Introduction
ナノ構造化表面は、最近によるパターニング、細胞培養、洗浄、表面切り替えを含め、さまざまな潜在的用途にかなりの注目を集めています。例えば、蓮の葉やその他の応答性表面のナノ構造に触発された超疎水性表面は、外部からの刺激1-4に反応することができます。
ラングミュア膜は、最も広く研究され、ポリマーコーティングの一つです。ラングミュアフィルムを空気-水界面5-8に両親媒性分子を滴下することにより形成されます。フィルムは、その後、物理的または化学的吸着によって、固体表面に転写することができ、固体表面上の分子の立体配座は、垂直および水平転送方式9-12を用いて制御することができます。ラングミュア膜の密度が正確に空気 - 水界面を圧縮することによって調節することができます。最近、この方法はまた、ナノスケール海島structurを製造するための効果的であることが証明されています両親媒性ブロックコポリマーを利用することにより、ES。ナノ構造体は、疎水性セグメントのコアと親水性セグメント13-17の殻から成っているものとします。また、表面上のナノ構造の数は、界面でのブロック共重合体の分子当たりの面積（m）を制御することによって調節されます。
我々は、温度応答性培養表面を用いて、元の、ユニークな足場フリー組織工学アプローチ、細胞シート工学に焦点を当てています。開発した技術は、様々な器官18のための再生治療に適用されています。温度応答性培養表面は、表面19-27上に、ポリ（N -isopropylacrylamide）（PIPAAm）、温度応答性分子をグラフトすることにより作製しました。 PIPAAmおよびそのコポリマーは、32℃付近の温度で、水性媒体中で下限臨界溶液温度（LCST）を示します。培養表面は、温度応答性alternatiを示しました疎水性と親水性の間に。 37℃で、PIPAAmグラフト化表面は疎水性になり、細胞が容易に取り付けられ、表面上だけでなく、従来の組織培養ポリスチレン上で増殖しました。温度を20℃に下げたときに、表面が親水性となり、細胞が自然に表面から剥離します。従って、表面上で培養したコンフルエントな細胞は、温度を変化させることにより、完全なシートとして回収することができます。これらの細胞接着及び剥離特性はまた、研究室のデモンストレーション26、27ラングミュアフィルムコーティングによって製造面で表示した。ポリスチレン（P（ST））からなるブロック共重合体のラングミュア膜とPIPAAm（ST-IPAAm）を作製しました。特定のA mのラングミュア膜が水平に疎水的に修飾されたガラス基板に転写することができました。また、温度に応答して調製された表面からの細胞の接着および剥離を評価しました。
_content ">ここでは、ガラス基板上に熱応答性両親媒性ブロックコポリマーからなるナノ構造ラングミュア膜の製造のためのプロトコルを記述している。我々の方法は、表面科学の様々な分野において有機ナノフィルムのための効果的な製造技術を提供することができ、より多くのを容易にすることができます上の細胞接着を効果的に制御し、表面からの自然剥離。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ツーステップ可逆的付加-フラグメンテーション連鎖移動（RAFT）ラジカル重合によるポリポリスチレンブロックの1の合成（N -isopropylacrylamide）
- スチレン（153.6ミリモル）を溶解させ、4-シアノ-4-（ethylsulfanylthiocarbonyl）sulfanylpentanoic酸（ECT; 0.2ミリモル）、及び4,4'-アゾビス（4-シアノ吉草酸）（ACVA; 0.04ミリモル）を1 40ml中、 1,4-ジオキサン。反応性種を除去し、徐々に室温で解凍する15〜20分間真空下で液体窒素中で溶液をフリーズします。溶液が完全に解凍されていることを確認し、この凍結 - ポンプ - 解凍脱ガスサイクルを3回繰り返します。
- オイルバスで15時間、70℃で重合によるマクロRAFT剤として：ポリスチレン（PST）（13500 Mw）を取得します。
- 真空中でエーテルとドライの800ミリリットルと沈殿物たPStマクロRAFT剤。
- 1,4-ジオキサン4ml中IPAAmモノマー（4.32ミリモル）、たPStマクロRAFT剤（0.022ミリモル）、及びACVA（0.004ミリモル）を溶解させます。
- 削除しますステップ1.1で述べたように凍結 - ポンプ - 融解脱気サイクルによって溶液中の酸素。
- 脱気後の油浴中で15時間70℃で重合を行います。たPStマクロRAFT剤と同様の方法で：合成セントIPAAm分子（32800 Mw）を取得します。
シラン処理疎水性修飾ガラス基板の作製
- 表面汚染物を除去するために5分間、アセトンとエタノールと超音波処理の過剰な洗浄ガラス基板（×50mmの24 mm）です。
- 30分間65℃のオーブン中に基板を乾燥させます。その後、室温で基板の表面を活性化するために酸素プラズマ（400 W、3分）を使用します。
- 基板をsilanizeするRTで一晩、1％ヘキシルを含むトルエン中に基板を浸し。
- トルエン中でシラン化された基板を洗浄し、未反応物質を除去するために、30分間アセトンに浸します。
- 110℃で2時間アニール基質は完全にSを固定しますurface。
- 細胞培養皿（：φ35ミリメートルディッシュサイズ）に合うように25ミリメートル×24ミリメートルにガラスカッターでシラン化基板をカットします。
ラングミュアフィルムおよびフィルム転写表面の調製
- 埃の蓄積を防ぐために、キャビネットにラングミュア膜装置を配置します。
- （580ミリメートル×145ミリメートルサイズ）、蒸留水や汚染物質を除去するためにエタノールで障壁ラングミュアトラフを洗ってください。
- リントフリータオルで拭いてトラフや障壁を乾燥させます。その後、蒸留水約110ミリリットルでトラフを記入し、トラフの両側に障壁を設定します。蒸留水を3.5から3.13には、次の手順にこぼすことなく添加されるべきであることに注意してください。
- プレートが赤に変わるまで、ガスバーナーで表面張力を監視するために、その後、汚染物質を除去するために蒸留水で洗う：白金ウィルヘルミー板（39.24ミリメートル周囲を）加熱します。に取り付けられたワイヤ上ウィルヘルミープレートをサスペンド表面圧力測定機器。
- 製造業者のプロトコルに従ってゼロ面圧測定器。インタフェースは、ポリマーの任意の低下なしに約50 cm 2で達するまで溝の両側に障壁によってトラフの空気-水界面を圧縮します。
- 面圧まで吸引し、小さな汚染物質はほぼ0 MN / mです。
- 両側の障壁を再配置し、ステップ3.6から蒸留水の減少を補うために蒸留水を追加します。
- クロロホルムの現像液の5mlに合成されたサンIPAAm分子5mgを溶解させます。
注：ジクロロメタンまたはトルエンを溶媒として使用することもできます。 - 静かにマイクロシリンジまたはマイクロピペットを用いて、トラフ上にクロロホルムに溶解サンIPAAmの27μLをドロップします。
- クロロホルムを完全に蒸発を可能にするために5分間待った後、サンIPAAm molecuを圧縮するために、水平方向の両方の障壁を移動ル界面で。 cm 2で達成される50の標的領域まで0.5 mm /秒での障壁の圧縮率を維持します。
注：急速な圧縮率は、ラングミュア膜中の欠陥を引き起こします。 - 製造業者のプロトコルに従って、圧縮中の表面圧力測定機器に接続されている白金ウィルヘルミー板と面圧（π）-A メートル等温線を測定します。
- 対象領域の大きさに達した後、サンIPAAm分子がリラックスできるようにするために5分間表面を維持します。分子は、圧縮後すぐに平衡状態に達していません。
- 確実にフィルムを吸着するため5分間転写装置を用いて、疎水的に改質されたガラス基板にラングミュアフィルムを転送します。デバイス上で並列に疎水性のガラス基板を固定してください。アライメントステージにデバイスを接続し、垂直に移動します。
- desiccatoでの1日の転送装置と乾燥して水平に基板を持ち上げrを。
4.細胞を培養し、ラングミュアフィルム転写面上の細胞接着と剥離の最適化
- 10％の胎児を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で組織培養ポリスチレン（TCPS）上のCO 2、95％空気、5％中で37℃で三分の一コンフルエンスまで細胞懸濁液を、培養ウシ頸動脈内皮細胞（BAECs）を調製しウシ血清（FBS）および100 U / mlペニシリン。
- コンフルエンスに達した後、0.25％トリプシン-EDTAを3分間37℃、5％CO 2及び95％空気中で3mlでBAECsを扱います。
- DMEM、10％FBSを含有する10mlのを添加することによりトリプシン-EDTAを非アクティブ化し、50mlコニカルチューブに細胞懸濁液を収集します。
- 5分間、120×gで遠心分離し、上清を吸引除去します。再懸濁DMEMの10ミリリットルで細胞を。
- 5分間滅菌するためのクリーンベンチに紫外線下でサンIPAAm面を配置します。
- 回収されたCEの種子サンIPAAmのLLSは、使い捨て血球計により計数し、1.0×10 4細胞/ cm 2の濃度で表面及び5％CO 2および95％で37℃のインキュベーターを備えた顕微鏡で表面上の細胞を観察します空気。
注：クリーンベンチに搭載した紫外線によりサンIPAAm表面を滅菌します。 - 10倍の倍率で位相差顕微鏡により、37℃で約24.5時間、付着BAECsのレコードタイムラプス画像。 BAEC接着、約3.5時間、20℃でのSt-IPAAm表面からBAECsのレコード剥離後。
ラングミュアフィルム転写表面上5.細胞シートの作製
- セクション4で説明したのと同じ方法で使用される培養BAECs。
- サンIPAAm表面に1.0×10 5細胞/ cm 2の合計に播種し、5％CO 2中、37℃で3日間インキュベートします。コンフルエントBAECsは自発的に20℃で切り離さ。
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Representative Results
ポリスチレン、特定の分子量を有するポリ（Nの -isopropylacrylamide）（ST-IPAAms）からなるブロックコポリマーは、RAFTラジカル重合によって合成しました。 Moad ら 28に記載されるようにECTは、連鎖移動剤として調製しました。異なるPIPAAm鎖長の二サンIPAAm分子を合成し、得られたブロックポリマーは、1 H核磁気共鳴（NMR）、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によって特徴付けました。サンIPAAmsの分子量は、狭い分子量分布（1.31および1.50）で、32,800、および67900でした。ポリスチレンマクロRAFT剤とPIPAAmのモノマー転化率が17.4％以上85.0％であることが見出されました。合成されたサンIPAAmsはそれぞれ、サンIPAAm170とサンIPAAm480と命名しました。
分子当たりの様々な分野（ メートル ）とラングミュア膜がで作製しましたクロロホルム溶液（ 図1A）に溶解サンIPAAm分子をドロップすることにより、空気-水界面。サンIPAAm分子を滴下後、空気-水界面の面圧が0 MN /メートルで固定し、継続的な障壁（ 図1B）と圧縮時のインタフェースを閉じることによって増加しました。空気-水界面に形成されたラングミュア膜の欠陥は、π- メートル等温線から推測することができました。準備セントIPAAmラングミュア膜が疎水的に修飾されたガラス基板（ST-IPAAm面）（ 図1C）上に移しました。フィルム転写表面を原子間力顕微鏡（AFM）により評価した。 図2は、サンIPAAm170及びサンIPAAm480表面のAFMトポグラフィ画像（1×1μm）を示しています。このような構造は、まれにしか裸の疎水性基板上に観察されなかった一方でナノ構造は、サンIPAAm表面に観察されました。ナノ構造体の大きさや形状が強くdependenましたメートルとサンIPAAmの組成にトン。 AFMトポグラフィ画像は、ラングミュアフィルムを均一に疎水性修飾されたガラス基板上に転写し、表面形態は、分子の組成及びMによって制御できることができることが確認されました。
サンIPAAmラングミュア膜の安定性は、減衰全反射フーリエ変換赤外分光（ATR / FT-IR）により評価しました。疎水性ガラス基板上PIPAAmsの量は、ガラスシリコン（Si-O）に由来千センチメートル-1および1650センチメートル-1 PIPAAm（C = O）由来のピーク強度比から得られた検量線によって推定することができました。検量線は、疎水性ガラス上PIPAAmキャスト既知量の系列から計算しました。サンIPAAm170（10 nmの2 /分子）とサンIPAAm480基板上に、（40nmの2 /分子）のPIPAAmの量は、0.87μgのあることが判明しました/ cm 2であり、それぞれ0.63μgの/ cm 2で。蒸留水で洗浄した後、表面にPIPAAmの量はほとんど洗浄せずに表面上のものと同じでした。これらの結果は、製造されたサンIPAAm表面は水条件において安定であることを示しました。
我々は、次のサンIPAAm表面上ウシ頸動脈内皮細胞（BAECs）の接着および剥離を調べました。 40nmの2 /分子でサンIPAAm480表面に付着し、着脱BAECsのタイムラプス撮影が急速に減少した後、サンIPAAm170とサンIPAAm480両方から分離した37℃でのアニメーション図1。接着BAECsに示されています20℃に温度。 37℃でのサンIPAAm170とサンIPAAm480上の接着細胞の数は0.6×10 4細胞/ cm 2と0.9×10 4細胞/ cm 2であった、それぞれ、示すその付着細胞の数sがサンIPAAm表面の組成によって変調されました。細胞シートは、これらのサンIPAAm表面からコンフルエント培養BAECsを分離することによって回収することができます。回収された細胞シートは、二次元セル構造（ 図3）のように可視化しました。サンIPAAm170及びサンIPAAm480で培養3日後にコンフルエンスに達した細胞を、37℃で表面、及び細胞シートを急速に37°Cから20°Cまで温度を低下させる後に回収しました。分子量および細胞シートの回収のサンIPAAmsのMの効果は、 表1に要約されている。細胞シートの生存率はBAECsシートを剥離した後、トリパンブルー染色によって評価しました。 37ºCでガラス基板上に、トリプシン-EDTAで処理した細胞を対照として使用しました。サンIPAAm170、サンIPAAm480及び制御のような疎水性のガラス基板上死細胞比はそれぞれ約11.0％、7.7％、および11.7％であると計算されました。これらの結果は、CEを示しましたLLの生存率はほとんど温度低下による影響を受けませんでした。
図1：温度応答性ラングミュア膜転写面の調製 （A）ポリスチレンブロック -ポリ（N -isopropylacrylamide）（セントIPAAm）クロロホルム溶液を穏やかに空気-水界面上に滴下しました。面圧はラングミュア膜中の欠陥を検出するために、圧縮中に測定しました。 cm 2で50の標的領域に到達するまで（B）2の障壁は、インターフェイス上サンIPAAm分子を圧縮するために使用しました。 （C）圧縮した後、疎水性に改質されたカバーガラス基板を水平に5分間アライメントステージとのインタフェース上に置きました。基板を水平に持ち上げ、1日乾燥させました。この図は、わずかサックによる刊行物から変更されていますUMA ら。27
図2： ラングミュアフィルム転写面（サンIPAAm面）の原子間力顕微鏡（AFM）の地形の画像（1×1μm）の左パネル：サンIPAAm170のナノ構造の表面を10nm 2 /分子のmの。右パネル：40 nmの2 /分子のA mのサンIPAAm480のナノ構造の表面。 AFM画像は3 N / m及び70-90キロヘルツの共振周波数のばね定数とリンがドープされたシリコンカンチレバーを用いてタッピングモードで得ました。
表1： 種々の密度及びPIPAAm鎖長を有するラングミュア膜転写面のウシ頚動脈内皮細胞（BAEC）シートの回復 "良い"は、無傷のCEを表し、LLシート回復。 「とたん回収されなかった」細胞がコンフルエントに培養することができ、培養細胞でも温度低下した後、表面からほとんど、あるいは全く剥離が認められたことを意味します。 「弱い接着性」は、細胞を3日間37℃でコンフルエンスまで培養しなかったことを意味します。 
図3： セントIPAAm480とラングミュアフィルム転写表面に回収した細胞シートと40nmのA mの巨視的画像 
アニメーション図1： 。（ 右クリックしてダウンロード）のSt-IPAAm480と40nmの2 /分子のアムとラングミュア膜転写面上BAECs接着および剥離のタイムラプス撮影。画像は2分間隔で収集し、収集した画像は960x速度でムービーとして提供されました。ザ映画の中のスケールバーは50μmです。 サンIPAAm170 サンIPAAm480 3 [nmで2 /分子] 10 [nmで2 /分子] 40 [nmで2 /分子] 3 [nmで2 /分子] 10 [nmで2 /分子] 40 [nmで2 /分子] 粘着力が弱いです 良い ほとんど回復していません 粘着力が弱いです 粘着力が弱いです 良い
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Discussion
温度応答性表面は、ラングミュア - シェーファー法により作製し、細胞接着/剥離および細胞シートの回収のために表面特性を最適化しました。表面を製造するためのこの方法を使用する場合、いくつかのステップは重要です。サンIPAAm分子の分子組成物は、表面構造および表面の安定性、ひいては、細胞接着および剥離に大きな影響を与えます。特に、サンIPAAm分子は、狭い分子量分布を有するべきです。本手法では、異なるPIPAAm鎖長を有する2つのセントIPAAm分子は、分子量及び分子量分布の制御を可能にする、RAFT重合により合成しました。
ステップは、ナノ構造の欠陥を回避するためにサンIPAAm表面の調製中に、空気 - 水界面の汚染を防止するために注意すべきです。インターフェイス上にポリマー分子をドロップする前に、contaminan面圧が約0 MN /メートルに達するまでのtsを吸引する必要があります。汚染は、トラフとウィルヘルミ板のエッジの周りに蓄積する傾向があります。ウィルヘルミー板はその表面に何らかの汚染があったので、それがアニールしました。紙ウィルヘルミー板を使用する場合、界面での吸引工程を少なくとも2回繰り返されるべきです。 π-A メートルの等温線は、空気-水界面での汚染の存在に依存します。私たちは、等温線の曲線はフィルムの製造前に複数回得られることをお勧めします。疎水性修飾されたガラス基板の汚染も発生する可能性があるため、基板は、汚染を除去するために、新鮮な空気や窒素ガスを吹き付けする必要があります。
一貫してラングミュアフィルム転写面（サンIPAAm面）を製造するために、ポリマーの疎水性セグメントは重要であるため、ラングミュア膜及び疎水性修飾ガラスIとの間の疎水性相互作用反応の駆動力です。ブロック共重合体は、室温で強力に疎水性ポリスチレン、および親水性PIPAAmで構成されたので、この研究では、転写フィルムを安定しても、水又は細胞培養条件下で基板に接着させました。これは、疎水性セグメントは、強固なサンIPAAm表面を製造する際に重要な役割を果たすことを示しています。
温度応答性表面上の細胞接着および剥離を制御するために、分子の組成および密度の精密な制御の両方が重要です。このラングミュア-シェーファー法では、ドロップされた分子の一定量と、空気-水界面の標的領域によって合成されたポリマーの分子当たりの面積（m）は圧縮によって制御することができます。サンIPAAm分子を滴下A mは 、理論的には、以下の式によって計算することができます。
D / 53465 / 53465eq1.jpg "/>
Aは 、M wの界面の面積であります サンIPAAmsの分子量であり、Cは、クロロホルム溶液の濃度であり、N Aはアボガドロ数であり、Vは、ポリマー溶液の体積がドロップされます。以前の研究13-17で説明したように、両親媒性ポリマーは、空気-水界面で自己組織化構造を形成するため、ナノスケール海島構造は、製造後サンIPAAm表面に観察されます。ナノスケール構造の大きさと量をMとサンIPAAmsの分子量により制御しました。
細胞接着および剥離は、電子ビーム照射を含む様々な方法によって製造PIPAAm被覆表面上で評価し、表面開始RAFT重合および19-27をスピンコーティングしました。密度、分子量、及びPIPAAm構造がセルに影響を与えるためリットル接着および剥離は、PIPAAm被覆表面を製造するための正確な技術が重要です。上述のように、このラングミュア - シェーファー法では、密度、分子量、および表面のナノ構造を制御することができます。サンIPAAm表面上の細胞接着および剥離を大幅メートルとサンIPAAm分子組成の様々な影響を受けた、および細胞接着と剥離のためのSt-IPAAm表面のいくつかの条件をさらに最適化することができます。これらの結果は、この方法は、サンIPAAm表面と細胞との間の相互作用を制御することができることを示しています。
再現性、無傷の細胞シートを回収するために、両親媒性ポリマーの設計が最も重要です。唯一の親水性ポリマーは、ラングミュア - シェーファー法により表面上に作製される場合、コーティングされたポリマーは、容易に蒸留水または培地によって洗い流されます。この結果は、弱い疎水性ポリマーを再現このメタに細胞シートを回収するために使用すべきではないことが示されODポリマー改質-表面は水の状態で不安定であったため。我々の方法では、両親媒性ポリマー中の親水性セグメントは、水溶液により洗浄することなく、表面に強固な製造を可能にします。ラングミュア膜が並列本研究でガラス基板に転写されたのでさらに、ナノスケールの海島構造が表面に観察されました。基底側ラングミュア膜の構造はよく頂端側とは異なることが知られているが、構造が平行移動することによって固定しました。
細胞治療や再生医療は、他の治療に反応しない患者を癒しの可能性に焦点が当てられてきました。私たちの研究室では、組織工学における潜在的なアプリケーションとの温度応答性培養表面上に作製した細胞シート工学を用いて元の、ユニークな足場のない組織工学的手法を開発しました。細胞シートを持ついくつかの臨床試験はalreaあります進行中DY及び組織29-31のいくつかのタイプのために成功した成果を実証しました。 BAECsは、幹細胞を含む細胞シート、他の細胞供給源を作製するための細胞源として使用したが、m及びサンIPAAm分子の分子組成の組み合わせを最適化することにより、サンIPAAm表面上のシートを製造するために使用することができます。この非従来技術は、ナノ構造の表面を容易に製造するだけでなく、再生医療で使用するための基本的な細胞培養戦略のみならず貢献します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
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