Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.
Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate– + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3– + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.
Det overordnede målet med denne metoden er å måle glycolytic frekvensen av cellene ved hjelp av ekstracellulært flux analyse. Kvantitativ måling av glycolytic hastighet ved hjelp av ekstracellulære forsuring er det ønskede sluttpunktet for mange eksperimenter. Imidlertid er den totale hastigheten til ekstracellulær surgjøring summen av to komponenter: respiratorisk surgjøring i form av CO 2 (som hydrater til H 2 CO 3 deretter spaltes til HCO 3 – + H +), og glykolytisk surgjøring i form av laktat – + H +.
Bidragene fra CO 2 til total ekstracellulære forsuring har inntil nylig vært ansett ubetydelig i målingen plattformen som brukes her, XF24 analysator 7. Men det er klart i flere andre systemer som CO 2 kan være en viktig bidragsyter til ekstracellulære forsuring 4-5. Flere papirer erkjenne dette conbidrag, men ikke forsøk direkte kvantifisering av CO 2-avledede syre 3,8,9. Vi har nylig demonstrert kvantitativt at CO 2 produksjon er en betydelig kilde til ekstracellulært forsuring i dette systemet 6. Videre, selv om det er flere metabolske baner som genererer CO 2 fra glukose katabolisme, de som er utført av matrise dehydrogenaser i sitronsyresyklusen er den overveldende bidragsytere og alle andre kilder genererer mengder CO 2 som er innenfor eksperimentell feil 6.
Uten korreksjon for CO 2 produksjon, er ekstracellulær surgjøring derfor et tvetydig indikator for glykolytisk hastighet og kan ikke brukes kvantitativt. Vår forrige publisering fremhever flere tilfeller der luft CO 2 omfatter mesteparten av den totale forsuring signal, selv i celler generelt antas å primært bruke glykolyse 6. I tillegg,respiratorisk CO to bidrag til total surgjøring varierer mye i løpet av vanlige metabolske profilering eksperimenter som viser at riktig sammenligning av de glykolytiske frekvensen under forskjellige deler av et eksperiment som krever korreksjon for CO 2.
For å måle den glykolytiske frekvensen av celler ved hjelp av frekvensen av ekstracellulær surgjøring, er det nødvendig å omdanne pH-endringer til endringer i total H + generert, og å subtrahere det ekstracellulære surgjøring forårsaket av CO 2 frigjøres under drift av sitronsyresyklusen. Her beskriver vi en grei metode for måling av ekstracellulær proton produksjonshastighet (fra ekstracellulære forandringer i pH-verdien og den kalibrerte bufring kraften i analysemedium) og CO 2 produksjon (fra ekstracellulære endringer i O 2 konsentrasjon), og viser hvordan man skal beregne glykolytisk hastighet ved hjelp av disse målingene.
Denne metoden styrke ENS nytten av ekstracellulære forsuring måling ved å bruke det til riktig beregne glycolytic sats som definert av laktat produksjon. Uten korreksjon for luft CO 2 (eller direkte måling av laktat), er det umulig å fastslå om og i hvilken grad den totale forsuring raten reflekterer glycolytic rate, konfunderende tolkningen av eksperimenter som bruker total ekstracellulære forsuring som en direkte måling av laktatproduksjon.
BEREGNINGER
CO 2 og laktat er innenfor eksperimentell feil, de eneste to bidragsytere til ekstracellulære syreproduksjon, basert på eksperimenter med myoblast celler 6. Derfor kan hastigheten av total ekstracellulær surgjøring (PPR, proton produksjonshastigheten) kan defineres som:
PPR tot = PPR resp + PPR glyc ligning 1
. _content "> hvor tot = totalt; resp = åndedretts; glyc = glycolytic glycolytic PPR er dermed:PPR glyc = PPR tot – PPR resp Equation 2
Her,
PPR tot = ECAR tot / BP Equation 3
hvor ECAR = ekstracellulære forsuring hastighet (km / h / min), og BP = buffering effekt (mph / pmol H + i 7 mL), mens
PPR resp = (10 pH-pK 1 / (1 + 10 pH-pK 1)) (maks H + / O 2) (OCR tot – OCR rot / MYX) Ligning 4
der K 1 = kombinert likevektskonstanten av CO 2 hydrering og dissosiasjon til HCO 3 – + H +; max H + / O 2 = the CO to avledede surgjøring for en bestemt metabolsk transformasjon, for eksempel fullstendig oksydasjon av glukose til 6; OCR = oksygenforbruk rate (pmol O 2 / min), og OCR rot / MYX = non-mitokondrie OCR.
Ligning 4 isolerer mitokondrie OCR ved å trekke enhver ikke-mitokondrie OCR (definert som OCR som er motstandsdyktig mot mitokondrie åndedretts gifter rotenon og myxothiazol) og står for den maksimale H + generert per O 2 forbrukes for hvert substrat (maks H + / O 2 ) (se 6), såvel som andelen av CO 2 gir opphav til H + ved den eksperimentelle temperatur og pH (10 pH-pK 1 / (1 + 10 pH-pK 1). For fullstendig oksydasjon av glukose, mitokondriell Oxygen Forbruk Rate (OCR) er nøyaktig lik frekvensen av CO 2 produksjon. I begrenset analysen volumet av ekstracellulært fluks måling, CO 2 råvarerd av respirasjon forblir fanget i analysemedium. Det meste av det innfangede CO2 blir hydrert til H 2 CO 3, som deretter spaltes til HCO 3 – + H +. En liten fraksjon forblir oppløst, men ikke hydrert, og en annen liten fraksjon er hydratisert men ikke dissosiert, som diktert termodynamisk ved den kombinerte likevektskonstanten til CO 2 hydrering og dissosiasjon til HCO 3 – + H + ved forsøkstemperatur (37 ° C) og pH- (~ 7,4).
Således, den fullstendige ligning for beregning av PPR g ved å subtrahere PPR resp fra PPR tot er:
PPR glyc = ECAR tot / BP – (10 pH-pK 1 / (1 + 10 pH-pK 1)) (maks H + / O 2) (OCR tot – OCR rot / MYX) Equation 5
jegn denne måten, priser av respirasjon og glykolyse, samt tilhørende ATP produksjonsrater, kan kvantitativt bestemmes fra enkle målinger (oksygenforbruk, ekstracellulære forsuring, bufferkapasitet) og import eller beregning av andre nødvendige verdier (H + / O 2 , P / O, og likevektskonstanten K 1) 6. Eksperimentet er beskrevet her utdyper standard teknikker for å bruke Ekstracellulær Flux Analyzer som Seahorse XF24 10,11; for andre ekstracellulære fluks måle formater (f.eks XF e 96, eller XFP), bør alle volumer under skaleres riktig.
Bufring kraften i analysemediet kan måles ved konstruksjon av en standard kurve, enten direkte i den ekstracellulære flux plattformen eller separat ved hjelp av en kalibrert pH-probe. Her er tre alternativer for måling bufring av ekstracellulære flux assaymedium gitt, blant annet ved hjelp av alle injectipå portene på ekstracellulære flux analysator med cellefrie prøvebrønner, eller med bare den siste injeksjonen port i celleholdige brønner (§ 1) eller ved hjelp av en ekstern måling av pH (§ 2). Se vedlagte regneark for de fullstendige beregninger av eksempeldata.
For å måle bufring strømkilde ved hjelp av pH-detektering av evnen av det ekstracellulære fluks instrument, er det tryggeste for å bruke cellefrie brønner for å minimalisere signalvariasjon. Imidlertid eksisterer innenfor feil noen statistisk forskjell mellom cellefrie og celle-inneholdende brønner ved å utføre denne målingen (data ikke vist). MERK: variasjon er beskrevet i trinn 1,7 bærer den fordel står for eventuelle endringer av buffer som er tillagt av tilsatte forbindelser eller ved tilstedeværelse av celler, med den ulempe at mer støyende signal. Men som nevnt ovenfor, ble ingen signifikante forskjeller funnet i den beregnede bufring kraft mellom den cellefrie utforming er vist i tabell 1 ogpost-eksperimentet i tabell 2 under eksperimentelle forhold som er beskrevet her.
I tillegg over små ΔpH områder (<0,4 enheter; eksperimentelt beste begrenset til 0,2 enheter), den lineære skråningen oppnådd ved å plotte Δ mph / pmol H + tilstrekkelig tilnærmet logaritmisk forholdet mellom ΔpH og [H +]. Helningen av denne standardkurve representerer derfor buffer kraften i analysemedium under test i pH / nmol H + i 7 ul, eller mph / pmol H + i 7 mL. Vi anbefaler å øke medium buffering makt eller redusere celletetthet for prøver som overstiger en 0,2 pH-enhet endring i løpet av måletiden. Måletiden kan også bli redusert, men dette kan redusere den stabile tilstanden surgjøring hastighet og innføre feil i beregningen rate.
Ekstracellulære forsuring er et enkelt målt indikasjon på cellular metabolic rate. Til riktig bestemme frekvensen av cellulær glykolysen (som definert av laktatproduksjon) er det viktig å kjenne bufring kraften i analysemedium, og for å omdanne de ekstracellulære fluks målinger av oksygenforbruk og surgjøring til proton produksjonshastigheter. Ved å utføre denne beregning, kan surgjøringen som følge av CO 2 frigjøres i sitronsyresyklusen trekkes, slik at surgjøring at resultatene fra laktatproduksjon.
De mange ulike måter gitt her å måle buffering makt for denne korreksjonen gjennomføre ulike fordeler og ulemper. Ekstern måling ved hjelp av en pH-probe er svært nøyaktig og reproduserbar, men viser ikke nødvendigvis små forskjeller i pH deteksjon introdusert av fluoroforene som finnes i analyseplaten, tilsetningen av forbindelser som i løpet av analysen, eller tilstedeværelse av than cellene selv. Den in-plate pH-målinger løse disse problemene, men også innføre varierende grad av eksperimentell støy.
CO 2 korreksjon ECAR muliggjør for første gang den utvetydige og kvantitativ beregning av glykolytisk hastighet, og viser variasjonen i luftveiene og glykolytisk bidrag til total ECAR i løpet av et eksperiment. Ved hjelp av likning 5 og målinger av OCR, ECAR, og bufring kraft, kan glycolytic rente beregnes ved hjelp av enkle regneark gitt (tabell 6). Denne prisen kan verifiseres av post-hoc laktatmåling hvis ønskelig 6. I celler hvor pentose-fosfat veien er meget aktiv, kan bruk av sti-inhibitorer så som 6-aminonicotinamide være nyttig for å isolere glykolytisk hastighet. Beregning av bidrag fra både CO 2 – og laktat-avledet H + fra den totale målte Extra Cellular Forsuring og oksygen Consumption Rate er et uvurderlig verktøy for å bruke ekstracellulære flux data til å lage kraftige og kvantitative uttalelser om metabolsk aktivitet.
Ved hjelp av fremgangsmåtene som er beskrevet her, innbefattende forskjellige modifikasjoner for å måle bufring kraft, og å optimalisere den ekstracellulære fluks eksperiment for cellene som undersøkes og data ønskelig, kan frekvensen av glykolyse i intakte celler kvantifiseres under et bredt spekter av eksperimentelle betingelser. Denne metoden er begrenset til celler som kan vokse i kultur vedheftende på (eller celler eller organeller som kan være festet til) en polystyren-overflate. Det er mest pålitelige når dyrkede celler er ensartet og konfluent, selv om nyttige data fortsatt kan oppnås over et område av slike betingelser. Beregningene krever litt kunnskap om metabolismen av cellene, som maks H + / O 2 varierer fra 0,65 til 1,0 for fullt oksidasjon av ulike underlag og mer for partiell oksidasjon 6, men hvis cellene er known å oksidere glukose, kan en verdi på 1,0 bli antatt.
Selv om det er relevant for alle metabolske karakterisering, kan denne metode være spesielt nyttig når den brukes i systemer der en forskyvning mellom luftveiene og glykolytisk metabolisme for å opprettholde cellulær ATP tilførsel er en kritisk fenotype, herunder karakterisering av stamceller og tumor-avledet kreftceller. Forståelse metabolske kontroll endringer i disse og andre sammenhenger vil tillate en større grad av raffinement og nøyaktighet i eksperimentell design og analyse av disse celletyper.
The authors have nothing to disclose.
We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).
Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
LDH | Sigma | L1254 | chemical |