Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.
Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate– + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3– + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.
O objetivo geral deste método é medir com precisão a taxa glicolítica de células usando a análise de fluxo extracelular. A medida quantitativa da taxa glicolítica usando acidificação extracelular é o ponto final desejado de muitos experimentos. No entanto, a taxa total de acidificação extracelular é a soma de dois componentes: a acidificação respiratória, sob a forma de CO2 (que hidrata a H 2 CO 3, em seguida, dissocia-se de HCO 3 – + H +), e acidificação glicolítica, sob a forma de lactato – + H +.
As contribuições de CO 2 a acidificação extracelular totais têm até recentemente foi considerado insignificante na plataforma de medição utilizado aqui, o analisador XF24 7. No entanto, é evidente em vários outros sistemas que CO 2 pode ser um dos principais contribuintes para a acidificação extracelular 4-5. Vários papéis reconhecer este contribuição, mas não tente a quantificação direta de CO 2 -derived 3,8,9 ácido. Nós recentemente demonstrado quantitativamente que a produção de CO 2 é uma fonte significativa de acidificação extracelular neste sistema 6. Além disso, apesar de existirem várias vias metabólicas que geram CO 2 a partir de catabolismo da glicose, os realizados por desidrogenases matriz no ciclo do ácido cítrico são os contribuintes esmagadora e todas as outras fontes de gerar quantidades de CO 2 que estão dentro do erro experimental 6.
Sem correcção para a produção de CO 2, a acidificação extracelular é, por conseguinte, um indicador de taxa de ambígua glicolítica e não pode ser utilizado quantitativamente. Nossa publicação anterior destaca vários casos em que respiratória CO 2 compreende a maior parte do sinal total acidificação, mesmo em células geralmente acredita-se usar principalmente glicólise 6. Além disso, orespiratório CO2 contribuição para a acidificação total varia amplamente durante o decorrer de experiências comuns perfis metabólicos, demonstrando que a correcta comparação da taxa glicolítica durante diferentes partes de um experimento requer correcção para o CO 2.
Para medir a taxa glicolítica de células utilizando a taxa de acidificação extracelular, é necessário converter as alterações de pH às mudanças no total gerados H +, e para subtrair o acidificação extracelular causada por CO2 libertado durante a operação do ciclo do ácido cítrico. Aqui, descrevemos um método simples para medir a taxa de produção de prótons extracelular (a partir de mudanças extracelulares em pH eo poder calibrado tamponamento do meio de ensaio) e produção de CO 2 (a partir de mudanças extracelulares em O 2 concentração), e demonstrar como calcular taxa glicolítica usando estas medições.
Este método força ens a utilidade da medida acidificação extracelular, utilizando-o para calcular corretamente taxa glicolítica tal como definido pela produção de lactato. Sem correcção para o CO respiratória 2 (ou medição directa do lactato), é impossível determinar se e em que medida a taxa de acidificação dadas reflecte taxa glicolítica, confundindo a interpretação de experiências que utilizam acidificação extracelular total, como uma medição directa da produção de lactato.
CÁLCULOS
CO 2 e lactato são, dentro do erro experimental, os dois únicos contribuintes para a produção de ácido extracelular, com base em experimentos com células mioblastos 6. Portanto, a taxa de acidificação extracelular total de (PPR, a taxa de produção de protões) pode ser definida como:
PPR tot = PPR resp + PPR Glyc Equação 1
. _content "> onde tot = total; resp = respiratória; Glyc = glycolytic Glicosidases PPR é assim:PPR Glyc = PPR tot – PPR resp Equação 2
Aqui,
PPR tot = ECAR tot / BP Equação 3
onde ECAR = taxa de acidificação extracelular (MPH / min) e BP = poder tampão (MPH / pmol H + em 7 ul), enquanto
PPR resp = (10 pH-pk 1 / (1 + 10 pH-pk 1)) (max H + / O 2) (OCR tot – OCR rot / myx) Equação 4
1 onde K = constante de CO2 de hidratação e de dissociação de equilíbrio para o HCO 3 combinado – + H +; max H + / O 2 = the CO 2 a acidificação -derived para uma transformação metabólica em particular tais como a oxidação completa de glicose-6; OCR = taxa de consumo de oxigênio (O 2 pmol / min), e OCR rot / myx = não-mitocondrial OCR.
Equação 4 isolados mitocondrial OCR subtraindo qualquer OCR não-mitocondrial (definida como o OCR que é resistente à mitocondrial respiratória venenos rotenona e myxothiazol) e representa a máxima H + gerada por O 2 consumido para cada substrato (max H + / O2 ) (ver 6), bem como a proporção de CO 2 dando origem a H + a uma temperatura experimental e pH (10 pH-PK 1 / (1 + 10 pH-PK 1). Para a oxidação completa de glucose, oxigénio mitocondrial Taxa de Consumo (OCR) é exactamente igual à taxa de produção de CO 2. No volume de ensaio de medição do fluxo confinado extracelular, CO 2 produtosd pela respiração permanece preso no meio de ensaio. A maior parte do CO2 é preso hidratado a H 2 CO 3, que, em seguida, dissocia-se de HCO 3 – + H +. Uma fracção pequena permanece dissolvido mas não hidratada, e uma outra fracção pequena é hidratado mas não dissociada, como ditado termodinamicamente pela constante de CO2 de hidratação e de dissociação de equilíbrio combinado de HCO 3 – + H + a temperatura experimental (37 ° C) e pH (~ 7,4).
Assim, a equação completa para o cálculo PPR g subtraindo PPR resp de PPR tot é:
PPR Glyc = ECAR tot / BP – (10 pH-pk 1 / (1 + 10 pH-pk 1)) (max H + / O 2) (OCR tot – OCR rot / myx) Equação 5
EuN deste modo, as taxas de respiração e a glicólise, assim como as suas taxas de produção de ATP associados, pode ser determinada quantitativamente a partir de medições directas (consumo de oxigénio, de acidificação extracelular, capacidade tampão) e de importação, ou cálculo de outros valores necessários (H + / O2 , P / S, e a constante de equilíbrio K 1) 6. O experimento descrito aqui se expande sobre as técnicas padrão para usar o Extracelular Flux Analyzer como Seahorse XF24 10,11; para outros formatos de medição de fluxo extracelular (por exemplo, XF e 96, ou XFP), todos os volumes abaixo devem ser dimensionados de forma adequada.
O poder de enchimento do meio de ensaio pode ser medido pela construção de uma curva padrão, quer directamente na plataforma de fluxo extracelular ou separadamente, utilizando uma sonda de pH calibrada. Aqui, três opções para medir a memória intermédia por meio de ensaio de fluxo extracelular são dadas, incluindo o uso de todos os injectinas portas do analisador de fluxo extracelular com poços de amostras livres de células, ou usando apenas a última porta de injeção em poços contendo células (seção 1) ou usando uma medição de pH externo (seção 2). Consulte a planilha em anexo para os cálculos completos de dados de exemplo.
Para medir a potência de buffer usando a capacidade do instrumento de fluxo extracelular de detecção de pH, é mais seguro usar poços livres de células para minimizar a variação do sinal. No entanto, dentro do erro, não existe nenhuma diferença estatística entre poços e quando se realiza esta medição contendo celular isento de células (dados não mostrados). NOTA: A variação descrito no passo 1.7 transporta a vantagem de contabilização de quaisquer potenciais alterações ao buffer conferidos por compostos adicionados ou pela presença de células, com a desvantagem de sinal mais barulhento. No entanto, como indicado acima, não foram encontradas diferenças significativas na potência tamponante calculada entre a concepção livre de células mostrados na Tabela 1 eo projeto de pós-experimento na Tabela 2, nas condições experimentais descritas aqui.
Além disso, sobre pequenos intervalos ΔpH (<0,4 unidades; experimentalmente melhor a 0,2 unidades), a inclinação linear obtido através da representação gráfica Δ MPH / pmol H + aproxima adequadamente a relação logarítmica entre ΔpH e [H +]. O declive desta curva padrão representa, portanto, o poder de enchimento do meio de ensaio em ensaio de pH / nmol de H + em 7 ul, ou MPH / pmol H + em 7 ul. Recomendamos aumento do poder de tamponamento médio ou diminuindo a densidade celular para as amostras que excedem a alteração da unidade de pH 0,2 durante o tempo de medição. O tempo de medida pode também ser diminuída, mas isto pode diminuir a taxa de acidificação estado estacionário e introduzir um erro no cálculo da taxa.
Acidificação extracelular é uma indicação facilmente medido da taxa metabólica celular. Para determinar correctamente a taxa de glicólise celular (tal como definido pela produção de lactato) é crítico saber o poder tamponante do meio de ensaio, e para converter as medições de fluxo extracelulares de consumo de oxigénio e a acidificação em protão taxas de produção. Ao realizar este cálculo, a acidificação resultante do CO2 libertado no ciclo do ácido cítrico pode ser subtraído, deixando a acidificação que resulta da produção de lactato.
As múltiplas formas diferentes dadas aqui para medir a potência de tamponamento para esta correcção transportar diferentes vantagens e desvantagens. Medição externa usando uma sonda de pH é altamente preciso e reprodutível, mas pode não reflectir pequenas diferenças na detecção de pH introduzido pelos fluoróforos contidos no interior da placa de ensaio, a adição de compostos durante o ensaio, ou a presença de tele próprias células. A in-placa medições de pH abordar estas questões, mas também apresentar vários graus de ruído experimental.
A correcção de CO 2 a ECAR permite pela primeira vez o cálculo inequívoca e quantitativa da taxa glicolítica, e revela uma variação na contribuição respiratória e glicolítico para ECAR total durante o decurso de uma experiência. Utilizando a Equação 5 e as medições de OCR, ECAR, e poder tamponante, taxa glicolítica pode ser calculada utilizando a folha de cálculo simples, desde que (Tabela 6). Esta taxa pode ser verificada por medição de lactato post-hoc, se desejado 6. Nas células em que a via da pentose fosfato é altamente activo, o uso de inibidores da via, tais como 6-aminonicotinamide pode ser útil para isolar taxa glicolítica. Cálculo das contribuições de ambos CO 2 – e derivados de lactato H + do total medido extracelular acidificação Taxa e oxigênio Consumption Taxa é uma ferramenta inestimável para a utilização de dados de fluxo extracelulares para fazer declarações poderosas e quantitativos sobre a atividade metabólica.
Utilizando os procedimentos descritos aqui, incluindo as várias modificações para a medição da potência de tamponamento, e optimizar o fluxo extracelular experimento para as células sob investigação e os dados desejados, a taxa de glicólise em células intactas podem ser quantificados sob uma ampla gama de condições experimentais. Este método está limitado a células que podem crescer em cultura aderente em (ou células ou organelas que podem ser aderidos a) uma superfície de poliestireno. É mais fiável quando as células cultivadas são homogéneos e confluentes, embora os dados úteis podem ainda ser obtidos ao longo de um intervalo de estas condições. Os cálculos requerem algum conhecimento do metabolismo das células, como Max H + / O 2 varia de 0,65 a 1,0 para a oxidação completa dos diferentes substratos e mais para a oxidação parcial 6, no entanto, se as células forem Known para oxidar glicose, um valor de 1,0 pode ser assumida.
Embora relevante para todos caracterização metabólica, este método pode ser particularmente útil quando utilizada em sistemas em que uma mudança entre o metabolismo respiratório e para manter a produção glicolítica do ATP celular é um fenótipo crítica, incluindo a caracterização de células estaminais e células de cancro derivadas de tumores. Compreender alterações controle metabólico desses e outros contextos permitirá um maior grau de sofisticação e precisão no desenho experimental e análise destes tipos de células.
The authors have nothing to disclose.
We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).
Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
LDH | Sigma | L1254 | chemical |