Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.
Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate– + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3– + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.
Det overordnede mål med denne metode er en nøjagtig måling den glycolytiske sats af celler ved hjælp af ekstracellulær flux analyse. Kvantitativ måling af glycolytiske sats hjælp ekstracellulær forsuring er det ønskede endepunkt mange eksperimenter. Men den samlede pris af ekstracellulær forsuring er summen af to elementer: respiratorisk forsuring, i form af CO2 (der hydratiserer til H 2 CO 3 derefter dissocierer til HCO 3 – + H +), og glycolytisk forsuring, i form lactat – + H +.
Bidragene af CO 2 til den samlede ekstracellulær forsuring har indtil for nylig været betragtet som ubetydelig i målingen platformen her anvendes, XF24 analysator 7. Det er dog klart i flere andre systemer, at CO 2 kan være en stor bidragyder til ekstracellulær forsuring 4-5. Flere papirer anerkende dette conbidrag, men ikke forsøge direkte kvantificering af CO2-afledt syre 3,8,9. Vi har for nylig vist, kvantitativt at CO 2 produktionen er en væsentlig kilde til ekstracellulær forsuring i dette system 6. Desuden, selv om der er flere metaboliske veje, der genererer CO2 fra glukose katabolisme, der udføres af matrix dehydrogenaser i citronsyrecyklus er de overvældende bidragydere og alle andre kilder genererer mængder af CO2, der er inden eksperimentelle fejl 6.
Uden at korrigere for CO 2-produktion, er ekstracellulær forsuring derfor en tvetydig indikator for glycolytiske sats og kan ikke bruges kvantitativt. Vores tidligere publikation fremhæver flere tilfælde, hvor respiratorisk CO 2 omfatter størstedelen af den samlede forsuring signal, selv i celler generelt menes primært at anvende glycolyse 6. Derudoverrespiratorisk CO 2 bidrag til samlet forsuring varierer meget i løbet af fælles stofskifteprofil eksperimenter, der viser, at korrekt sammenligning af den glycolytiske sats i forskellige dele af et eksperiment kræver korrektion for CO 2.
For at måle den glycolytiske på celler under anvendelse af hastigheden af ekstracellulær forsuring, er det nødvendigt at konvertere pH-ændringer på ændringer i alt H + genereret, og at trække den ekstracellulære forsuring forårsaget af CO2 frigives under drift af citronsyre cyklus. Her beskriver vi en enkel metode til at måle ekstracellulær proton produktionshastighed (fra ekstracellulære ændringer i pH og den kalibrerede buffering effekt af testsubstratet) og CO 2-produktion (fra ekstracellulære ændringer i O 2 koncentration), og demonstrerer, hvordan man beregner glycolytiske sats ved hjælp af disse målinger.
Denne metode styrke ker anvendeligheden af ekstracellulær forsuring måling ved at bruge det til korrekt beregne glycolytiske sats som defineret i lactatproduktion. Uden korrektion for respiratorisk CO 2 (eller direkte måling af lactat), er det umuligt at afgøre, om og i hvilket omfang den samlede forsuring afspejler glycolytiske sats, confounding fortolkningen af eksperimenter, der anvender de samlede ekstracellulære forsuring som en direkte måling af lactat-produktion.
BEREGNINGER
CO 2 og laktat er, inden for eksperimentel fejl, de eneste to bidragydere til ekstracellulær syreproduktion, baseret på eksperimenter med myoblastceller 6. Derfor kan antallet af samlede ekstracellulær forsuring (PPR, proton produktionshastigheden) defineres som:
PPR tot = PPR resp + PPR Glyc ligning 1
. _content "> hvor tot = total, hhv = respiratorisk; Glyc = glycolytisk glykolytiske PPR er således:PPR Glyc = PPR tot – PPR hhv ligning 2
Her,
PPR tot = ECAR tot / BP ligning 3
hvor ECAR = ekstracellulær forsuring rate (mph / min), og BP = buffering effekt (mph / pmol H + i 7 pi), mens
PPR resp = (10 pH-pKa 1 / (1 + 10 pH-pKa 1)) (max H + / O 2) (OCR tot – OCR rot / myx) Ligning 4
hvor K = 1 kombineret ligevægtskonstant CO 2 hydrering og dissociation til HCO 3 – + H +; max H + / O 2 = the CO 2-afledte forsuring for en bestemt metabolisk transformation såsom fuldstændig oxidation af glucose-6; OCR = iltforbrug sats (pmol O 2 / min), og OCR rot / MYX = ikke-mitokondrie OCR.
Ligning 4 isolater mitokondrie OCR ved at trække ikke-mitokondrie OCR (defineret som OCR, der er resistent over for den mitokondriske respiratoriske giftstoffer rotenon og myxothiazol) og tegner sig for den maksimale H + genereret pr O 2 forbrugt for hvert substrat (max H + / O 2 ) (se 6), samt andelen af CO 2 giver anledning til H + ved den eksperimentelle temperatur og pH (10 pH-pKa 1 / (1 + 10 pH-pK 1). For fuld oxidation af glucose, mitochondrial Oxygen Forbrug Rate (OCR) er nøjagtig lig med hastigheden af CO2-produktion. I begrænset assayvolumen på ekstracellulært flux måling, CO 2 produkterd ved respiration forbliver fanget i analysen medium. De fleste af de fanget CO 2 hydratiseres til H 2 CO 3, som derefter dissocierer til HCO 3 – + H +. En lille fraktion forbliver opløst, men ikke hydreret, og en anden lille fraktion er hydreret, men ikke adskilles, som dikteret termodynamisk ved den kombinerede ligevægtskonstant CO 2 hydrering og dissociation til HCO 3 – + H + ved eksperimentel temperatur (37 ° C) og pH (~ 7.4).
Således fuldstændige ligning for beregning PPR g ved at trække PPR resp fra PPR tot er:
PPR Glyc = ECAR tot / BP – (10 pH-pKa 1 / (1 + 10 pH-pKa 1)) (max H + / O 2) (OCR tot – OCR rot / myx) Ligning 5
jegn denne måde satser for respiration og glycolyse, samt deres tilknyttede ATP produktion satser, kan kvantitativt bestemmes ud fra enkle målinger (ilt forbrug, ekstracellulær forsuring, bufferkapacitet) og importere eller beregning af andre nødvendige værdier (H + / O 2 , P / O, og ligevægtskonstanten K 1) 6. Den her beskrevne eksperiment udvider på standard teknikker til at bruge den ekstracellulære Flux Analyzer såsom Seahorse XF24 10,11; for andre ekstracellulære flux måling formater (f.eks XF e 96, eller XFP) bør alle volumener nedenfor skaleres korrekt.
Buffering effekt af testsubstratet kan måles ved konstruktion af en standardkurve enten direkte i det ekstracellulære flux platform eller separat ved anvendelse af en kalibreret pH-sonde. Her er tre muligheder for at måle buffering af det ekstracellulære flux assaymediet givet, herunder ved hjælp af alle plast propå havne i den ekstracellulære flux analysator med cellefrie prøvebrønde, eller kun bruger den sidste injektion havn i celle-holdige brønde (afsnit 1) eller ved hjælp af en ekstern pH-måling (afsnit 2). Se vedlagte regneark for de fulde beregninger af eksempel data.
For at måle buffering strøm ved hjælp af pH-afsløring evne til ekstracellulære flux instrument, er det sikrest at bruge cellefrie brønde for at minimere signal variation. Inden fejlen findes imidlertid ingen statistisk forskel mellem cellefri og celleholdige brønde ved udførelse af denne måling (data ikke vist). BEMÆRK: beskrevet i trin 1.7 variation bærer fordel for medregning af eventuelle ændringer buffering knyttet tilsatte forbindelser eller af tilstedeværelsen af celler, med den ulempe, støjende signal. Men som nævnt ovenfor, fandtes ingen signifikante forskelle i den beregnede buffering magten mellem celle-frit design vist i tabel 1 ogpost-eksperimentet design i tabel 2 under de eksperimentelle betingelser er beskrevet her.
Derudover over små ΔpH intervaller (<0,4 enheder eksperimentelt bedst begrænset til 0,2 enheder), den lineære hældning opnået ved at afbilde Δ mph / pmol H + tilstrækkeligt tilnærmer logaritmisk forhold mellem ΔpH og [H +]. Hældningen af denne standard kurve repræsenterer derfor buffering magt assaymediet under test i pH / nmol H + i 7 pi, eller mph / pmol H + i 7 pi. Vi anbefaler at øge medium buffering magt eller faldende celledensitet for prøver, der overskrider en 0,2 pH-enhed ændring under målingen tid. Målingen tid kan også faldet, men det kan forkorte steady state forsuring sats og indføre fejl i beregningen af satsen.
Ekstracellulær forsuring er et let måles indikation af cellulære stofskifte. For at kunne bestemme hastigheden af cellulær glycolyse (som defineret af lactat produktion) er det vigtigt at kende buffering effekt af testsubstratet og til at konvertere de ekstracellulære flux målinger af oxygenforbrug og syrning til proton produktionshastigheder. Ved at udføre denne beregning, kan forsuringen som følge af CO 2 frigivet i citronsyrecyklus fratrækkes, forlader forsuring, der resulterer fra produktion af lactat.
De mange forskellige måder, der gives her at måle buffering strøm til denne korrektion bære forskellige fordele og ulemper. Ekstern måling under anvendelse af en pH-sonde er meget nøjagtig og reproducerbar, men kan afvige små forskelle i pH detektion indført af fluoroforer indeholdt i assaypladen, tilsætning af forbindelser i assayet, eller tilstedeværelsen af tHan cellerne selv. Den in-plade pH-målinger løse disse problemer, men også indføre varierende grader af eksperimentel støj.
CO 2 korrektion ECAR giver mulighed for første gang den entydige og kvantitativ beregning af glycolytisk sats, og afslører variation i respiratoriske og glycolytiske bidrag til den samlede ECAR i løbet af et eksperiment. Ved hjælp af ligning 5 og målingerne af OCR, ECAR og buffering magt, kan glycolytisk sats beregnes ved hjælp af den simple regneark forudsat (tabel 6). Denne sats kan verificeres ved post-hoc laktat måling, hvis det ønskes 6. I celler, hvor pentosephosphatvejen er meget aktive, kan anvendelsen af pathway-inhibitorer, såsom 6-aminonicotinamide være nyttigt at isolere glycolytisk sats. Beregning af bidrag fra både CO 2 – og laktat-afledt H + fra den samlede målte Ekstra Cellular Forsuring Vurder og Oxygen Consumption Rate er et uvurderligt værktøj for brug af ekstracellulære flux data til at foretage kraftige og kvantitative udsagn om metabolisk aktivitet.
Under anvendelse af fremgangsmåderne her beskrevet, herunder forskellige modifikationer til måling buffering magt, og optimere den ekstracellulære flux eksperiment for cellerne under undersøgelsen og data ønskes, kan hastigheden for glycolyse i intakte celler kvantificeres under en lang række eksperimentelle betingelser. Denne fremgangsmåde er begrænset til celler, der kan vokse i vedhængende kultur på (eller celler eller organeller, der kan klæbes til) en polystyrenoverflade. Det er mest pålidelig, når dyrkede celler er homogene og sammenflydende, selvom nyttige data stadig kan opnås over et område af disse betingelser. Beregningerne kræver et vist kendskab til stofskiftet i cellerne, som max H + / O 2 spænder fra 0,65 til 1,0 for fuld oxidation af forskellige substrater og mere for delvis oxidation 6, men hvis cellerne er known at oxidere glukose, kan antages en værdi på 1,0.
Selvom der er relevante for alle metaboliske karakterisering, kan denne metode være særligt nyttigt, når det anvendes i systemer, hvor et skift mellem respiratoriske og glycolytiske metabolisme til at opretholde cellulær ATP levering er en kritisk fænotype, herunder karakterisering af stamceller og tumorafledte cancerceller. Forståelse metaboliske kontrol ændringer i disse og andre sammenhænge vil give en større grad af raffinement og præcision i den eksperimentelle design og analyse af disse celletyper.
The authors have nothing to disclose.
We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).
Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
LDH | Sigma | L1254 | chemical |