Introduction
وقد جذبت الأسطح ذات البنية النانومترية في الآونة الأخيرة اهتماما كبيرا نظرا لمختلف تطبيقاتها المحتملة، بما في ذلك الزخرفة، زراعة الخلايا، والتنظيف، وتحويل السطح. على سبيل المثال، الأسطح superhydrophobic مستوحاة من البنية النانوية لأوراق اللوتس والأسطح استجابة أخرى قادرة على الاستجابة للمؤثرات الخارجية 1-4.
الفيلم انجميور هي واحدة من الطلاء البوليمر الأكثر دراسة على نطاق واسع. يتم تشكيل فيلم انجميور من خلال إسقاط جزيئات محبة للجهتين على واجهة بين الهواء والماء 5-8. الفيلم يمكن بعد ذلك نقل على سطح صلب عن طريق الامتزاز الفيزيائي أو الكيميائي، والتشكل الجزيئي على سطح صلب يمكن السيطرة عليها باستخدام وسائل نقل الرأسي والأفقي 9-12. كثافة الفيلم انجميور يمكن أن ينظم على وجه التحديد عن طريق ضغط واجهة بين الهواء والماء. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت هذه الطريقة فعالة أيضا لافتعال nanoscaled متطوره البحر جزيرةوفاق من خلال الاستفادة من بوليمرات كتلة محبة للجهتين. ويفترض أن النانو تتكون من مجموعة أساسية من شرائح مسعور وقذيفة من شرائح ماء 13-17. وبالإضافة إلى ذلك، فقد تم ضبط عدد من النانو على سطح عن طريق التحكم في المساحة لكل جزيء (A م) من البوليمرات كتلة في الواجهة.
فقد ركزنا على الأصل، فريدة من نوعها نهج هندسة الأنسجة خالية من سقالة والهندسة ورقة خلية، وذلك باستخدام سطح ثقافة تستجيب للحرارة. وقد تم تطبيق هذه التكنولوجيا المتقدمة لعلاجات التجدد لمختلف الأجهزة 18. كانت ملفقة سطح ثقافة تستجيب للحرارة عن طريق تطعيم بولي (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm)، وهو جزيء استجابة درجات الحرارة، على سطح 19-27. PIPAAm وبوليمرات المعرض في درجة حرارة أقل حل الحرجة (LCST) في الأوساط المائية في درجات حرارة قريبة من 32 درجة مئوية. كما عرضت سطح ثقافة alternati استجابة درجات الحرارة على بين للا مائية وhydrophilicity. عند 37 درجة مئوية، وأصبح سطح المطعمة PIPAAm-مسعور، والخلايا تعلق بسهولة وانتشرت على سطح فضلا عن البوليسترين زراعة الأنسجة التقليدية. عندما تم تخفيض درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية، وأصبح سطح ماء، وخلايا منفصلة بشكل عفوي من السطح. لذلك، يمكن أن تحصد خلايا متكدسة مثقف على السطح عبارة عن ورقة سليمة عن طريق تغيير درجة الحرارة. تم عرض هذه الخصائص التصاق الخلايا ومفرزة أيضا سطح ملفقة من قبل طلاء فيلم انجميور للتظاهر مختبر 26 و 27. كانت ملفقة فيلم انجميور من بوليمرات كتلة تتكون من البوليسترين (P (القديس)) وPIPAAm (سانت IPAAm). الفيلم انجميور مع وم معينة يمكن نقلها أفقيا إلى الركيزة الزجاج تعديل hydrophobically. وبالإضافة إلى ذلك، تم تقييم التصاق الخلايا على والابتعاد عن سطح استعداد ردا على درجات الحرارة.
_content "> هنا، نحن تصف بروتوكولات لصنع فيلم انجميور النانوية المؤلفة من بوليمرات كتلة محبة للجهتين الحرارية استجابة على ركيزة الزجاج. لدينا وسيلة يمكن أن توفر تقنية تصنيع فعالة لnanofilms العضوية في مختلف مجالات العلوم السطح ويمكن أن يسهل أكثر السيطرة الفعالة على التصاق الخلايا على ومفرزة عفوية من السطح.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليف Polystyrene- كتلة -poly (N -isopropylacrylamide) من خلال خطوتين عكسية إضافة-تجزئة سلسلة نقل (الطوافة) البلمرة الجذرية
- حل الستايرين (153.6 ميلي مول)، 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) حمض sulfanylpentanoic (ECT؛ 0.2 ملمول)، و4،4'-Azobis (حمض 4-cyanovaleric) (ACVA، 0.04 ملمول) في 40 مل من 1 4-ديوكسان. تجميد الحل في النيتروجين السائل تحت فراغ لمدة 15-20 دقيقة لإزالة الأنواع المتفاعلة وتدريجيا ذوبان الجليد في RT. تأكد من أن الحل هو إذابة تماما ويكرر هذا التجميد مضخة ذوبان الجليد التفريغ دورة ثلاث مرات.
- الحصول على البوليسترين (PST) (MW: 13،500) كعامل الطوافة الكلي عن طريق البلمرة عند 70 درجة مئوية لمدة 15 ساعة في حمام الزيت.
- راسب PST وكيل الطوافة الكلي مع 800 مل من الأثير، وجاف في الخلاء.
- حل IPAAm مونومر (4.32 ملمول)، PST وكيل الطوافة الكلي (0.022 ملمول)، وACVA (0.004 ملمول) في 4 مل من 1،4-ديوكسان.
- إزالةالأوكسجين في الحل عن طريق دورات التفريغ تجميد مضخة ذوبان الجليد كما ذكر في الخطوة 1.1.
- إجراء البلمرة عند 70 درجة مئوية لمدة 15 ساعة في حمام الزيت بعد التفريغ. الحصول على توليفها سانت IPAAm جزيء (MW: 32800) في نفس الطريقة كما في توقيت المحيط الهادي وكيل الطوافة الكلي.
2. إعداد Silanized مسعور تعديل ركائز الزجاج
- غسل ركائز الزجاج (24 ملم × 50 ملم) مع وجود فائض من الأسيتون والإيثانول ويصوتن لمدة 5 دقائق لإزالة الملوثات السطحية.
- تجفيف ركائز في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم استخدام البلازما الأكسجين (400 W، 3 دقيقة) لتنشيط السطوح من ركائز في RT.
- تزج ركائز في التولوين التي تحتوي على 1٪ hexyltrimethoxysilane بين عشية وضحاها في RT لsilanize الركيزة.
- غسل ركائز silanized في التولوين وتزج في الأسيتون لمدة 30 دقيقة لإزالة عوامل غير المتفاعل.
- ركائز يصلب لمدة 2 ساعة على 110 درجة مئوية إلى شل بدقة الصورةوجهك.
- قطع ركائز silanized من قطع الزجاج إلى 25 ملم × 24 ملم لتناسب أطباق زراعة الخلايا (طبق حجم: φ35 مم).
3. إعداد انجميور أفلام والسطحية نقل السينمائي
- ضع أداة فيلم انجميور في مجلس الوزراء لمنع تراكم الغبار.
- غسل حوض انجميور (الحجم: 580 مم × 145 مم) والحواجز مع الماء المقطر والايثانول لإزالة الملوثات.
- تجفيف الحوض الصغير والحواجز عن طريق المسح بمنشفة lintless. ثم ملء الحوض مع حوالي 110 مل من الماء المقطر، ووضع حواجز على جانبي الحوض. لاحظ أن الماء المقطر ينبغي أن يضاف من دون إراقة في الخطوات التالية 3،5-3،13.
- تسخين Wilhelmy لوحة البلاتين (محيط: 39.24 ملم) لرصد التوتر السطحي مع الموقد الغازي حتى يتحول لوحة حمراء ثم يغسل بالماء المقطر لإزالة الملوثات. تعليق لوحة Wilhelmy على سلك المرفقةصك أرض الضغط قياس.
- صفر صك أرض الضغط قياس وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ضغط واجهة بين الهواء والماء في الحوض الصغير من قبل حواجز على جانبي الحوض الصغير حتى يصل إلى واجهة حوالي 50 سم 2 من دون أي قطرات من البوليمر.
- نضح الملوثات صغيرة حتى ضغط السطح ما يقرب من 0 م ن / م.
- إعادة وضع الحواجز على كلا الجانبين، وإضافة الماء المقطر لتعويض النقص من الماء المقطر من الخطوة 3.6.
- حل 5 ملغ من جزيء سانت IPAAm توليفها في 5 مل من محلول تطوير الكلوروفورم.
ملاحظة: ثنائي كلورو ميثان أو يمكن أيضا التولوين أن تستخدم المذيبات. - إسقاط بلطف 27 ميكرولتر من سانت IPAAm يذوب في الكلوروفورم على الحوض باستخدام محقنة مكروية أو micropipette.
- بعد انتظار لمدة 5 دقائق للسماح التبخر الكامل من كلوروفورم، نقل كل الحواجز أفقيا لضغط molecu سانت IPAAmلو في واجهة. الحفاظ على معدل ضغط من الحواجز عند 0.5 ملم / ثانية حتى المنطقة المستهدفة من 50 يتم التوصل سم 2.
ملاحظة: معدل ضغط السريع يسبب عيوب في الفيلم انجميور. - قياس ضغط سطح الأيسوثرم (π) -A م مع لوحة Wilhelmy البلاتين تعلق على صك أرض الضغط قياس ضغط أثناء وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- بعد أن بلغ حجم المنطقة المستهدفة، والحفاظ على السطح لمدة 5 دقائق للسماح للجزيئات سانت IPAAm للاسترخاء. الجزيئات لا تصل إلى التوازن مباشرة بعد ضغط.
- نقل الفيلم انجميور إلى الركيزة الزجاج تعديل hydrophobically باستخدام جهاز نقل لمدة 5 دقائق ليمتص بقوة الفيلم. إصلاح الركيزة الزجاج مسعور في نفس الوقت على الجهاز. وصل الجهاز إلى مرحلة التوافق والتحرك عموديا.
- رفع الركيزة أفقيا مع جهاز نقل وجافة لمدة 1 يوم في desiccatoص.
4. زراعة الخلايا وتحسين التصاق الخلية ومفرزة على سطح انجميور الفيلم المحول
- لإعداد تعليق خلية والثقافة البقري الشريان السباتي الخلايا البطانية (BAECs) لالتقاء الثلث عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 و 95٪ جوية على زراعة الأنسجة البوليسترين (برنامج التعاون الفني) مع Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تحتوي على 10٪ الجنين مصل بقري (FBS) و 100 U / البنسلين مل.
- بعد الوصول إلى نقطة التقاء، علاج BAECs مع 3 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 و 95٪ الجوية.
- تنشيط التربسين-EDTA بإضافة 10 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، وجمع تعليق خلية إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- أجهزة الطرد المركزي في 120 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. إعادة تعليق الخلايا مع 10 مل من DMEM.
- وضع الأسطح سانت IPAAm تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية على مقاعد البدلاء النظيفة للتعقيم لمدة 5 دقائق.
- البذور وم استردLLS على سانت-IPAAm أسطح بتركيز 1.0 × 10 4 خلية / سم 2 تحصى من قبل عدادة الكريات يمكن التخلص منها ومراقبة الخلايا على الأسطح بواسطة المجهر مجهزة حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 95٪ الهواء.
ملاحظة: تعقيم الأسطح سانت IPAAm بواسطة الأشعة فوق البنفسجية مجهزة على مقاعد البدلاء النظيفة. - الصور سجل الوقت الفاصل بين BAECs تمسكا ما يقرب من 24.5 ساعة على 37 درجة مئوية عن طريق المجهر المرحلة على النقيض مع التكبير 10x. بعد BAEC التصاق، سجل مفرزة من BAECs من سطح سانت IPAAm عند 20 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 3.5 ساعة.
5. خلية ورقة تلفيق على السطوح نقل الفيلم انجميور
- BAECs الثقافة تستخدم بنفس الطريقة الموضحة في القسم 4.
- البذور ما مجموعه 1.0 × 10 5 خلية / سم 2 على الأسطح سانت IPAAm واحتضان لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. متموجة BAECs فصل عفويا عند 20 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم توليفها بوليمرات كتلة تتكون من البوليسترين والبولي (N -isopropylacrylamide) (سانت IPAAms) مع الأوزان الجزيئية الخاصة التي الطوافة البلمرة الراديكالية. وقد أعد العلاج بالصدمات الكهربائية كعامل سلسلة نقل كما هو موضح في معاذ وآخرون. 28. تم توليفها جزيئين سانت IPAAm من أطوال مختلفة في سلسلة PIPAAm، وتميزت البوليمرات كتلة التي حصلت عليها 1 H الرنين النووي المغناطيسي (NMR) واللوني هلام تخلل (المؤتمر الشعبي العام). وكانت الأوزان الجزيئية من سانت IPAAms 32800 و67900، مع توزيع الوزن الجزيئي الضيق (1.31 و 1.50). تم العثور على التحويلات مونومر البوليسترين وكيل الطوافة الكلي وPIPAAm أن يكون 17.4٪ وأكثر من 85.0٪. كان اسمه توليفها سانت IPAAms سانت IPAAm170 وسانت IPAAm480، على التوالي.
ملفقة الأفلام انجميور مع مختلف المجالات في جزيء (A م) في لواجهة بين الهواء والماء من خلال إسقاط جزيئات سانت IPAAm الذائبة في حل الكلوروفورم (الشكل 1A). بعد إسقاط جزيئات سانت IPAAm، تم إصلاح الضغط سطح واجهة بين الهواء والماء في 0 م ن / م وزادت بشكل مستمر عن طريق إغلاق واجهة خلال الضغط مع الحواجز (الشكل 1B). يمكن الاستدلال على أي عيوب في أفلام انجميور شكلت على واجهة بين الهواء والماء من π-A م الأيسوثرم. تم نقل الفيلم سانت IPAAm انجميور أعدت على ركيزة الزجاج تعديل hydrophobically (سطح سانت IPAAm) (الشكل 1C). تم تقييم أرض نقل الفيلم من مجهر القوة الذرية (AFM). ويبين الشكل 2 AFM الصور الطبوغرافية (1 × 1 ميكرون) من الأسطح سانت IPAAm170 وسانت IPAAm480. وقد لوحظت النانو على أسطح سانت IPAAm، في حين أن هذه الهياكل ونادرا ما يلاحظ على الركيزة مسعور العارية. تم dependen حجم وشكل النانو بقوةر على وم وتكوين سانت IPAAm. وأكدت فؤاد الصور الطبوغرافية أن الأفلام انجميور يمكن نقلها بشكل متجانس على مسعور الركيزة الزجاج تعديل ويمكن التحكم في الأشكال التضاريسية سطح من التركيب الجزيئي و A م.
تم تقييم استقرار فيلم سانت IPAAm انجميور من قبل الانعكاس الكلي الموهن فورييه تحويل مطياف الأشعة تحت الحمراء (ATR / FT-IR). ويمكن تقدير كمية PIPAAms على الركيزة الزجاج مسعور من خط معايرة تم الحصول عليها من نسبة كثافة الذروة في 1000 سم -1 المستمدة من الزجاج (سي-O) و1،650 سم -1 المستمدة من PIPAAm (C = O). تم احتساب خط معايرة من سلسلة من مبالغ من PIPAAm يلقي على الزجاج مسعور. تم العثور على كميات من PIPAAm من سانت IPAAm170 (10 نانومتر 2 / جزيء) وسانت IPAAm480 (40 نانومتر 2 / جزيء) على الركيزة لتكون 0.87 ميكروغرام/ سم 2 و 0.63 ميكروغرام / سم 2 على التوالي. وكانت كمية PIPAAm على السطح بعد غسل بالماء المقطر تقريبا نفس تلك الموجودة على الأسطح دون غسل. وأشارت هذه النتائج إلى أن ملفقة السطوح سانت IPAAm كانت مستقرة في حالة المياه.
درسنا القادم الالتصاق ومفرزة من الخلايا البطانية البقري الشريان السباتي (BAECs) على أسطح سانت IPAAm. يظهر التصوير الفوتوغرافي الوقت الفاصل بين BAECs تمسكا وفصل على سطح سانت IPAAm480 في 40 نانومتر 2 / جزيء في الرسوم المتحركة الشكل 1. تمسكا BAECs عند 37 درجة مئوية وفصل بسرعة من كل من سانت IPAAm170 وسانت IPAAm480 بعد خفض درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية. وكان عدد من الخلايا الملتصقة على سانت IPAAm170 وسانت IPAAm480 عند 37 درجة مئوية 0.6 × 10 4 خلية / سم 2 و 0.9 × 10 4 خلية / سم 2، على التوالي، مشيرا إلى أن عدد الخلايا الملتصقةوالتضمين بنسبة تكوين سطح سانت IPAAm. ويمكن أيضا أن تعافى أوراق الخلية عن طريق فصل BAECs مثقف متموجة من هذه السطوح سانت IPAAm. وتصور ورقة خلية تعافى كهيكل خلية ثنائي الأبعاد (الشكل 3). خلايا صلت التقاء بعد ثلاثة أيام في الثقافة في سانت-IPAAm170 وسانت IPAAm480 السطوح عند 37 درجة مئوية، وعثر على ورقة خلية بسرعة بعد خفض درجة حرارة من 37 درجة مئوية إلى 20 درجة مئوية. وتتلخص تأثير الوزن الجزيئي و A م سانت IPAAms على الانتعاش ورقة خلية في الجدول 1. تم تقييم الجدوى من ورقة الخلية عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق بعد انفصال ورقة BAECs. واستخدمت الخلايا تعامل مع التربسين-EDTA على الركيزة الزجاج في 37 درجة مئوية كمجموعة تحكم. تم حساب نسب الخلايا الميتة في سانت-IPAAm170، سانت IPAAm480 والركيزة الزجاج مسعور كعنصر تحكم إلى أن ما يقرب من 11.0٪، 7.7٪، و 11.7٪ على التوالي. وأشارت هذه النتائج إلى أن متم جدوى ليرة لبنانية لا يكاد يؤثر كتبها انخفاض درجة الحرارة.
الشكل 1: إعداد السطح نقل فيلم thermoresponsive انجميور (أ) polystyrene- كتلة -poly (N -isopropylacrylamide) (سانت IPAAm) حل الكلوروفورم أسقطت بلطف على واجهة بين الهواء والماء. تم قياس ضغط السطح خلال ضغط للكشف عن أي عيوب في الفيلم انجميور. واستخدمت (ب) اثنين من الحواجز لضغط جزيئات سانت IPAAm على واجهة حتى المنطقة المستهدفة من 50 سم تم التوصل إليه 2. (C) بعد ضغط، وضعت ركيزة غطاء زجاجي تعديل hydrophobically أفقيا على التفاعل مع مرحلة المواءمة لمدة 5 دقائق. وقد رفع الركيزة أفقيا والمجففة لمدة 1 يوم. وقد تم هذا الرقم معدلة بشكل طفيف من نشر بواسطة ساكاتحاد المغرب العربي وآخرون. 27
الشكل 2: مجهر القوة الذرية (AFM) الصور الطبوغرافية (1 × 1 ميكرون) من انجميور السطوح نقل فيلم (سطح سانت IPAAm) اللوحة اليمنى: الأسطح ذات البنية النانومترية من سانت IPAAm170 مع وم 10 نانومتر 2 / الجزيء. اللوحة اليمنى: الأسطح ذات البنية النانومترية من سانت IPAAm480 مع وم 40 نانومتر 2 / الجزيء. وقد تم الحصول على الصور AFM في استغلال الوضع باستخدام السيليكون ناتئ مخدر الفوسفات مع ثابت الربيع من 3 نيوتن / متر وتردد الرنين من 70-90 كيلو هرتز.
يمثل الانتعاش ورقة (BAEC) الأبقار الخلايا البطانية الشريان السباتي لسطح نقل فيلم انجميور مع مختلف الكثافات وPIPAAm أطوال سلسلة "جيد" م سليمة: الجدول 1.الانتعاش ورقة ليرة لبنانية. "تعافى بالكاد" يعني أن الخلايا يمكن أن يكون مثقف confluently وأظهرت الخلايا المستزرعة مفرزة قليلة أو معدومة من السطح حتى بعد انخفاض في درجات الحرارة. "التصاق ضعيف" يعني أن الخلايا لم تكن مثقف لالتقاء عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام. 
الرقم 3: صورة العيانية ورقة خلية تعافى على سطح-نقل فيلم انجميور مع سانت IPAAm480 ووم 40 نانومتر 
الرسوم المتحركة الشكل 1: (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل) الصور الوقت الفاصل بين من BAECs التصاق ومفرزة على سطح-نقل فيلم انجميور مع سانت IPAAm480 وآم من 40 نانومتر 2 / الجزيء. وقد تم جمع الصور في 2 دقيقة فترات ووقدمت الصور التي تم جمعها كفيلم في 960x سرعة. الشريط النطاق في الفيلم هو 50 ميكرون. سانت IPAAm170 سانت IPAAm480 3 [نانومتر 2 / جزيء] 10 [نانومتر 2 / جزيء] 40 [نانومتر 2 / جزيء] 3 [نانومتر 2 / جزيء] 10 [نانومتر 2 / جزيء] 40 [نانومتر 2 / جزيء] التصاق ضعيفة جيد تعافى بالكاد التصاق ضعيفة التصاق ضعيفة جيد
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كانت ملفقة سطح تستجيب للحرارة من خلال طريقة انجميور-شايفر، وكان الأمثل لخصائص سطح لالتصاق الخلية / انفصال ورقة خلية الانتعاش. عند استخدام هذه الطريقة لتصنيع الأسطح، عدة خطوات حاسمة. في التركيب الجزيئي للجزيئات سانت IPAAm له تأثير كبير على البنية السطحية واستقرار السطح، وبالتالي، على التصاق الخلايا وانفصال. على وجه الخصوص، يجب أن يكون جزيئات سانت IPAAm توزيع الوزن الجزيئي الضيق. في أسلوبنا، وتوليفها جزيئين سانت IPAAm ذات أطوال مختلفة في سلسلة PIPAAm بواسطة الطوافة البلمرة، مما يتيح السيطرة على الوزن الجزيئي وتوزيع الوزن الجزيئي.
ينبغي اتخاذ خطوات لمنع التلوث من واجهة بين الهواء والماء أثناء إعداد السطح سانت IPAAm لتجنب عيوب في النانو. قبل أن يتراجع جزيئات البوليمر على واجهة، contaminanيجب أن يستنشق نهاية الخبر حتى يصل الضغط السطحي حوالي 0 م ن / م. تلوث يميل إلى تتراكم حول حواف الحوض ولوحة Wilhelmy. لأن لوحة Wilhelmy كان بعض التلوث على سطحه، وصلب عليه. عند استخدام Wilhelmy لوحة ورقة، وينبغي تكرار الخطوة تطلع على واجهة مرتين على الأقل. يعتمد π-A منحنى م الأيسوثرم أيضا على وجود تلوث في واجهة بين الهواء والماء. ونحن نوصي بأن منحنى الأيسوثرم يمكن الحصول عليها أكثر من مرة قبل تلفيق الفيلم. بسبب تلوث مسعور الركيزة الزجاج تعديل يمكن أن يحدث أيضا، يجب أن يكون في مهب الركيزة مع الهواء النقي أو غاز النيتروجين لإزالة التلوث.
لافتعال باستمرار انجميور السطوح نقل فيلم (سانت IPAAm السطح)، والجزء مسعور من البوليمر مهم لأن التفاعل مسعور بين الفيلم انجميور ومسعور ط الزجاج تعديل ق القوة الدافعة للتفاعل. في هذه الدراسة، لأنه يتكون من البوليمرات كتلة من البوليسترين، وهو مسعور بقوة، وPIPAAm محبة للماء في درجة حرارة الغرفة، والالتزام الفيلم نقل مستقر إلى الركيزة حتى في ظل ظروف المياه أو ثقافة الخلية. وهذا يدل على أن قطاعات مسعور تلعب دورا هاما في افتعال سطح قوي سانت IPAAm.
للسيطرة على التصاق الخلايا ومفرزة على سطح تستجيب للحرارة، فإن كلا من التركيب الجزيئي ومراقبة دقيقة من كثافة مهمة. في هذه الطريقة انجميور-شايفر، ومنطقة في جزيء (A م) من البوليمر المركب بمقدار معين من جزيئات انخفض والمنطقة المستهدفة من واجهة بين الهواء والماء يمكن أن يسيطر عليها ضغط. ويمكن من الناحية النظرية أن تحسب ألف متر إسقاط جزيئات سانت IPAAm بالمعادلة التالية:
د / 53465 / 53465eq1.jpg "/>
حيث A هي مساحة واجهة، M ث هو الوزن الجزيئي سانت-IPAAms، ج هي تركيز المحلول الكلوروفورم، N (أ) هو عدد أفوجادرو، والخامس هو تراجع حجم محلول البوليمر. لوحظ الهياكل البحر جزيرة النانوية على الأسطح سانت IPAAm بعد تلفيق لأن البوليمرات محبة للجهتين تشكل هياكل التنظيم الذاتي على واجهة بين الهواء والماء، كما هو موضح في الدراسات السابقة 13-17. وقد سيطر على حجم وكمية من هياكل النانو التي كتبها A م والوزن الجزيئي من سانت IPAAms.
تم تقييم التصاق الخلايا ومفرزة على الأسطح المطلية PIPAAm أقيمت بطرق مختلفة، بما في ذلك شعاع الالكترون التشعيع، بمبادرة سطح الطوافة البلمرة وتدور طلاء 19-27. بسبب الكثافة والوزن الجزيئي، وهيكل PIPAAm تؤثر سلل التصاق وانفصال، وتقنيات دقيقة لافتعال السطح المطلي PIPAAm-مهمة. في هذه الطريقة انجميور-شايفر، يمكن التحكم الكثافة والوزن الجزيئي وسطح النانو كما هو موضح أعلاه. التصاق الخلايا ومفرزة على أسطح سانت IPAAm تأثرت بشكل كبير من قبل مختلف وم وسانت IPAAm التركيب الجزيئي، وبعض شروط سانت IPAAm السطوح لالتصاق الخلايا ومفرزة يمكن زيادة الأمثل. وتشير هذه النتائج إلى أن هذه الطريقة يمكن التحكم في التفاعل بين سطح سانت IPAAm والخلايا.
لاستعادة بتكاثر ورقة خلية سليمة، وتصميم من البوليمر محبة للجهتين هو الأكثر أهمية. عندما يتم ملفقة البوليمرات ماء فقط على السطح من خلال طريقة انجميور-شايفر، تغسل البوليمرات المغلفة بسهولة من قبل الماء المقطر أو مستنبت. وأشارت هذه النتيجة إلى أن ضعف البوليمر مسعور لا ينبغي أن تستخدم لاستعادة بتكاثر ورقة خلية في هذه المنهجياتالتطوير التنظيمي لأنه البوليمر تعديل سطح غير مستقر في حالة المياه. في أسلوبنا، والجزء ماء في البوليمر محبة للجهتين يمكن تصنيع قوية على السطح دون غسل بها محلول مائي. وبالإضافة إلى ذلك، منذ أن تم نقل الفيلم انجميور متزامن إلى الركيزة الزجاج في هذه الدراسة، لوحظ الهياكل البحر جزيرة تحجيم نانو على السطح. على الرغم من أن بنية الفيلم انجميور على الجانب القاعدي هو معروف أن تكون مختلفة عن تلك التي على الجانب قمي، تم إصلاح الهيكل قبل نقل مواز.
وقد تركزت العلاج بالخلايا والطب التجديدي على إمكانية شفاء المرضى الذين لا يستجيبون للعلاجات الأخرى. وقد وضعت مختبرنا وفريدة من نوعها النهج الأصلي، خالية من سقالة الأنسجة الهندسة باستخدام الهندسة ورقة خلية ملفقة على سطح الثقافة مستجيبا لدرجات الحرارة مع التطبيقات المحتملة في هندسة الأنسجة. العديد من التجارب السريرية مع أوراق الخلية هي الريددى جارية وأظهرت نتائج ناجحة لعدة أنواع من الأنسجة 29-31. رغم استخدام BAECs كمصدر للخلايا لصنع صحائف الخلية، ومصادر أخرى من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية، ويمكن استخدامها لصنع صحائف على سطح سانت IPAAm طريق الاستفادة المثلى من مزيج من ألف متر، والتركيب الجزيئي للجزيئات سانت IPAAm. وهذه التكنولوجيا غير تقليدية تسهم ليس فقط لإنتاج السهل الأسطح ذات البنية النانومترية ولكن أيضا لاستراتيجيات ثقافة الخلية الأساسية للاستخدام في الطب التجديدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
- Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
- Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
- Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
- Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
- Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
- Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
- Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
- Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
- Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
- Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
- Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
- Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
- Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
- Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
- Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
- Yamato, M., Okano, T.
- Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
- Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
- Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
- Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
- Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
- Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
- Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
- Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
- Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
- Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).
