Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.
Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate– + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3– + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.
Det övergripande målet med denna metod är att noggrant mäta den glykolytiska takten celler med hjälp av extracellulära flödesanalys. Kvantitativ mätning av glykolytiska takt med hjälp av extracellulära försurning är den önskade slutpunkten för många experiment. Dock är den totala satsen för extracellulärt försurning summan av två komponenter: andnings försurning, i form av CO2 (som återfuktar till H 2 CO 3 dissocierar sedan till HCO3 – + H +), och glykolytiska försurning i form av laktat – + H ^.
Bidragen från CO2 till total extracellulära försurning har tills nyligen betraktats försumbar i mätningen plattform som används här, XF24 analysatorn 7. Det är dock tydligt i flera andra system som CO 2 kan vara en viktig bidragande orsak till extracellulära försurning 4-5. Flera papper erkänna detta conbidrag, men inte försöka direkt kvantifiering av CO2-härledda syra 3,8,9. Vi har nyligen visat kvantitativt som CO 2 produktion är en betydande källa till extracellulära försurning i detta system 6. Dessutom, även om det finns flera metaboliska vägar som genererar CO2 från glukos katabolism, som genomförs av matris dehydrogenaser i citronsyracykeln är överväldigande bidragsgivare och alla andra källor genererar mängder av CO2 som är inom experimentellt fel 6.
Utan att korrigera för CO2 produktion är extracellulärt försurning därför en tvetydig indikator för glykolytiska takt och kan inte användas kvantitativt. Vår tidigare publikation belyser flera fall där andnings CO2 omfattar huvuddelen av den totala försurningssignalen, även i celler i allmänhet tros i första hand använda glykolys 6. Dessutomandnings CO2 bidrag till den totala försurning varierar kraftigt under loppet av gemensamma metaboliska profilering experiment visar att korrekt jämförelse av den glykolytiska takt under olika delar av ett experiment kräver korrigering för CO2.
För att mäta den glykolytiska takten av celler som använder hastigheten av extracellulär försurning, är det nödvändigt att omvandla pH-förändringar till förändringar i den totala H * som alstras, och att subtrahera den extracellulära försurning som orsakas av CO 2 frigörs under drift av citronsyracykeln. Här beskriver vi en enkel metod för mätning av extracellulär protonproduktionshastigheten (från extracellulära förändringar i pH och den kalibrerade buffrande effekten hos analysmediet) och CO 2 produktion (från extracellulära förändringar i O 2-koncentration), och visar hur man kan beräkna glykolytisk hastighet med användning av dessa mätningar.
Denna metod styrka ENS nyttan av extracellulära försurning mätning genom att använda det till ordentligt beräkna glykolytiska takt som definieras av laktat produktion. Utan korrigering för andnings CO2 (eller direkt mätning av laktat), är det omöjligt att avgöra om och i vilken utsträckning den totala försurningstakten avspeglar glykolytiska takt, confounding tolkningen av experiment som använder total extracellulära försurning som ett direkt mått på laktat produktion.
BERÄKNINGAR
CO 2 och laktat är inom experimentellt fel, de enda två bidragsgivarna till extracellulär syraproduktion, baserat på experiment med myoblastceller 6. Därför kan definieras graden av totala extracellulära försurning (PPR, protonproduktionstakten) som:
PPR tot = PPR resp + PPR Glyc Ekvation 1
. _content "> där tot = totalt, resp = luftvägarna, Glyc = glykolytiska glykolytiska PPR är alltså:PPR Glyc = PPR tot – PPR resp Ekvation 2
Här,
PPR tot = ECAR tot / BP Ekvation 3
där ECAR = extracellulär försurning hastighet (km / h / min), och BP = buffrande effekt (mph / pmol H ^ i 7 | il), medan
PPR resp = (10 pH-pK 1 / (1 + 10 pH-PK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot – OCR rot / myx) Ekvation 4
där K 1 = kombinerad jämviktskonstanten av CO2 hydrering och dissociation till HCO3 – + H +; max H ^ / O 2 = ee CO2 härledda försurning för en viss metabolisk omvandling såsom fullständig oxidation av glukos-6; OCR = syreförbrukningen (pmol O 2 / min), och OCR rot / myx = icke-mitokondriella OCR.
Ekvation 4 isolat mitokondriell OCR genom att subtrahera icke-mitokondriska OCR (definierat som OCR som är resistent mot den mitokondriella andningsgifter rotenon och myxothiazol) och svarar för den maximala H + genereras per O 2 konsumeras för varje substrat (max H ^ / O 2 ) (se 6), samt andelen av CO2 vilket ger upphov till H + vid den experimentella temperatur och pH (10 pH-pK 1 / (1 + 10 pH-pK 1). För fullständig oxidering av glukos, mitokondriell Syre Konsumtion Rate (OCR) är exakt lika med hastigheten för CO 2 produktionen. I det slutna analysvolymen av extracellulärt flödesmätning, CO2 producerard genom respiration förblir instängd i analysmediet. Det mesta av den instängda CO 2 hydratiseras till H 2 CO 3, som sedan dissocierar till HCO 3 – + H ^. En liten del förblir upplöst men inte hydratiseras, och en annan liten fraktion är hydratiserad men inte dissocieras, såsom dikteras termodynamiskt genom den kombinerade jämviktskonstanten CO 2 hydratisering och dissociation till HCO 3 – + H ^ vid experimentell temperatur (37 ° C) och pH-värdet (~ 7,4).
Således, hela ekvationen för beräkning av PPR g genom att subtrahera PPR resp från PPR tot är:
PPR Glyc = ECAR tot / BP – (10 pH-pK 1 / (1 + 10 pH-PK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot – OCR rot / myx) Ekvation 5
jagn på detta sätt, andelen andning och glykolys, samt tillhörande ATP produktionstakt kan bestämmas kvantitativt från enkla mätningar (syreförbrukning, extracellulära försurning, buffertkapacitet) och import eller beräkning av andra nödvändiga värden (H + / O 2 , P / O, och jämviktskonstanten K 1) 6. Experimentet som beskrivs här expanderar på standardtekniker för att använda de extracellulära Flux Analyzer som Seahorse XF24 10,11; för andra extracellulära flux mätningsformat (t.ex. XF e 96, eller XFP), bör alla volymer nedan skalas på lämpligt sätt.
Den buffrande effekten hos analysmediet kan mätas genom konstruktion av en standardkurva, antingen direkt i den extracellulära flödes plattform eller separat användning av en kalibrerad pH-sond. Här är tre alternativ för att mäta buffring av den extracellulära flödesanalysmediet ges, bland annat med hjälp av alla injectipå hamnar i den extracellulära flödes analysator med cellfria provbrunnar, eller med endast den sista injektionen hamn i cellinnehållande brunnar (avsnitt 1) eller genom att använda en extern pH-mätning (avsnitt 2). Se bifogad kalkylblad för hela beräkningar av exempeldata.
För att mäta buffert makten med hjälp av pH-detekteringsförmåga av den extracellulära flödesinstrumentet, är det säkrast att använda cellfria brunnar för att minimera signalvariation. Men inom felet finns ingen statistisk skillnad mellan cellfria och cellinnehållande brunnar när du utför denna mätning (data visas ej). OBS: variationen beskrivs i steg 1,7 uppbär fördelen för redovisning av eventuella ändringar av buffring som följer av tillsatta föreningar eller genom närvaron av celler, med nackdelen av bullrigare signalen. Såsom konstaterats ovan har inga signifikanta skillnader hittades i den beräknade buffertstyrka mellan den cellfria utformning som visas i tabell 1 ochefterexperimentdesign i tabell 2 under de experimentella betingelser som beskrivs här.
Dessutom över små APH intervall (<0,4 enheter; experimentellt bäst begränsas till 0,2 enheter), den linjära lutningen erhölls genom avsättning Δ mph / pmol H ^ adekvat approximerar logaritmiskt förhållande mellan ApH och [H *]. Lutningen på denna standardkurva representerar därför buffert kraften i analysmediet som testas i pH / nmol H + i 7 il eller mph / pmol H + i 7 ul. Vi rekommenderar att öka medeleffekt buffring eller minska celltäthet för prover som överskrider en enhet förändring 0,2 pH under mättiden. Mättiden kan också minskas, men detta kan förkorta steady state försurningshastighet och införa fel i beräkningen av hastigheten.
Extracellulär försurning är en lätt att mäta indikation på cellulär ämnesomsättning. För att korrekt bestämma hastigheten för cellulär glykolys (såsom definieras av laktatproduktion) är det viktigt att veta den buffrande effekten hos analysmediet, och för att omvandla de extracellulära flödes mätningar av syreförbrukning och surgöring till protonproduktionshastigheter. Genom att utföra denna beräkning, kan surgöringen erhållna bland CO 2 släpptes i citronsyracykeln subtraheras, lämnar försurning som är resultatet av laktatproduktion.
De många olika sätt som anges här för att mäta buffert kraft för denna korrigering har olika fördelar och nackdelar. Utvändiga mått med hjälp av en pH-sond är mycket noggrann och reproducerbar, men kanske därför inte speglar små skillnader i pH detektering infördes av fluoroforer som ingår i analysplattan, tillsättning av föreningar under analysen, eller närvaron av than cellerna själva. In-plattan pH-mätningar itu med dessa frågor, men också införa olika grader av experimentell buller.
CO 2 korrigering ECAR möjliggör för första gången en entydig och kvantitativ beräkning av glykolytiska takt, och avslöjar variation i luftvägarna och glykolytiska bidrag till den totala ECAR under ett experiment. Använda ekvation 5 och mätningar av OCR, ECAR, och buffrande effekt, kan glykolytisk hastighet beräknas med hjälp av enkla kalkyl tillhandahålls (tabell 6). Denna ränta kan verifieras genom post-hoc laktat mätning om så önskas 6. I celler där pentosfosfatvägen är högaktiv kan användningen av pathway inhibitorer såsom 6-aminonicotinamide vara användbara för att isolera glykolytiska takt. Beräkning av bidragen från både CO2 – och laktat härrörande H + från den totala uppmätta Extra Cellular Försurning frekvens och syre Consumption Rate är ett ovärderligt verktyg för att använda extracellulära flödes data för att göra kraftfulla och kvantitativa uttalanden om metabolisk aktivitet.
Med användning av de förfaranden som beskrivs här, inklusive olika modifikationer för mätning buffrande effekt, och optimera den extracellulära flödes experimentet för cellerna är föremål för undersökning och data som önskas, kan hastigheten för glykolys i intakta celler kvantifieras under ett brett område av experimentella betingelser. Denna metod är begränsad till celler som kan växa i vidhäftande kultur på (eller celler eller organeller som kan följas) en polystyrenyta. Det är mest tillförlitliga när odlade celler är homogen och sammanflytande, fast användbara data kan fortfarande erhållas över ett område av dessa tillstånd. Beräkningarna kräver vissa kunskaper i metabolismen av cellerna, som max H + / O 2 varierar från 0,65 till 1,0 för full oxidation av olika substrat och mer för partiell oxidation 6, men om cellerna är kNown att oxidera glukos, kan antas ett värde på 1,0.
Även relevant för alla metaboliska karakterisering, kan denna metod vara särskilt användbart när det används i system där en förskjutning mellan andnings- och glykolytiska metabolismen att upprätthålla cellulär ATP-utbudet är en kritisk fenotyp, inbegripet karakterisering av stamceller och tumörhärrörande cancerceller. Förstå metabol kontroll förändringar i dessa och andra sammanhang kommer att möjliggöra en högre grad av förfining och noggrannhet i experimentell design och analys av dessa celltyper.
The authors have nothing to disclose.
We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).
Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
LDH | Sigma | L1254 | chemical |