני שמרים ועכבר מרובים, שיטות אלה יש לא ידיעת המחברים הוצגו בצורה מפורטת, מאוחדת. יתר על כן, כתב היד הנוכחי שמה דגש מיוחד על התאמת פרוטוקולים סטנדרטיים נוכחיים עבור המניפולציה הגנטית של שמרי פרוביוטיים, אשר פחות מאופיינות היטב מאשר זני שמרי מעבדה נפוצים. צעדים רבים הוא mutagenesis (נדונו חלק 1) וההשנאה (חלק 2) חייבים להיות מותאמים עבור המניפולציה של דיפלואידי כזה, בידוד ע שמרים פרוביוטייםes. כתב יד זה גם דן בעיות פוטנציאליות הקשורות טיפול בבעלי חיים (חלק 3) ו דיסקציה של רקמות החיסוניות התיקון של Peyer של מעי דק (חלק 4).

כמו זני שמרים תעשייתיים רבים ורלוונטי קלינית אינם וישימה מיד מניפולציה גנטית בקנה מידה גדול, יש צורך קודם ליצור זנים כגון מוטציות auxotrophic כי ניתן לגדל נבחרים ללא אנטיביוטיקה יקר. Mutagenesis UV היא גישה כזו אחד המאפשרת מוטציה ספציפית מהירה של גני auxotrophic 7,41. עקומות הישרדות יכולות להיוצר בקלות (איורים 1 ו -2) כדי לקבוע את המינון המתאים לסינון מוטציות. עם זאת, גישה זו נושאה את הסיכון של גרימת מוטציות את היעד שעשוי להשפיע על קצב צמיחה או מאפיינים אחרים של זן השמרים. knockouts ממוקד יכול במקום להיות שנוצר באמצעות PCR בונה או מערכת CRISPR / Cas9. הקרנה או מבחר לאחר(איור 3) של מוטציות מאפשר זיהוי של שמרי auxotrophic. שימוש בחירה על ידי ציפוי על גבי מדיה 5-פואה, למשל, מאפשר לחיסול מהיר של כל שמרים עדיין המכילים גן URA3 auxotrophic פונקציונלי. במידת ההאפשר, גישת הבחירה זו עשויה להיות עדיפה על מסך, מחייב ניתוח של כל המושבות שנוצרו. עם בחירה או הקרנה כל אחד מהם, זה קריטי לבצע קווים מפוספסים חוזרים ונשנים של מושבות שמרים פרט על גבי מדיה סלקטיבית כדי לאשר מעמד auxotrophic.

טרנספורמציה של מוטציות שנוצרה יכולות להיות מושג באמצעות פרוטוקולים שונים. למרות שינוי LiOAc יעיל בהפיכת זני שמרים רבים, במיוחד עבור המעבדה הנפוצה ביותר S. זני cerevisiae, פרוטוקולים חלופיים כגון electroporation עשויים להפוך מבודדים שמרים אחרים ביתר יעילות (איור 4). צריך להיבדק כל זן חדש using פרוטוקולים מרובים כדי לקבוע את התנאים אופטימליים עבור שינוי. משתנה פעמי דגירה וריכוז DNA, למשל, יכול להשפיע על יעילות שינוי כוללת צריך להיבדק אופטימיזציה עבור כל זן 33.

gavage אוראלי מאפשר משלוח של מנות מבוקרת של שמרים רקומביננטי אלה ישירות בבני האדם במערכת העיכול Murine, אשר רקמות החיסון לאחר מכן ניתן assayed עבור שמרים וחלבון Heterologous. טכניקת gavage פה נכונה (איור 6) היא קריטית כדי למזער חוסר נוחות לבעל חיים ולהגדיל דיוק ניסיוני. יתר על כן, את התיקונים של Peyer הם אתרים מרכזיים להעריך ספיגה של שמרי רקומביננטי מהמעי. אשכולות אלה של רקמות חיסון הם אתרים חשובים של דגימת אנטיגן ואינדוקציה של תגובה חיסונית ברירית. אנטיגנים גדולים, כולל מיקרומטר שמרים 3-6 קוטר, הם הסיכוי הטוב ביותר להיות נלקח על ידי תאים M של טלאים של Peyer על מנת לחצות את gaהאפיתל strointestinal ולתקשר עם תאים חיסוניים. יש להקפיד כאשר מנתחים את התיקונים של Peyer על מנת להבטיח כי התאים רק מתוך תיקון ולא חלל המעי או שכבת הרירית המיוחדת נאספים (איור 7). צעדים נוספים צריך גם לקחת הבאים לנתיחה כדי להעריך ביטוי הולם ותפקוד של חלבון Heterologous ב השמרים התאושש (איור 8). הכנת חלבון הכולל מ lysates שמרים immunoblotting היא שיטה מקובלת אחת להעריך ביטוי חלבון; עם זאת, גישה זו אינה מספקת מידע לגבי קיפול תפקוד החלבון. כדי להעריך את תפקוד החלבון, שמרים ניתן להפוך עם GFP קידוד פלסמיד וניתח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר ההחלמה מן טלאים של Peyer להעריך ביטוי של GFP תפקודית (איור 5).

לסיכום, כתב היד הזה מציג קבוצה מאוחדת של פרוטוקולי הניסוי מפורט פורש צעדים הלוך ושובמ 'הדור של מוטציות auxotrophic להתאוששות של שמרים פרוביוטיים מהמעי בעכברים. על ידי עריכת פרוטוקולים שאינם נופלים באופן מסורתי בתוך האזור יחיד של מומחיות, התיאורים האלה יקלו מחקרים נוספים לבדיקת תגובות חיסוניות לשמרים פרוביוטיים תוכננו וקטורי משלוח סמים אוראליים. המחברים מקווים שהמחקר הזה יעודד דיון ולקדם אופטימיזציה של שיטות ניסיוניות עבור כל זן שמרים נבדק, וכך נסלל דרך הגישות היעילות ביותר להתפתחות של רומן, טיפולים רקומביננטי מבוססי פרוביוטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים מימון דרך של מרכז ילדים לאימונולוגיה חיסונים וכן פרס ממציא ניו NIH (1DP2AI112242-01) הוענק טרייסי ג 'למב. המחברים מודים גם נטליה פ Degtyareva על התרומה הנדיבה של rad1 ס cerevisiae.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer BioRad 170-2501 Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum Eppendorf M1053-4004 Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075-03 Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS 11983044 Fisher Scientific Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter  F378620002 Bel-Art Scienceware Hand held colony counter pen
Replica plating device Fisherbrand 09-718-1 Example of replica plating stand and pads 
Velveteen squares Fisherbrand 09-718-2
L shaped sterile cell spreaders  Fisherbrand 14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes Sigma-Aldrich D7656-1ML Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles Braintree Scientific N-PK 002 For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe Becton Dickinson BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps Electron Microscopy Sciences 77937-28 Example of blunt forceps needed for dissection 
Straight and curved dissection scissors Electron Microscopy Sciences 72966-02 and 72966-03 Examples of scissors needed for dissection
IMDM Life technologies 12440053

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edwards-Ingram, L., Gitsham, P., et al. Genotypic and physiological characterization of Saccharomyces boulardii, the probiotic strain of Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology. 73 (8), 2458-2467 (2007).
  2. Hudson, L. E., Fasken, M. B., et al. Functional Heterologous Protein Expression by Genetically Engineered Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii. PloS one. 9 (11), 1-12 (2014).
  3. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. , (1991).
  4. DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., Church, G. M. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  5. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  6. Lorenz, M. C., Muir, R. S., Lim, E., McElver, J., Weber, S. C., Heitman, J. Gene disruption with PCR products in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 158, 113-117 (1995).
  7. Hamedi, H., Misaghi, A., Modarressi, M. H., Salehi, T. Z., Khorasanizadeh, D., Khalaj, V. Generation of a Uracil Auxotroph Strain of the Probiotic Yeast Saccharomyces boulardii as a Host for the Recombinant Protein Production. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (1), 29-34 (2013).
  8. Hinnen, A., Hicks, J. B., Fink, G. R. Transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (4), 1929-1933 (1978).
  9. Hashimoto, H., Morikawa, H., Yamada, K., Kimura, A. A novel method for transformation of intact yeast cells by electroinjection of plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 21, 336-339 (1985).
  10. Becker, D., Guarente, L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods in Enzymology, Volume 149: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 182-187 (1991).
  11. Benatuil, L., Perez, J. M., Belk, J., Hsieh, C. -M. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein engineering, design & selection : PEDS. 23 (4), 155-159 (2010).
  12. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. Journal of Bacteriology. 153 (1), 166-168 (1983).
  13. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioengineered bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  14. Zheng, H. Z., Liu, H. H., et al. Yeast transformation process studied by fluorescence labeling technique. Bioconjugate Chemistry. 16, 250-254 (2005).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. BioTechniques. 30 (4), 816-831 (2001).
  16. JoVE Science Education Database. The ELISA Method. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2015).
  17. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (16), (2008).
  18. Horn, C. C., Kimball, B. A., et al. Why Can't Rodents Vomit? A Comparative Behavioral, Anatomical, and Physiological Study. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  19. Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 49 (3), 329-334 (2010).
  20. Johnson, M., Shayne, C. G., Kemper, C. J. The rat. Animal Models in Toxicology. , 50-193 (2006).
  21. Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 39, 17-21 (2000).
  22. Jacoby, R., Fox, J., Davisson, M. Biology and diseases of mice. Laboratory animal medicine. , 35-133 (2002).
  23. Schulz, O., Pabst, O. Antigen sampling in the small intestine. Trends in immunology. 34 (4), 155-161 (2013).
  24. McDole, J. R., Wheeler, L. W., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  25. Farache, J., Koren, I., et al. Luminal bacteria recruit CD103+ dendritic cells into the intestinal epithelium to sample bacterial antigens for presentation. Immunity. 38 (3), 581-595 (2013).
  26. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Lab Press. (2000).
  27. Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Molecular & general genetics : MGG. 197 (2), 345-346 (1984).
  28. Chattoo, B. B., Sherman, F., Azubalis, D. A., Fjellstedt, T. A., Mehnert, D., Ogur, M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alpha-aminoadipate. Genetics. 93, 51-65 (1979).
  29. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., La Thompson,, Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16 (6), Chichester, England. 553-560 (2000).
  30. Singh, A., Sherman, F. Genetic and physiological characterization of met15 mutants of Saccharomyces cerevisiae: a selective system for forward and reverse mutations. Genetics. 81, 75-97 (1975).
  31. Singh, A., Sherman, F. Characteristics and relationships of mercury resistant mutants and methionine auxotrophs of yeast. Journal of Bacteriology. 118 (3), 911-918 (1974).
  32. McCoy, S. L., Hausman, F. A., et al. Quantification of DNA binding to cell-surfaces by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 241, 141-146 (2000).
  33. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  34. Zhang, Z., Chisti, Y. Plasmid stability in recombinant saccharomyces cerevisiae. Science. 14 (4), 401-435 (1996).
  35. Lorang, J. M., Tuori, R. P., Martinez, J. P., Sawyer, T. L., Redman, R. S., Rollins, J. Green Fluorescent Protein Is Lighting Up Fungal Biology. Applied and Environmental Microbiology. 67 (5), 1987-1994 (2001).
  36. Thompson, J. R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., Kelly, R. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14, 565-571 (1998).
  37. Damsch, S., Eichenbaum, G., et al. Gavage-related reflux in rats: identification, pathogenesis, and toxicological implications (review). Toxicologic pathology. 39, 348-360 (2011).
  38. Desai, M., Labhasetwar, V., Amidon, G., Levy, R. Gastrointestinal uptake of biodegradable nanoparticles: effect of particle size. Pharma. 13 (12), (1994).
  39. Shakweh, M., Ponchel, G., Fattal, E. Particle uptake by Peyer's patches: a pathway for drug and vaccine delivery. Expert opinion on drug delivery. 1 (1), (2004).
  40. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. Journal of visualized experiments : JoVE. (80), e50921 (2013).
  41. Hashimoto, S., Ogura, M., Aritomi, K., Hoshida, H., Nishizawa, Y., Akada, R. Isolation of Auxotrophic Mutants of Diploid Industrial Yeast Strains after UV Mutagenesis. Applied and environmental microbiology. 71 (1), 312-319 (2005).

Tags

אימונולוגיה גיליון 108, Auxotroph, תיקון של Peyer gavage חלבון Heterologous GFP mutagenesis UV פרוביוטיים
טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hudson, L. E., Stewart, T. P.,… More

Hudson, L. E., Stewart, T. P., Fasken, M. B., Corbett, A. H., Lamb, T. J. Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53453, doi:10.3791/53453 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter