Summary
ここで提示は、開発変換、管理、およびプロバイオティクス酵母サッカロマイセス・ブラウディの異種タンパク質の発現を試験するために使用することができる技術の統一説明します。
Introduction
プロバイオティック微生物は、効率的かつ経済的に消化管に異種タンパク質を提供する魅力的な潜在的な手段です。これらの生物は、まだ1コロニーを形成しない消化管通過を存続制御の投与を可能にし、薬物が発現への曝露を制限することが可能です。また、簡単に大規模で異種タンパク質を産生するために、これらの生物を設計する能力は、それらを合成送達粒子への経済的な代替をレンダリングします。しかし、このようなアプローチの開発は、最近2 ブラウディプロバイオティクス酵母サッカロマイセスの栄養要求株を用いて実証されたように、実験技術の知識が伝統的に酵母および分子生物学から動物取扱技術および免疫学的方法に至るまで、与えられた研究の中に結合していない必要があります。したがって、本明細書に記載の個々の手順は、それ自体では小説ではありませんが、実験室プロトコルは、本稿の目的は、マウス消化管への薬物送達ビヒクルとしてプロバイオティクス酵母の実験的試験のために必要な技術と統合された導入を提示することです。提供に不可欠なプロトコルをまとめたものです：簡単に遺伝的に操作することができる酵母の栄養要求性変異株の1）の生成は、酵母培養物の2）の形質転換は、異種タンパク質を発現します。強制経口投与を介して腸への組換え酵母の3）投与;そして4）その異種タンパク質発現のマウス腸及び評価から実行可能な組換えプロバイオティクス酵母の回復を。
多数の正および負の選択方法は、酵母種の操作のために存在するが、まず、このような栄養要求性マーカーの使用を介して負の選択は、酵母を形質転換し、選択することができる効率および容易さの両方を増加させます。共同での抗生物質を使用して形質転換体の正の選択、ntrast、大幅酵母操作のコストを増加させます。また、抗生物質を含む固体培地上での酵母の選択が出て、合成ドロップ固形培地（未発表の観察）での栄養要求性酵母の選択に相対的な形質転換されていないバックグラウンドコロニーの増加成長を可能にすることができます。栄養要求性酵母は、必須アミノ酸またはウラシルの合成のための重要な酵素を欠いている株です。このような酵母は、酵母は不可欠な代謝産物を欠いているメディアアウト合成ドロップ上にめっきされたときにこのように、負の選択を可能にする、不足している代謝物または代謝遺伝子を補充した場合にのみ成長することができます。多くの一般的に使用されるサッカロマイセス・セレビシエ実験室株は、すでに実際には栄養要求性変異株3です。工業、臨床、およびプロバイオティクス酵母株は、しかし、一般的にすべての必要な栄養素を合成する能力を持つ原栄養です。このような酵母のより効率的な遺伝子操作を有効にするには、栄養要求性遺伝子を選択的に標的とすることができます抗生物質を含まない選択することができる株を生成します。 6 -栄養要求性マーカー遺伝子の標的特異的4を標的 CRISPR / Cas9を通してより最近、相同組換えに頼るまたはPCR媒介性の遺伝子破壊を介して達成することができます。また、UV突然変異誘発は、すぐにでも、複数のプラスミドを用いた形質転換は7技術的に困難な酵母株に栄養要求性変異体を生成することができます。 PCRの標的化およびCRISPR / Cas9が広範囲に他の場所に記載されているが、この写本の一つは負の選択ではなく、酵母形質転換体の正の抗生物質の選択を可能にする栄養要求株を作成するために、UV突然変異誘発アプローチを説明する詳細なプロトコルである部分で提示。
異種タンパク質の経口送達のためのそのような栄養要求性株の使用で次の必要なステップでは、プラスミドDNAと酵母の形質転換です。賛否の最初の成功の変換以来1978年8 サッカロミセス・セレビシエについて報告Tスフェロプラストは、多数の変更は、効率を高め、酵母種の遺伝的に改変することができると容易に特徴付けられています。 S.へのDNAの形質転換の成功のためのエレクトロポレーションの使用セレビシエは、最初の 1985年9で説明した、それ以来浸透圧的支持細胞10から1 Mソルビトールインキュベーションの添加によって改善されました。エレクトロポレーションの効率はさらに酵母種および株、細胞数及び増殖の位相、電気容量、電界強度、および特定のバッファ11に依存することが示されています。それは特別な機器を必要としないように元々伊藤ら 12によって記載リチウムアセテート（LiOAc）変換は、最も一般的に使用される形質転換プロトコルの一つです。さらなる分析は、細胞が中期対数期に回収されたときLiOAc酵母形質転換の効率が大幅に増加することを示しました成長及びC 12 42℃でポリエチレングリコール（PEG）及びDNAの存在下で熱ショックを与えています。 PEGと全体無傷の酵母のインキュベーションは、おそらく、細胞膜へのDNAの付着を向上させることを通じて、ならびに膜13上の他の効果を経由して、効率的な形質転換のために不可欠です。リチウム自体も無傷の細胞14の透過性を増大させます。なお、ほとんどの実験室S.セレビシエ株は容易LiOAc変換3を用いて形質転換することができ、他の酵母種は、より効率的に代替プロトコルを用いて形質転換することができる。 ピキア・パストリス 、例えば、最も効率的にエレクトロポレーションではなく、LiOAc変換13を介して変換される。これは、複数のテストするため、重要です遺伝的に特徴づけられていない酵母株を変更しようとすると、インキュベーション期間および試薬濃度を最適化するための形質転換の方法および。この原稿は、このようにLiOAc trの両方を記述栄養要求性変異株と野生型S.の形質転換のための技術としてansformationとエレクトロポレーションブラウディ 。興味のある読者は、酵母形質転換、代替プロトコル、およびアクション13,15の可能なメカニズムのさらなる議論の進化の徹底的な説明については、最近のレビューに向けられています。プラスミドは簡単に検出可能なタンパク質をコードする酵母の形質転換は、異種タンパク質の適切な発現および機能を確保するために、下流のテストのために、さらに不可欠です。無数の異なるタンパク質は、治療研究と、ELISAを免疫ブロッティングによるタンパク質の検出のために利用可能な抗体、および他の技術の最終的な目的に応じて適宜選択することができます。これらの技術のためのプロトコルは、完全に別の箇所16,17に記載されている、標準曲線と比較することによって形質転換された酵母からの異種タンパク質の産生のレベルを決定するために用いることができます。デモの目的のために、ショーへ酵母の生物学において非常に一般的に使用されるタンパク質の産生に成功し、この原稿は、蛍光顕微鏡を使用して、後続の検出を可能にコードするプラスミド緑色蛍光タンパク質（GFP）との変換を示します。
異種タンパク質を発現するプロバイオティック生物の生産にも同様に重要な部分3および4に記載されているように、胃腸組織内のこれらの微生物の適切な投与および検出です。強制経口投与を介して組換え酵母の投与からC57BL / 6マウスを、直接胃に酵母の制御された量の送達を可能にする自然18嘔吐することができません。しかし、不適切な動物の取り扱いと強制経口投与は、食道損傷や穿 孔、胃穿孔、気管内投与、および誤嚥性肺炎19,20につながることができます。悪い技術と経験不足はさらに、マウスの免疫応答と実験RESUの変動を増加させることができます強制経口投与21,22時に動物のストレスに起因しているLTS、。適切な手法で実践は、このように、動物の不快感を減衰させることができるだけでなく、実験結果の精度を高めることができます。本稿では説明し、組換え酵母の制御された用量の投与のための動物の取り扱いと強制経口投与を示しています。
最後に、酵母および異種タンパク質の存在のためのリンパ組織を分析することによって組換え酵母の配信の成功を確認することが重要です。最も簡単かつ予測酵母の存在について試験することができる胃腸の免疫組織がパイエル板です。パイエル板は、粘膜免疫応答の誘導23の主要な部位である小腸に沿って二次リンパ器官です。内腔からの抗原は、上皮でmicrofold（M）細胞を介してtranscellularly転送され、パイエル板中に放出され、このように同封さらしますD抗原腸の管腔内容物に細胞を提示します。腸上皮を横切る粒子の取り込みはまた、杯細胞によって達成することができますが、これらの細胞のみを取る粒子径24で0.02μm未満に示されています。経上皮樹状突起はまた、腸管腔25から小さな粒子を取るCD103 +樹状細胞（DC）から延長しました。しかし、CD103 + DCは、細菌よりも大きな粒子を取ることが実証された報告は現在のところ存在しません。したがって、無傷のプロバイオティック酵母は、直径が3~6ミクロンの間の平均サイズ、M細胞によって取り込まれ、パイエル板に転写される可能性が最も高いです。ここで説明するこの手順では、簡単にプロバイオティクス細菌の取り込みを評価するために適合させることができるものの、生存可能な遺伝子組換え酵母のためのパイエル板の収集およびスクリーニングするためのプロトコルです。
要約すると、送達するための組換えプロバイオティクス酵母を評価します腸へrapeuticタンパク質は、動物の取り扱いおよび免疫学に分子生物学に及ぶ実験技術に習熟する必要があります。 1のためにここに提示されているプロトコル）を簡単に否定的に抗生物質を含まない選択することができます生成と栄養要求性酵母株のスクリーニングは、2）代替プロトコルは、酵母を形質転換し、異種タンパク質の発現を可能にする、3）適切な動物ハンドリング技術とのための強制経口投与のデモンストレーション組換え酵母の胃内送達、およびパイエル板の解剖のための4）プロトコル、生存組換え酵母で機能的異種タンパク質をスクリーニングします。組み合わせることで、これらのプロトコルは、胃腸管に異種治療用タンパク質を送達することができるプロバイオティクス酵母株の生成およびテストを可能にします。
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Protocol
栄養要求性酵母株を生成する1. UV突然変異誘発
- UV照射の必要な用量を決定するために、生存曲線を生成します
- 標準的な手順26に従って、表1に記載されたYPD（酵母エキスペプトンデキストロース）メディアおよび他の試薬 を準備し、YPD培地5〜10mlの中に単一コロニーを接種します。少なくとも8時間、飽和するまで30°CO / Nでローラードラム上で培養をインキュベートします。
- プラスチックキュベット中の水に細胞を1:10に希釈することにより、分光光度計を用いて、O / N培養物の細胞濃度を決定します。 20ml中10 7細胞/ mlの濃度の滅菌蒸留水に細胞を希釈します。
- 14センチメートルUV電球の下に板を置き、ふたを取り外して、無菌のプラスチックシャーレに希釈した細胞を注ぐと。
- このような細胞その各増分後の細胞を500μlの抽出、シリアル5000μJとUV照射の万μJの用量に細胞をさらします0μJ、5000μJ、万μJ、15,000μJ20,000μJ、25,000μJ30,000μJ、40,000μJ、50,000μJUV照射への曝露後にサンプリングされています。転送を1.5 mlチューブを無菌であり、直列に滅菌水で1:10増分で希釈するために細胞サンプルを抽出しました。
- 1分間16,000×gで微量で遠心分離により各希釈で細胞をペレット化。酵母細胞をプレーティング用滅菌水の適切な100μlの体積中の上清を吸引および再懸濁。 YPD固形培地を含むプレート上に再懸濁した細胞のフルボリュームをピペットし、均等に各プレートを横切って細胞を分散するために、滅菌スプレッダーを使用します。
- 光活性化およびUV誘発突然変異の修復を防止するためにアルミホイルでメディアとカバープレートの乾燥を防ぐためにパラフィルムでプレートの縁部を包みます。実行可能な酵母コロニー（ 図1）の成長を可能にするために逆さまに30℃で2〜4日間培養します。
- numbeを数えます必要に応じてカウントされたコロニーをオフにマークするペンの助けを借り、手持ちの電子カウンタペン、またはカウンターでコロニーのrは、倍率で立っています。照射された酵母の生存曲線（ 図2）を生成する UV照射の各μJ用量で合計播種した細胞のパーセンテージとしてプロット。
注：一倍体酵母株は、同一の生存率に到達するために二倍体株のUV照射に対する低用量を必要とすると予想することができます。このようなRAD1 Sなどの機能性DNA修復酵素を欠く酵母の菌株cerevisiaeの変異体は 、非常に低用量での紫外線照射の存在を示すための陽性対照として使用することができます。 - UV変異誘発の用量を決定することは1.1.7で確立生存曲線を参照することにより、スクリーニングのために使用されます。 yが50に等しい生存曲線に沿った点のx値は、酵母の50％が生存するUV照射量です。この低い生存率で変異体をスクリーニングすることになることがあり特に二倍体酵母のために成功変異した株のより高い収率、。 WT S. 50％生存用量ブラウディは 、 図2に示すように、約18,000μJあります。
注：このような高いUV線量は、対象の栄養要求性マーカー遺伝子以外の細胞経路の遺伝子における変異のリスクを増加させるが、この欠点は、栄養要求性マーカー遺伝子の両方のコピーに変異を誘発する必要性に対してバランスをとらなければなりません。唯一の遺伝子コピーは、90％でのように、より高い生存率でスクリーニング、変異されなければならないで半数体株については、さらなる変異のリスクを減少させ、まだ栄養要求性突然変異体の十分な生成を可能にします。
- 栄養要求性酵母株のためのUV変異誘発およびスクリーニング
- ステップ1.1.1-1.1.3で説明したように酵母を準備します。
- 1.1.8で決定されるように、50％の生存率に相当するUV照射の線量に酵母をさらします。 WT S.のためのブラウディ 、この用量WA約18,000μJ（ 図2）に決定です。
- UVの1ミリリットルを収集するボリュームは1分間16,000×gで微量遠心分離によって、酵母、ペレットを照射します。 100μlの滅菌水に上清を吸引し、再懸濁細胞。
- 変異体の選択
- このようなURA3のように選択を使用している場合-栄養要求性変異株を、プレートは、機能のUra3酵素を欠く細胞を選択するために5フルオロオロ酸（5-FOA）を含む培地に酵母を照射します。
注：のUra3の機能的コピーを含む任意の酵母は、細胞死につながるとのura3の容易な選択を可能にする、毒素5-フルオロウラシルに5-FOAを変換する-機能のUra3 27を欠いているコロニー。 TRP1;αアミノアジピン酸28を含む培地を使用し、MET2およびMET15マーカ類似の選択アプローチはLYS2とLYS5に対して可能です。 5-フルオロアントラニル酸29;それぞれ、メチル水銀30,31、。 - 5-FOAを含む最少培地上に再懸濁した細胞を100μlをピペットで均一にコートプレートに滅菌スプレッダーを使用します。パラフィルムでプレートを包み、生酵母コロニーの成長を可能にするために、逆さまに30℃で2-4日間インキュベートします。
- YPD、ウラシルにrestreakingによって5-FOAプレート上に現れる任意のコロニーの表現型を- - URA3を確認して、5-FOAプレート（ 図3）。単一コロニーの一部を収集するために滅菌爪楊枝の先端を使用して、ゆっくりと新鮮なYPD、ウラシルを横切ってセルをドラッグして- 、および5-FOAプレート。再び逆さまに30℃で2-4日間包まれたプレートをインキュベート。
注：非生存細胞は、任意の引き上げ成長（ 図3）なしでのみ不透明なスメアとして現れる一方で生存可能なコロニーを上げ、略円形成長として表示されます。
- このようなURA3のように選択を使用している場合-栄養要求性変異株を、プレートは、機能のUra3酵素を欠く細胞を選択するために5フルオロオロ酸（5-FOA）を含む培地に酵母を照射します。
- SCR突然変異体のeening
- 選択方法が利用できない、UVの連続1：10希釈液を準備するための栄養要求性変異を生成する場合、滅菌水に酵母細胞を照射し、YPD培地上に希釈液をピペットで、均等にコートプレートに滅菌スプレッダーを使用。
- パラフィルムでプレートをラップし、逆さまに30℃で2-4日間インキュベートします。互いに容易に区別することができる個々のコロニー、プレート当たり通常これ以上の約100未満のコロニーの成長のために許容される希釈を決定します。
- この決定された希釈で1.2.1-1.2.3とプレートの細胞に記載されているように酵母サンプルのUV突然変異誘発を繰り返します。 YPD培地に希釈した酵母をピペットで、細胞を分配するために、滅菌スプレッダーを使用し、2〜4日間30℃で逆さまに包まれたプレートをインキュベート。
- 関心の代謝物を欠く選択培地上にレプリカ平板法によって栄養要求する画面が表示されます。まず、プレートスタンドに無菌ベルベットのパッドを確保プレートの向きをマーキング、ベルベットの上にUV照射コロニーでプレートを反転させます。
- 次に、ベルベットの上に関心の代謝物を欠く新鮮なプレートを反転し、軽くプレートにベルベットから細胞を転送するために押し下げます。 4℃で原版を保管してください。ラップと逆さまに30℃で2-4日のために新しいプレートをインキュベートします。
- 選択培地上にYPDから再ストリーキングコロニーによってレプリカメッキ、スクリーン変異体の代替として。単一コロニーの一部を収集し、静かに新鮮なYPDプレートと関心の代謝物を欠くプレート全体の細胞をドラッグし、滅菌爪楊枝の先端を使用してください。再び逆さまに30℃で2-4日間包まれたプレートをインキュベート。
注：注意が真の栄養要求性細胞の均質な集団を確認するために、単一のコロニーとストリークアウトコロニーを複数回選択するように注意しなければなりません。
- 変異体の選択
- さらにinoculatによって照射された細胞の表現型を確認（突然変異体- - URA3のメディア例えば、ウラシルで）YPDし、適切な代謝産物を欠く培地の両方5〜10mlの中に、単一のコロニーをる。 YPD培地ではなく、代謝産物の非存在下での細胞の成長を確認するために30°CO / Nでローラードラム上でインキュベートします。
注：固体培地上での成長パターンは明らかに酵母栄養要求ステータスを示すべきであるが、いくつかの酵母がストレスを容認し、固形培地上に小さな、ゆっくりと成長してコロニーを形成するが、まだ液体培地中で同じ条件（未発表の観察）を容認しないようにすることが可能です。液体培養への接種は、このように徹底的に紫外線照射変異株の成長パターンを確認するために実施すべきです。 - 確認された栄養要求性変異株の長期保存のために、10ミリリットルYPDに細胞を接種し、30℃でローラードラムのO / Nでインキュベートすることによって、グリセロールストックを準備します。 2500 XGと吸引メディアで3分間の遠心分離により細胞をペレット化。 50％で細胞を再懸濁し滅菌濾過し、グリセロール、-80℃で凍結バイアル、およびストアに転送します。
注：UV変異誘発酵母は、潜在的に興味の栄養要求性マーカー以外の複数の遺伝子に突然変異を含みます。他の場所で2説明したように検証栄養要求性変異体の使用を続行する前に、これらの株はさらに、遺伝子配列決定およびpH、胆汁酸ストレスに対する抵抗性の評価、およびプロバイオティック株に関連する他の特性を介して分析する必要があります。 6 -また、PCRの相同性またはCRISPRの使用/ Cas9より選択的に栄養要求性マーカーを変異への標的化は、UV突然変異誘発4の代替として考慮されるべきです。
2.酵母形質転換
- 酵母のLiOAc変換
- YPD培地5〜10mlの中に単一酵母コロニーを植菌し、30°CO / Nでローラードラム上でインキュベートします。
- 対数増殖期に誘導し、プラスミドの取り込みの効率を増加させるために、デプラスチックキュベットに滅菌水での細胞の1:10希釈物を測定するために分光光度計を用いてtermine細胞濃度。新鮮な暖かいYPD 50mlに- （2.5×10 6細胞/ ml、約2×10 6）と文化までを200rpmに設定オービタルプラットフォームシェーカー上で細胞をインキュベートODに0.16から0.2の600を O / N培養物を希釈約1×10 7細胞/ ml、通常約4時間に達します。
注：形質転換効率は、プラスミドDNAのμgのあたりうまく形質転換された酵母コロニー形成単位（CFU）の数の関数として測定することができます。プラスミドDNAのμgのあたりの形質転換されたコロニーの効率化をもたらします。対数増殖期の間、酵母細胞および収集を継代培養すると、形質転換効率が12を上昇させる要因の一つです。 - 3分間2500×gの遠心分離により細胞をペレット。
- ペルを再懸濁することにより、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに上清および転送細胞を吸引1ミリリットル滅菌水でら。
- 微量で1分間、16,000×gで遠心分離により細胞をペレット化は、上清を吸引し、1mlのTE / LiOAc（トリスEDTA LiOAc）緩衝液中で再懸濁することにより細胞を洗浄します。
- 2×10 9細胞/ mlの濃度になるようにTE / LiOAc緩衝液中で遠心分離し、再懸濁細胞を繰り返します。
- 以下のそれぞれと転換混合物を準備します。TE / LiOAc緩衝液中で調製酵母を50μl、キャリアDNA（10μgの/μl）を5μlの、及びプラスミドDNA（1μg）を1μl。プラスミドDNAのマイクログラムまたは増加した形質転換効率32につながらない可能性があり、DNAの量を増やすように滴定することができます
注：1の栄養要求性マーカーを欠く変異酵母株の場合は、マーカーをコードする唯一の1つのプラスミドは、サンプルごとに変換することができます。さらに、GFPなど簡単に検出可能なタンパク質をコードするプラスミドの使用は、適切なフォールディングおよび異種PRの発現の効率的な決意を可能にします変換に続く酵母株によってotein。 - 各製剤に、徹底的にPEG / LiOAc / TEと渦の300μlを添加します。 PEGと無傷の細胞のインキュベーションは、効率的な形質転換13のために不可欠です。
- 200 rpmでオービタルプラットフォームシェーカー上に置いたビーカーにマイクロ遠心チューブを配置することにより、撹拌しながら30分間30℃で準備をインキュベートします。
- 42℃の水浴中で15分間、各反応および熱ショック細胞にDMSO 35μLを加えます。 DMSO 33の追加の利点の相反する報告があるが、無傷の酵母細胞の熱ショックを大幅に形質転換効率12を増加させることが示されています。
- 滅菌水を、2.1.5のように遠心分離によりペレット化し、吸引または上清をオフにピペッティングし、1ミリリットル中に再懸濁することにより細胞を洗浄。静かに細胞ペレットを破壊するために上下にピペットと。
注：徹底的にメディアの使用ので、上清を除去することが重要ですコンピテント細胞の生成において、Dは、酵母の増殖およびコロニー形成を阻害することができます。 - 2.1.5のように繰り返し、細胞ペレット、上清を吸引し、100μlの滅菌水で細胞を懸濁します。選択プレート上にフルボリュームをピペットし、滅菌スプレッダーに均一にコート形質転換した酵母でプレートを使用しています。
- メディアの乾燥を防止し、形質転換された酵母細胞の増殖を可能にするために、逆さまに30℃で2日間インキュベートし、パラフィルムでコーティングされたプレートの端を包みます。収率が他の株（ 図4）のためにはるかに低くすることができますが、成功した、効率的な形質転換およびサッカロマイセス・セレビシエの栄養要求性選択は、変換の準備あたりのコロニーの数が多いが得られます。
- 逆さまに短期のStore酵母プレート（一般的に1-3週間）、4℃で覆われました。長期保存のために1.2.5で説明したように形質転換酵母のグリセロールストックを準備します。
注：CFを形質転換したさらなる研究のテストUは、プラスミドの安定性を決定し、異種タンパク質の適切な発現を評価するために必要です。プラスミドの安定性34、イムノブロッティングの使用の完全な説明は、細胞試料17から回収された変性タンパク質を検出するために、酵素は、適切に三次元タンパク質16、及び35が他の場所で利用可能である酵母研究におけるGFPの使用を折り畳ま検出するための免疫吸着アッセイ（ELISA）を連結した。 図に6は、形質転換された S.で成功したGFP発現の代表的な画像を示しています非形質転換細胞にセレビシエ相対。そのような蛍光タンパク質を使用することは、効率的に成功した異種タンパク質の産生を決定する1つの手段です。
- 酵母のエレクトロポレーション
- YPD培地5〜10mlの中に単一酵母コロニーを植菌し、30°CO / Nでローラードラム上でインキュベートします。
- 滅菌水で細胞の1:10希釈液を測定する分光光度計を用いて細胞濃度を決定します。ディ約0.3のOD 600等価に100ミリリットルの新鮮な暖かいYPD培地でリュートO / N培養。通常4-5時間、約1.6のOD 600に達するまで 200回転に軌道プラットフォームシェーカーセットに30℃で継代培養をインキュベートします。各100ミリリットルのサブカルチャーは、二つの変換反応のために十分な馴化細胞を生成します。
- 3分間2500×gの遠心分離により細胞をペレット。上清を吸引し、50ミリリットルの氷冷滅菌水に再懸濁することにより細胞を洗浄します。 、細胞をペレット化し、上清を吸引し、そして新鮮な50ミリリットルの氷冷滅菌水に再懸濁することにより洗浄を繰り返します。
- 再び細胞をペレット化し、50mlの氷冷エレクトロポレーションバッファー（1 Mソルビトール、1mMのCaCl 2を）に再懸濁します。
- 繰り返し2.2.3のようにスピン、上清を吸引し、そして20ミリリットルの0.1M LiOAc / 10mMのDTT中で再懸濁細胞。 30分間30℃でローラードラム上に細胞懸濁液をインキュベートします。 LiOAcおよびDTT中の細胞のプレインキュベーションは、相乗的に増加しますエレクトロポレーション36の効率。
- 2.2.3のように細胞をペレット、上清を除去し、そして50ミリリットルの氷冷エレクトロポレーション緩衝液中に再懸濁することにより洗浄します。 1ミリリットルの最終容量に氷冷エレクトロポレーション緩衝液中で遠心分離し、再懸濁した細胞を繰り返します。
- エアコン酵母細胞、滅菌エレクトロポレーションキュベット、およびプラスミドDNA：氷の上で準備します。すぐに1ミリリットルエレクトロポレーションバッファ内の馴化細胞の最終再懸濁した後、約1μgのプラスミドDNAので400μlのエアコン酵母細胞を結合し、氷冷0.2μmのエレクトロポレーションキュベットに追加します。 DNAの増大した量の使用は、若干の変換効率11を増加させることができます 。 2.5 kVの25μFにエレクトロセットでエレクトロポレーション、その後、5分間氷上で反応をインキュベートします。
注：2.1.7で説明したように、一の栄養要求性マーカーを欠く突然変異体酵母株は、サンプルごとに変異マーカーをコードする一つのプラスミドで形質転換することができます。また、使用してGFPなど簡単に検出可能なタンパク質をコードしているプラスミドは、適切な折り畳みおよび変換に続く異種タンパク質の発現の効率的な決意を可能にします。 - YPD 1混合物：転写は1 8mlのに細胞を電気穿孔し、1Mソルビトール、細胞を60分間30℃でローラードラム上でインキュベートすることを可能にします。
- 1 YPD：1 Mソルビトール100μlの1 2.2.3および再懸濁のように細胞をペレット化。プレート1Mソルビトールを含む選択培地上にフルボリューム、パラフィルムでプレートの縁をラップし、形質転換された酵母細胞の増殖を可能にするために、2〜5日間30℃で逆さまにプレートをインキュベート。
注：2.1.14と2.2.7で説明したようにそれは、異種タンパク質の適切な発現を評価するために形質転換した酵母をテストすることが重要です。
形質転換酵母によるマウスの3強制経口投与
- 研究所アンの管理と使用に関するガイドに従って、すべての動物の世話と取り扱い手順を実行しますimals・機関動物実験委員会の承認。
- 選択培地5〜10mlの中に形質転換栄養要求性酵母の単一コロニーを接種することにより、O / Nの酵母培養物を準備します。飽和するまで30℃でローラードラム上で少なくとも8時間、O / N培養液をインキュベートします。
注：4.7に記載のようにGFPなどのプラスミドをコードする試験タンパク質の使用は、強制飼養酵母におけるタンパク質発現試験を容易にするために可能になります。 - タンパク質発現の最大誘導のため、ログ相成長を誘導するために、2.1.2で説明したように、約0.16から0.2適切なメディアのミリリットル50でのOD 600等価に希釈することにより、O / N培養物から継代培養を準備します。
- 1.1.2のように継代培養細胞の濃度を決定し、10 9細胞/ mlに調整します。サンプルローディングの精度と使いやすさを向上させるために、グループごとに数百μlの余分なボリュームで、各マウスについて100μlの用量を準備します。
- 2,500×gで遠心分離により細胞をペレット化3分または1分間16,000×gで微量インチ滅菌等量の水を添加し、穏やかにピペッティングにより上清を吸引し、細胞を再懸濁します。
- 100μlの増加に気泡とセットプランジャーを排除することを確認され、1ミリリットルの無菌注射器と負荷酵母試料に適切なゲージの胃管栄養針（15〜グラムのマウスについての22 G）を修正しました。強制経口投与対照マウスに滅菌水で追加の注射器をロードし、任意の汚染酵母の存在を確認してください。
- 人差し指と親指がしっかり首（ 図6A）の周りの皮膚を把握して、非利き手を用いて強制経口投与するマウスをピックアップ。タック下半身の動きを防ぐために、小指の下の尾。グリップが安全であると強制経口投与時の内部組織への損傷を防ぐために、その頭を移動するマウスを禁止していることを確認してください。
注：そのようなマウスに対して針を保持することにより、胃管栄養針を挿入する必要がありますどの程度まで見積もり電球があっても胸骨の剣状突起です。針のこの長さを挿入すると、通常、胃管栄養針電球が胃に入ることができます。 - 利き手を使用して、優しく、口やのどの奥の屋根に沿って針を傾ける中央のやや左側に保つことによって、マウスの食道への胃管栄養法の針を挿入します。マウスは、針の電球を飲み込むと、針が3.7（ 図6B）で推定されたポイントにさらにわずかに下降することを可能にするのを待ちます。任意の抵抗が強制経口投与針の挿入中、または任意の時点でマウスが息をのむし始めると感じている場合は、そっと針を除去し、再び食道を探してみてください。
- マウスは強制経口投与針の電球を飲み込んだ後、静かに直接マウスの胃に酵母を100μl（10 8 CFU）を管理するために、シリンジプランジャーを押し下げます。
注：マウスは、投与18,19の後に強制経口投与の溶液のいずれかを吐くことができないが、 21,37の間に発生するSUP>、それが可能です。適切な胃管栄養針を挿入するだけでなく、溶液の体積および粘度を調整するには、逆流を制限し、正確な投薬を確実にするために助けることができます。 - 慎重にマウスの胃と食道から胃管栄養針を削除し、ケージにマウスを返します。マウスは呼吸と強制経口投与針が適切に処置を通して、および解決策を吸引しなかったことが挿入されたことを確認するために、強制飼養後に正常に動いていることを確認してください。
4.マウスのパイエル板の収穫と生存酵母コロニーの単離
- 適切な時点後、胃管栄養法では、典型的には4時間、IACUCを使用して犠牲マウスは、メソッドを承認しました。つま先のピンチ以下の応答性の欠如を確認し、マウスを犠牲にするような頸椎脱臼などの二次対策を使用しています。多くの研究は、最大の効率及びタイミングを示しているように、追加の時点でも、試験することができます上皮を通過取ることは、粒子38,39依存しています。
- 完全に露出腹部にマウスを置き、70％エタノールを噴霧することにより腹部領域を殺菌。任意の内部組織を傷つけないように注意しながら、ハサミで毛や皮膚を介して横切開を行います。手動で切開は腹膜、腹部臓器を覆う薄い漿膜ライニングを露出するようにさらにこじ開けます。静かに腹膜を持ち上げ、腸を露出させるために横切開を行います。
- 慎重に腸間膜動脈、脂肪、および他の組織からの小腸をいじめる鈍鉗子を使用しています。大腸の開始時に、盲腸に、マウスの腹部の左上の象限に、胃から腸組織の大きなポケットを小腸を公開します。
- 1〜3ミリメートル小腸に沿って不透明な組織の略円形のパッチ（ 図7）を探して、パイエル板を分離します。湾曲した解剖SCISを使用して、SORS、周囲の粘膜固有層のいずれもが収集されていないことを確認するために余白を残して、パイエル板のドームを切り取ります。
注：ほとんどのマウスは4-8見やすいパイエル板との間で持っています。直接頭上の照明と地域の手順を実行すると、パイエル板を可視化することができる容易さを増加します。 - 完全イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）中で解剖パイエル板を収集します。
注：無菌技術を使用して、酵母プレートの胃腸の細菌汚染を防ぐために、収集培地中に抗生物質を含めることが重要です。 - 40μmのセルストレーナーを通して歪みパイエル板は、コレクションのメディアを排除します。 50mlのチューブの上に新鮮な完全IMDMで洗浄パイエル板、静かにパイエル板を分割する1ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用します。 7分間1800 rpmで遠心分離することにより、歪み細胞をペレット。上清を吸引し、再懸濁細胞内で約100μlの最終容量。
- 選択酵母メディアに緊張した細胞を適用し、細胞を均一に分配するために、プレートスプレッダを使用しています。パラフィルムでプレートの端をラップし、マウスのパイエル板から回収された任意の実行可能な酵母の生育を可能にするために、逆さまに30℃で2日間プレートをインキュベート。
注：パイエル「パッチからの酵母の回復後のさらなる研究は、株がこれらの免疫組織に適切に折り畳まれた異種タンパク質を提供することが可能であることを確認するために必要です。 2.1.14に記載されるように、そのような方法は、GFP 2,40などの蛍光タンパク質を検出するために免疫ブロット法、ELISA、または蛍光顕微鏡を含むことができます。
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Representative Results
UV照射後の生存曲線の生成は、別個のコロニー形成単位（CFU）を形成することができるように希釈された酵母細胞のプレーティングを必要とします。上記のように収集された各500μlのサンプルは、約5×10 6個の細胞が含まれています。しかし、プレート当たり100以上のコロニーが正確に区別することが困難です。希釈していない試料ならびに照射細胞の連続1時10希釈をプレーティングすることは、したがって、図1に示されているように、CFUは、各UV線量で列挙することができることを保証する。希釈係数を乗じたCFUカウントは、その後の総数で割って各用量での生存率を決定するために、各500μlのサンプル中の元照射された細胞。 図2は、二倍体野生型Sの計算された割合を示していますブラウディ細胞0μJ、5000μJ、万μJ、15,000μJ20,000μJ、22,500μJ、25,000を生き残ることができますμJ、35,000μJ、および50,000μJ。これらのデータは、50％の生存率に相当する投与量を見つけるために使用することができる明確な曲線を確立します。
酵母細胞のUV線量照射を選択した後、機能的栄養要求性マーカー遺伝子の欠如を確認するために、突然変異体コロニーをスクリーニングすることが重要です。選択方法の使用は、1.2.3.1に記載され、 図3に示されるように、有意な表現型の確認の効率を高めます。無傷のUra3によって毒素5-FUを5-FOAの変換を利用するURA3選択の例が示されています。 TRP1;類似のアプローチがLYS2とLYS5ために利用可能であり、MET2およびMET15およびこれらの変異の選択の効率を高めます。ケアは、スクリーニングの間に個々のコロニーを選択するように注意しなければなりません。一貫性のYPDおよび5-FOA上の変異コロニーの成長ではなく、ウラシル- 、プレートindicat栄養要求性の表現型をES。
図4は、野生型 S.の変換効率を示します一般的に使用される実験室Sに ブラウディ （Sb）を相対LiOAc（LiOAc）およびエレクトロポレーション（電気）技術の両方を使用してセレビシエ株 （SC）。 LiOAc変換はS.のための非常に効率的であるが、 セレビシエ 、S。の変換効率ブラウディが大幅 。エレクトロポレーションを使用して改良された形質転換酵母からの適切なタンパク質発現を解析する方法の一例として、蛍光顕微鏡の図5で使用した図です 。明（A）および蛍光（B）の画像は 、Sのために示されていますセレビシエは、形質転換された酵母由来の異種タンパク質の機能発現を示す、URA3のGFPをコードするプラスミドで形質転換しました。細胞はコンカナバリンA 2の（コート5μlのコーティングされたカバースリップを使用して、より良い視覚化のために固定化することができます各22×22ミクロンのカバーガラスと空気乾燥の上に水の中mg / mlでストック溶液）。
図6Aは、強制経口投与の直前に開催されたC57BL / 6マウスを示しています。手は、マウスが任意の方向にヘッドを移動することができないことをしっかりと、マウスの背中と首を把握します。このホールドは、胃管栄養針を正確に配置し、組織損傷のリスク減少とすることができます。 図6Bは、マウスが強制飼養針を飲み込んだ後に開催された胃管栄養針を示しています。インキュベーション期間の後、犠牲マウスの小腸は慎重に、図7に示すように、周囲の組織から離れてからかわれるべきである。この操作は、周囲のいずれかを収集せずにパイエル板を簡単に識別するためのパッチのクリーンな解剖を可能にします粘膜固有層。 最後に、図8は、パイエル板から実行可能な酵母CFUの典型的な回復を示しています。
表1.試薬一覧。説明は、この原稿にプロトコルのために使用される溶液のそれぞれを作るために必要な試薬、酵母培地とプレート、および変換バッファです。
図1酵母コロニーは、YPD培地上で増殖させた。実施例YPDプレートPの単位（CFU）を形成する実行可能なコロニーを示しますUV照射後robiotic酵母。セルを直列個々のCFUを区別し、カウントすることができるように希釈した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
二倍体プロバイオティクス酵母図2.生存曲線。実行可能なS.の数総播種した細胞のパーセントとしてブラウディ CFUは、UV照射（実線）のそれぞれμJの用量についてプロットしました。縦の赤い線はμJUVは、この酵母株の50％の生存率に相当する線量を示しています。 UV変異誘発からの損傷を修復することはできませんRAD1 S.セレビシエ変異株は、コントロール（破線）。として示されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</ A>
URA3 の図3.確認 - UVの表現型は、YPDにウラシルを細胞に照射 - 、 および5-FOAプレートの個々のUV突然変異体のコロニーからの細胞を滅菌爪楊枝の先端を使用して収集し、静かにYPD、ウラシルを横切って画線した- 。、および5 -FOAプレート。細胞は最初の二つの直交する交差線に画線し、その後新しい爪楊枝は、第二のラインを通過し、個々の細胞を分離するまで、細胞を拡散継続するために使用されました。真のURA3 -突然変異体（MUT）は、YPDメディアおよび5-FOAの存在下ではなく、ウラシルの非存在下で成長します。コントロールURA3 - S.セレビシエ （URA3 - ）とURA3 + SUP> S.ブラウディ （URA3 +）は、比較のために示されていると。酵母培地の適切な準備を確認するために、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サッカロマイセス 株の 図4.形質転換効率 。野生型S.ブラウディ （SB）および実験S.セレビシエ株 （Sc）が記載さLiOAc（LiOAc）およびエレクトロポレーション（電気）プロトコルを使用して形質転換しました。平均CFUはカナマイシン耐性マーカーをコードするプラスミドμgのあたりに得られた結果をプロットしています。バーは平均の標準誤差を示すエラーバーと重複実験の平均を示します。エス/ ftp_upload / 53453 / 53453fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.形質転換酵母による機能性タンパク質の発現。S. に空のプラスミド（A）プラスミドをコードするGFP（B）を用いて形質転換セレビシエは、蛍光顕微鏡を用いて分析しました。 GFPプラスミドで形質転換された酵母細胞内の蛍光は、機能的GFPの成功の生産を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
強制経口投与のためのC57BL / 6マウスの図6.適切に取り扱う。マウスが開催tightlです何の動きは（A）可能ではないように、小さな指の下に隠れて尾と非利き手でのy。胃管栄養針は、口の屋根に沿って咽頭に挿入されます。マウス。（B）プランジャーが押されているように、溶液はその後、胃を入力することができ、胃管栄養針の電球を飲み込むことが許可されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
パイエル板の図7の調製および解剖。小腸は矢印がパイエル板の数を指していると、他の臓器や組織から離れて解剖されて示されている。 より大きなversiを表示するには、こちらをクリックしてください。この図の上。
図8パイエル板から酵母回復。S で強制飼養マウスの生存可能な解剖、均質化後に検出CFU、および総パイエル板細胞のプレーティングの例ブラウディ 。細胞を、YPD酵母培地上に播種し、2日間30℃でインキュベートしました。マウスごとに回収されたCFUの典型的な収率は10未満であり、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
一緒に、プロトコルは、本明細書中に腸への異種治療用タンパク質の送達のための栄養要求性プロバイオティクス酵母株の開発とテストのために必要な基本的な手順を説明します。この操作および組換えプロバイオティクス酵母のテストは、個々の研究室では現在、慣れていない可能性があるとの技術とリソースが必要です。多数の以前の研究では、複数の酵母とマウスの株については、上記のプロトコルを説明したがこのように、これらの方法では、筆者の知る限り詳細な、統一された形で提示されていません。さらに、本原稿は、一般的に使用される実験室酵母株未満の十分に特徴づけされているプロバイオティクス酵母の遺伝子操作のための現在の標準化されたプロトコルを、適応に特に重点を置きます。 （パート1で説明した）突然変異誘発および形質転換（パート2）の両方のための多くのステップは、このような二倍体の操作のために最適化されなければならない、プロバイオティクス酵母isolatエス。本稿では、動物の扱い（パート3）と小腸のパイエル板免疫組織（パート4）の解剖に関連する潜在的な落とし穴を説明します。
多くの産業および臨床的に関連する酵母株は、大規模な遺伝子操作に即座に適合されないように、そのような高価な抗生物質を含まない増殖させ選択することができる栄養要求性突然変異体株を生成することが必要です。 UV変異誘発は、栄養要求性遺伝子7,41の迅速な非特異的な変異を可能にするような一手法です。生存曲線は、容易に変異体をスクリーニングするための適切な用量を決定するために（ 図1および図 2）を生成することができます。しかしながら、このアプローチは、酵母株の増殖速度または他の特性に影響を与えることができる標的変異をオフ誘発するリスクを伴います。ターゲットを絞ったノックアウトではなく、PCR構築またはCRISPR / Cas9システムを使用して生成することができます。その後のスクリーニングまたは選択突然変異体の（ 図3）は、栄養要求性酵母の同定を可能にします。 5-FOA培地上にプレーティングすることにより、選択の使用は、例えば、まだ機能URA3栄養要求性遺伝子を含む任意の酵母の迅速な排除を可能にします。可能な場合、この選択アプローチは、生成されたすべてのコロニーの分析を必要とする画面に好ましいかもしれません。選択またはスクリーニングのいずれかで、しかし、栄養要求性の状態を確認するために、選択培地上に個々の酵母コロニーを繰り返しストリーキングを実行するために重要です。
生成された変異体の形質転換は、異なるプロトコルを介して達成することができます。 LiOAc変換は、特に、最も一般的に使用される実験室S.ために、多くの酵母の形質転換に有効であるがセレビシエ株は、例えば、エレクトロなどの代替プロトコルは、他の酵母は、より高い効率（ 図4）で分離し変換することができます。それぞれの新しい株は、USIをテストする必要があります形質転換のための最適な条件を決定するために複数のプロトコルをngの。インキュベーション時間およびDNAの濃度を変化させる、例えば、全体的な変換効率に影響を与えることができ、各株33について試験し、最適化されるべきです。
強制経口投与は、直接免疫組織その後、酵母および異種タンパク質についてアッセイすることができ、マウス消化管、これらの組換え酵母の制御された用量の送達を可能にします。適切な経口栄養法（ 図6）は 、動物の不快感を最小限にし、実験精度を高めることが重要です。また、パイエル板は、腸からの組換え酵母の取り込みを評価するための重要な部位です。免疫組織のこれらのクラスターは、抗原のサンプリングおよび粘膜免疫応答の誘導の重要な部位です。直径酵母3-6ミクロンを含む大規模な抗原は、GAを横断するために、パイエル板のM細胞に取り込まれる可能性が最も高いですstrointestinal上皮および免疫細胞と相互作用します。パッチではなく腸管腔または粘膜固有層が収集されているよりも（ 図7）の中から、その細胞のみを確実にするために、パイエル板を切開する際には注意する必要があります。さらなるステップはまた、回収された酵母（ 図8）において異種タンパク質の適切な発現および機能を評価するために、次の解剖を取らなければなりません。酵母溶解物および免疫ブロット法からの全タンパク質の調製物は、タンパク質の発現を評価する一つの標準的な方法です。しかしながら、このアプローチは、タンパク質の折り畳みおよび機能に関する情報を提供しません。タンパク質機能を評価するために、酵母プラスミドコードするGFPで形質転換し、機能的なGFP発現（ 図5）を評価するために、パイエル板から回収した後、蛍光顕微鏡下で分析することができます。
要するに、この原稿があちこちのステップに及ぶ詳細な実験プロトコルの統一セットを提示マウスの腸からのプロバイオティクス酵母の回復に栄養要求性変異体の生成をメートル。伝統的に専門知識の単一の領域内に入らないプロトコルをコンパイルすることにより、これらの記述は、経口薬物送達ベクターとして設計されたプロバイオティクス酵母に対する免疫応答をテストし、さらに研究を促進します。著者らは、この研究では、新規の、プロバイオティクスベースの組換え治療法の開発に最も効率的なアプローチのために道を開く、議論を奨励し、試験した各酵母株のための実験方法の最適化を促進することを願っています。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、トレイシーJ.ラムに授与免疫とワクチンおよびNIH新イノベーター賞（1DP2AI112242-01）のための児童センターを通じて資金調達を認めます。著者らはまた、RAD1 Sの寛大な貢献のためナタリアP. Degtyarevaに感謝セレビシエ 。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | BioRad | 170-2501 | Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures |
| New Brunswick Roller Drum | Eppendorf | M1053-4004 | Example of roller drum for yeast culture incubation |
| UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075-03 | Example stratalinker |
| Stuart Colony Counter SC6PLUS | 11983044 | Fisher Scientific | Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen |
| Scienceware Colony Counter | F378620002 | Bel-Art Scienceware | Hand held colony counter pen |
| Replica plating device | Fisherbrand | 09-718-1 | Example of replica plating stand and pads |
| Velveteen squares | Fisherbrand | 09-718-2 | |
| L shaped sterile cell spreaders | Fisherbrand | 14665230 | |
| Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes | Sigma-Aldrich | D7656-1ML | Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation |
| Gavage needles | Braintree Scientific | N-PK 002 | For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used |
| 1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe | Becton Dickinson | BD 309659 | |
| Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps | Electron Microscopy Sciences | 77937-28 | Example of blunt forceps needed for dissection |
| Straight and curved dissection scissors | Electron Microscopy Sciences | 72966-02 and 72966-03 | Examples of scissors needed for dissection |
| IMDM | Life technologies | 12440053 |
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