Introduction
Nano yapılı yüzeyleri son zamanlarda nedeniyle desenleme, hücre kültürü, temizlik ve yüzey geçiş dahil olmak üzere çeşitli potansiyel uygulamalara önemli ilgisini çekmiştir. Örneğin, Lotus, yaprak ve başka duyarlı yüzeylerin nano esinlenerek süperhidrofobik yüzeyler dış stimuli 1-4'e reaksiyona girebilir.
Langmuir filmi üzerinde en çok çalışılan polimer kaplamaların biridir. Langmuir film, hava-su arayüzünde 5-8 üzerine amfifilik moleküller bırakarak oluşturulur. Film daha sonra fiziksel veya kimyasal adsorpsiyonuyla bir katı yüzey üzerine transfer edilebilir, ve bir katı yüzey üzerinde bir moleküler konformasyon, dikey ve yatay aktarım yöntemleri 9-12 kullanılarak kontrol edilebilir. Langmuir filmin yoğunluğu tam olarak hava-su arayüzü sıkıştırılmasıyla ayarlanabilir. Son zamanlarda, bu yöntem aynı zamanda nano skalasmdaki deniz ada structur imal edilmesi için etkili olduğu kanıtlanmıştıramfifilik blok kopolimerler kullanılarak es. Nano hidrofilik bölümlere bir çekirdek ve hidrofilik kısımlar 13-17 bir kaplamadan oluşmaktadır varsayılır. Buna ek olarak, bir yüzey üzerine nano sayısı ara yüzeyinde blok kopolimerinin molekül başına alanı (A m) kontrol edilmesi suretiyle kontrol edilir.
Biz bir sıcaklık duyarlı kültür yüzey kullanarak, bir orijinal, benzersiz iskele-serbest doku mühendisliği yaklaşımıyla, hücre sac mühendisliği üzerine odaklanmıştır. Geliştirilen teknoloji, çeşitli organlarda 18 için rejeneratif tedaviler uygulanmıştır. Olan, ısıya duyarlı bir kültür yüzey yüzeye 19-27 üzerine poli (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), bir sıcaklık duyarlı molekül, aşılanmasıyla imal edilmiştir. PIPAAm ve kopolimerleri sergiler 32 ° C'ye yakın bir sıcaklıkta sulu ortam, daha düşük bir kritik çözelti sıcaklığı (LCST'nin). Kültür yüzey aynı zamanda bir sıcaklığa duyarlı alternatif akım sergiledi hidrofobiklik ve hidrofilisite arasındaki ilgili. 37 ° C 'de, PIPAAm-aşılı bir yüzey hidrofobik hale geldi ve hücreler hali hazırda bağlanmış ve yüzey üzerinde yanı sıra, geleneksel doku kültürü polistiren üzerinde çoğaldı. Sıcaklık 20 ° C'ye düşürülür zaman, yüzeyi hidrofilik hale geldi ve hücreler kendiliğinden yüzeyinden ayrılmaktadır. Bu nedenle, yüzey üzerinde kültürlenmiş konfluent hücreler sıcaklığı değiştirerek sağlam bir tabaka olarak hasat edilebilir. Bu hücre yapışma ve sıyrılma özellikleri de. Laboratuar gösteri 26, 27, Langmuir film kaplama ile imal edilmiş yüzey sergilendi polistiren (P (St)) ve PIPAAm (St-IPAAm) oluşan blok kopolimerlerinin bir Langmuir filmin imal edilmiştir. Belirli bir m Langmuir Film yatay olarak hidrofobik olarak modifiye edilmiş bir cam alt-tabakaya aktarılabilir. Buna ek olarak, sıcaklığa tepki olarak hazırlanmış yüzeyinden hücre üzerindeki yapışma ve sıyrılma değerlendirildi.
_content "> Burada, bir cam alt-tabaka üzerinde termo-duyarlı amfifilik blok kopolimerlerinden Nano yapısındaki Langmuir filmin imalatı için protokolleri açıklanmıştır. Önerilen yöntem yüzey bilimi çeşitli alanlarda organik nanofilms için etkili bir imalat bir teknik olabilir ve daha çok kolaylaştırabilir hücre yapışması etkili kontrolü ve bir yüzeyden kendiliğinden dekolmanı.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Polistiren blok -poli (N -isopropylacrylamide) İki aşamalı Döner İlavesi-parçalanma Zincir Transferi (RAFT) Radikal Polimerizasyon ile 1. Sentezi
- stiren (153.6 mmol) çözündürülür, 4-siyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sülfanilpentanoik asit (ECT, 0.2 mmol), ve 4,4'-azobis (4-siyanovalerik asit) (ACVA; 0.04 mmol), 1 40 ml, 4-dioksan. reaktif türler çıkarın ve yavaş yavaş oda sıcaklığında çözülmesine 15-20 dakika boyunca vakum altında sıvı azot içinde dondurularak. Çözelti tamamen çözülmüş olduğundan emin olun ve bu donma-pompa-çözülme gaz giderme döngüsü üç kez tekrarlayın.
- Bir yağ banyosu içinde 15 saat boyunca 70 ° C'de polimerizasyon ile makro RAFT madde olarak: polistiren (PST) (13,500 Mw) elde edilir.
- Çökelti PSt makro RAFT eter 800 ml ile ajan ve vakum altında kurutulur.
- 1,4-dioksan ve 4 ml IPAAm monomer (4.32 mmol) PST makro RAFT madde (0.022 mmol) ve ACVA (0.004 mmol) çözündürülür.
- KaldırDondurularak-Pompalama-Eritme devinimi ile gaz giderme çözeltisi oksijen adım 1.1 belirtildiği gibi.
- Gaz almadan sonra, bir yağ banyosu içinde 15 saat boyunca 70 ° C'de ve polimerizasyon ile sertleştirilmesi. PSt makro RAFT madde olarak aynı şekilde: sentezlendi St-IPAAm molekül (32,800 Mw) elde edilir.
Silisyum hidritleştirilmiş hidrofobik modifiye cam tabakaların 2. Hazırlık
- 5 dakika boyunca aseton ve etanol ve sonikasyon fazlası ile yıkayın, cam alt-tabakalar (24 mm x 50 mm), yüzey kirleri çıkarmak için.
- 30 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde alt tabakaların kurutun. Daha sonra oda sıcaklığında alt-tabakaların yüzeyleri aktif hale getirmek için oksijen plazma (400 W, 3 dakika) kullanın.
- alt-tabakanın Silanize için gece boyunca oda sıcaklığında% 1 hexyltrimethoxysilane içeren tolüen içinde alt tabakaların bırakın.
- toluen içinde silanize substratları yıkayın ve reaksiyona girmemiş maddeler çıkarmak için 30 dakika boyunca aseton içinde bırakın.
- 110 ° C'de 2 saat boyunca tavlama substratlar iyice s hareketsiz hale getirmekSenin yüzün.
- Hücre kültürü yemekleri (: φ35 mm çanak boyutu) sığdırmak için 25 mm x 24 mm bir cam kesici ile Silanlanmış yüzeylerde kesin.
Langmuir Film ve Film transfer Yüzeyin 3. hazırlanması
- toz birikimini önlemek için bir kabine Langmuir filmi aleti yerleştirin.
- (580 mm x 145 mm boyutunda) ve damıtılmış su ve kirletici maddelerin, etanol ile engelleri Langmuir çukur yıkayın.
- Bir lintless havlu ile silinerek çukur ve engelleri kurutun. Sonra damıtılmış su, yaklaşık 110 ml çukur dolgu ve çukur her iki tarafta da engeller ayarlayın. Damıtılmış su 3.5 ila 3.13 aşağıdaki adımlarda dökmeden eklenmesi gerektiğini unutmayın.
- plaka kırmızı olana kadar bir gaz brülör ile yüzey gerilimini izlemek için ve daha sonra kirleri çıkarmak için distile su ile yıkayın: platin Wilhelmy plakası (39.24 mm çevre) ısıtın. bağlı bir tel VVilhelmy plaka Askıdayüzey basınç ölçüm aleti.
- üreticinin protokolüne uygun olarak yüzey basınç-ölçüm aleti sıfır. Arayüz polimerin herhangi bir damla olmadan yaklaşık 50 cm, 2 ulaşana kadar oluğun her iki yanında bariyerlerle çukur hava-su ara yüzeyine sıkıştırın.
- yüzey basıncı kadar aspire küçük kirleticiler yaklaşık 0 mN / m'dir.
- her iki tarafta engelleri yeniden getirin ve aşama 3,6 damıtılmış su düşüşü telafi için distile su ekleyin.
- Kloroform bir gelişme çözeltisi, 5 ml sentezlenen St-IPAAm molekülünün 5 mg eritin.
Not: diklorometan ya da tolüen, aynı zamanda çözücü olarak da kullanılabilir. - Yavaşça mikroenjektör veya mikropipet kullanarak oluk üzerine kloroform içinde çözüldü St-IPAAm 27 ul bırakın.
- 5 dakika bekledikten sonra, kloroform tam buharlaşmaya izin St-IPAAm molecu sıkıştırmak için yatay olarak hareket ettirmek için engelleriarayüzde le. Cm 2 ulaşıldığında 50 hedef alan kadar 0,5 mm / sn engellerin sıkıştırma oranını korumak.
Not: Bir hızlı sıkıştırma oranı Langmuir filmde kusurları neden olur. - Üreticinin protokolüne uygun olarak, sıkıştırma esnasında yüzey basınç-ölçüm cihazına takılı platin, Wilhelmy Plate yüzey basıncı (π) -A m izotermlerinin ölçün.
- hedef alan boyutu ulaştıktan sonra, St-IPAAm molekülleri dinlenmek için izin 5 dakika boyunca yüzeyi korumak; moleküller sıkıştırma hemen sonra dengeye ulaşması yok.
- sağlam filmi emmek için 5 dakika için bir transfer cihazı kullanılarak hidrofobik olarak modifiye edilmiş bir cam alt-tabakaya Langmuir film transfer. cihazda paralel olarak hidrofobik cam alt tabakayı sabitleyin. Bir hizalama aşamasına aygıtı bağlayın ve dik hareket ettirin.
- Bir desiccato 1 gün transfer aparatı ve kuru yatay alt tabakayı kaldırınr.
4. Hücreler kültüre ve Langmuir Film Aktarılan Yüzey Hücre Yapışma ve Müfreze Optimize
- % 10 fetal içeren Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ile doku kültür polistiren (TCPS) üzerine CO2 ve% 95 hava,% 5, 37 ° C 'de üçte biri izdiham hücre süspansiyonları, kültür sığır karotis endotel hücrelerini (BAECs) hazırlamak için sığır serumu (FBS) ve 100 U / ml penisilin.
- Ortak akışa ulaşıldıktan sonra, CO2 ve% 95 hava,% 5 37 ° C'de 3 dakika boyunca% 0.25 tripsin-EDTA 3 ml BAECs tedavi.
- DMEM,% 10 FBS ihtiva eden 10 ml ekleyerek tripsin-EDTA devre dışı bırakma ve 50 ml konik bir tüp hücre süspansiyonu toplanır.
- 5 dakika boyunca 120 xg'de santrifüj ve süpernatant aspire. DMEM 10 ml hücreleri yeniden askıya.
- 5 dakika boyunca sterilize etmek için temiz bir bankta ultraviyole ışık altında St-IPAAm yüzeyleri yerleştirin.
- iyileşti ce TohumlarınSt-IPAAm LLS bir kullanılıp atılabilir hemositometre ile sayıldı 1.0 x 10 4 hücre / cm2'lik bir konsantrasyonda yüzeyleri ve% 5 CO2 ve% 95 ile 37 ° C'de bir kuluçka ile donatılmış bir mikroskop ile yüzeye hücreleri dikkate hava.
Not: Temiz bir tezgah donatılmış ultraviyole ışıkla St-IPAAm yüzeyleri sterilize edin. - 10X büyütme ile bir faz-kontrast mikroskobu ile 37 ° C'de yaklaşık 24.5 saat boyunca yapışık BAECs kayıt time-lapse görüntüler. BAEC yapışma, yaklaşık 3.5 saat boyunca 20 ° C 'de St-IPAAm yüzeyinden BAECs kayıt ayrıldıktan sonra.
Langmuir Film transfer Yüzeyler 5. Hücre Sac İmalatı
- Aynı şekilde kullanılan kültür BAECs bölüm 4'te tarif edilen.
- St-IPAAm yüzeylerde 1.0 x 10 5 hücre / cm2 bir toplam tohum ve% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de 3 gün boyunca inkübe edilir. Konfluent BAECs kendiliğinden 20 ° C'de ayrılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polistiren ve spesifik molekül ağırlıklarına sahip poli (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) oluşan blok kopolimerleri RAFT radikal polimerizasyonu ile sentezlenmiştir. Moad ve ark., 28 de tarif edildiği gibi, ECT, bir zincir transfer maddesi olarak elde edilmiştir. Farklı PIPAAm zincir uzunlukları iki St-IPAAm moleküller sentez edildi ve elde edilen blok polimerleri 1H Nükleer manyetik rezonans (NMR) ve jel sızdırma kromatografisi (GPC) ile karakterize edilmiştir. St-IPAAms molekül ağırlıkları dar bir molekül ağırlığı dağılımına (1.31 ve 1.50) ile, 32.800 ve 67.900 idi. polistiren makro RAFT madde ve PIPAAm monomer dönüşüm% 17,4 fazla% 85.0 olarak bulunmuştur. Sentezlenen St-IPAAms sırasıyla St-IPAAm170 ve St-IPAAm480 adlandırılmıştır.
Molekül başına çeşitli alanlarda (A m) Langmuir filmler bir de imal edilmiştirKloroform çözeltisi (Şekil 1A) içinde çözülmüş St-IPAAm molekülleri bırakarak hava-su arayüzü. St-IPAAm molekülleri bıraktıktan sonra, hava-su ara yüzey basıncı 0 mN / m sabit ve sürekli engelleri (Şekil 1B) ile sıkıştırma sırasında arayüzü kapatarak artmıştır. Bir hava-su arayüzü üzerinde oluşan Langmuir filmlerde herhangi bir kusurları π-A m izotermi anlaşılmaktadır olabilir. Hazırlanan St-IPAAm Langmuir film hidrofobik olarak modifiye edilmiş bir cam alt-tabaka (St-IPAAm yüzeyi) (Şekil 1C) üzerine aktarıldı. Film transfer yüzey atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile değerlendirildi. 2 St-IPAAm170 ve St-IPAAm480 yüzeylerin AFM topografik görüntülerini (1 x 1 mikron) göstermektedir. Bu tür yapılar çok nadir çıplak hidrofobik alt-tabaka üzerine gözlenirken Nano, St-IPAAm yüzeylerde gözlenmiştir. Nanoyapıların büyüklüğü ve şekli şiddetle bağımlı hazırlık edildiBir m t ve St-IPAAm bileşimi. AFM topografik görüntüler Langmuir filmleri homojen hidrofobik modifiye cam alt tabaka üzerine ve yüzey morfolojileri moleküler kompozisyonu ve A m tarafından kontrol edilebileceğini transfer edilebilir doğruladı.
St-IPAAm Langmuir filmin stabilitesi zayıflatılmış toplam yansıma ile değerlendirilmiştir infrared spektroskopi (ATR / FT-IR) Fourier dönüşümü. Hidrofobik bir cam alt-tabaka üzerinde PIPAAms miktarı 1000 cm tepe yoğunluk oranı -1 cam (Si-O) ve 1650 cm-1 PIPAAm (C = O) türetilen türetilmiş elde edilen bir kalibrasyon hattı ile tahmin edilebilir. Kalibrasyon hattı hidrofobik cam üzerinde PIPAAm döküm bilinen miktarlarda bir dizi hesaplandı. St-IPAAm170 (10 mil 2 / molekül) St-IPAAm480 alt-tabaka üzerine (40 mil 2 / molekülü) arasında PIPAAm miktarları 0.87 ug olduğu bulundu/ cm2 ve sırası ile 0.63 mg / cm2. Damıtılmış su ile yıkandıktan sonra yüzeyde PIPAAm miktarı neredeyse yıkanmadan yüzeylerde aynı oldu. Bu sonuçlar, imal St-IPAAm yüzeyler bir su durumda stabil olduğunu göstermiştir.
Önümüzdeki yapışma ve St-IPAAm yüzeylerde sığır karotid arter endotel hücreleri (BAECs) ayrılmasını incelenmiştir. 40 nm 2 / molekülün St-IPAAm480 yüzeyinde yapışık ve ayırma BAECs Time-lapse fotoğraf hızla azalan sonra St-IPAAm170 ve St-IPAAm480 hem müstakil 37 ° C'de Hareketli Şekil 1. Yapışık BAECs gösterilmektedir 20 ° C sıcaklık. 37 ° C'de St-IPAAm170 St-IPAAm480 yapışık hücre sayısı 0.6 x 10 4 hücre / cm2 ve 0.9 x 10 4 hücre / cm2 olduğu sırasıyla belirten yapışık hücre sayısıs St-IPAAm yüzeyinin bileşimi ile modüle edilmiş. Hücre levhalar ayrıca St-IPAAm yüzeylerden konfluent kültür BAECs ayırarak kurtarıldı olabilir. Toplanan hücre tabakası, bir iki-boyutlu bir hücre yapısı (Şekil 3) olarak görselleştirildi. St-IPAAm170 St-IPAAm480 kültürün üç gün sonra bir araya gelerek konfluens Hücreler, 37 ° C 'de yüzeyleri ve hücre yapraklan hızla 20 ° C'ye kadar 37 ° C sıcaklığın azaltılması sonrasında geri kazanıldı. Molekül ağırlığı ve hücre yapraklan geri St-IPAAms arasında bir erime etkisi Tablo 1 'de özetlenmiştir. Hücre tabakaları yaşayabilirliği BAECs tabakasının ayrılmasından sonra tripan mavi boyama ile değerlendirildi. 37 ° C'de bir cam alt tabaka üzerinde tripsin-EDTA ile işleme tabi hücreleri, kontrol olarak kullanılmıştır. St-IPAAm170, St-IPAAm480 ve bir kontrol olarak, hidrofobik bir cam alt-tabaka üzerinde ölü hücre oranları sırası ile yaklaşık% 11.0,% 7.7 ve% 11.7 olduğu hesaplandı. Bu sonuçlar, ce belirtilmedikçell canlılığı pek sıcaklık azalması etkilenmiştir.
Şekil 1: a. Thermoresponsive Langmuir film transfer yüzeyin hazırlanması (A) polistiren blok -poli (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAm) kloroform çözüm yavaşça bir hava-su ara üzerine düştü. Yüzey basıncı Langmuir filmde herhangi bir kusur tespit etmek sıkıştırma sırasında ölçüldü. (B) iki bariyer 2 ulaşıldı 50 cm bir hedef alanı kadar arabirimde St-IPAAm molekülleri sıkıştırmak için kullanılmıştır. (C) sıkıştırıldıktan sonra, hidrofobik olarak modifiye edilmiş cam kapak alt-tabaka yatay 5 dakika boyunca bir hizalama evresi arayüzü üzerine yerleştirilmiştir. alt-tabaka, yatay kaldırılır ve 1 gün için kurutulmuştur. Bu rakam biraz Sak tarafından yayından modifiye edilmiştirUma ve ark., 27
Şekil 2:. Langmuir film transfer yüzeyleri (St-IPAAm yüzeyi) Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) topografik görüntüler (1 x 1 mikron) Sol panel: 10 nm 2 / molekülünün A m St-IPAAm170 ve Nanostructured yüzeyleri. Sağ paneli: 40 nm 2 / molekülünün A m St-IPAAm480 ve Nanostructured yüzeyleri. AFM ve görüntüler bir yay 3 N / m sabit ve 70-90 kHz'lik rezonans frekansı ile bir fosfat içerikli silikon bir konsol hafifçe vurma modunda elde edildi.
Tablo 1:. Çeşitli yoğunluklarda ve PIPAAm zincir uzunlukları ile bir Langmuir film transfer yüzeyinin Sığır karotid arter endotel hücre (BAEC) levha kurtarma "İyi" bozulmamış ce temsilll levha kurtarma. "Hemen hemen geri" hücreler confluently kültürlenmiş olabilir ve kültürlenmiş hücreler daha sıcaklığında bir azalma sonrasında yüzeyinden çok az veya hiç ayrılmasını gösterdi anlamına gelir. "Zayıf yapışma" hücreler, 3 gün boyunca 37 ° C'de izdiham kültürlendi olmadığı anlamına gelir. 
Şekil 3, St-IPAAm480 bir Langmuir film transfer yüzeyi üzerinde bir geri kazanılmış hücre tabakası ve 40 nm'lik bir A m makroskopik görüntüsü 
Hareketli Resim 1: . (Sağ indirmek için tıklayın) St-IPAAm480 ve 40 nm 2 / molekülünün bir Am ile Langmuir film transfer yüzeyinde BAECs yapışma ve dekolmanı Time-lapse fotoğraf. Çıkan 2 dakikalık aralıklarla toplandı ve toplanan resimler 960x hızda bir film olarak verilmiştir.Filmde ölçek çubuğu 50 mm. St-IPAAm170 St-IPAAm480 3 [mil 2 / molekül] 10 [nm 2 / molekül] 40 [mil 2 / molekül] 3 [mil 2 / molekül] 10 [nm 2 / molekül] 40 [mil 2 / molekül] zayıf yapışma İyi pek kurtarıldı zayıf yapışma zayıf yapışma İyi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olan, ısıya duyarlı bir yüzey Langmuir-Schaefer yöntemi ile imal edilmiş, ve hücre yapışması / sökme ve hücre yapraklan geri kazanımı için yüzey özellikleri optimize edilmiştir. yüzeylerin imalatı için bu yöntemi kullanırken, birkaç adım çok önemlidir. St-IPAAm moleküllerinin moleküler bileşim olup, hücre yapışması ve ayrılması yüzey yapısı üzerinde büyük bir etkiye ve yüzey stabilitesini, ve dolayısıyla, yer alır. Özellikle, St-IPAAm molekülleri dar bir molekül ağırlığı dağılımına sahip olmalıdır. Bizim bir yöntemde, farklı PIPAAm zincir uzunlukları olan iki St-IPAAm moleküller, molekül ağırlığı ve molekül ağırlığı dağılımı kontrol sağlayan, RAFT polimerizasyonu ile sentezlenmiştir.
Adımlar nanoyapılardaki kusurları önlemek için St-IPAAm yüzeyin hazırlanması sırasında hava-su arayüzü kirlenmesini önlemek için alınmalıdır. arayüzü üzerine bir polimer molekülleri bırakarak, contaminan önceYüzey basıncı yaklaşık 0 mN / m ulaşana kadar ts aspire edilmelidir. Kirlilik çukur ve Wilhelmy plakası kenarlarında birikir eğilimindedir. VVilhelmy plâka yüzeyi üzerinde bir kirlenme için onu tavlanmıştır. Bir kağıt VVilhelmy plâka kullanıldığında, ara yüzeyde aspirasyon aşama iki kez, en azından tekrar edilmelidir. Π-A m izoterm eğrisi de hava-su ara kirlenme varlığına bağlıdır. Biz izotermlerinin eğri filmin imalatı önce bir kez daha elde edilmesi önerilir. Hidrofobik modifiye cam alt-tabaka safsızlığın meydana gelebileceğinden, alt-tabaka kontaminasyonu gidermek için taze hava ya da azot gazı ile üflenmelidir.
sürekli olarak Langmuir film transfer yüzeyleri (St-IPAAm yüzey) imal etmek için, bir polimerin hidrofobik bölümü önemlidir, çünkü Langmuir film ve hidrofobik modifiye cam i arasında hidrofobik etkileşim Reaksiyonun itici gücü s. Blok kopolimer yüksek hidrofob bir polistiren, ve oda sıcaklığında hidrofilik PIPAAm oluşmaktadır, bu çalışmada, transfer edilmiş film stabil olarak da su ve hücre kültürü koşulları altında bir yüzeye yapıştırılır edildi. Bu hidrofobik bölümler sağlam St-IPAAm yüzey imal edilmesinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir.
olan, ısıya duyarlı bir yüzeye, hücre yapışmasını ve ayrılmasını kontrol etmek için, molekül yapısı ve yoğunluğu çok hassas biçimde kontrol açısından önemlidir. Bu Langmuir-Schaefer yöntemde, bırakılan moleküller belirli bir miktar ve bir hava-su ara hedef alan ile sentezlenen polimer molekülü başına alanı (A m) sıkıştırma ile kontrol edilebilir. St-IPAAm molekülleri bırakarak A m teorisi aşağıdaki denklemle hesaplanabilir:
d / 53465 / 53465eq1.jpg "/>
burada A arayüzü, Mw alanıdır St-IPAAms moleküler ağırlığı, Cı kloroform çözeltisinin konsantrasyonu, NA Avogadro sayıdır ve V Polimer çözeltisinin hacmi bırakılır. Amfifilik polimerler, bir hava-su arayüzünde kendi kendine organize yapılar oluşturmak için önceki çalışmalarda 13-17 açıklandığı gibi nano ölçekli deniz ada yapıları, imalattan sonra St-IPAAm yüzeylerde gözlenmektedir. Nano ölçekli yapıları boyutu ve miktarı, m St-IPAAms molekül ağırlığı ile kontrol edilmiştir.
Hücre yapışması ve ayrılma 19-27 kaplama elektron ışını ışınlama, yüzey tarafından başlatılan RAFT polimerizasyon ve bir dönüş dahil olmak üzere çeşitli yöntemler ile imal PIPAAm kaplı yüzeylerde değerlendirilmiştir. Çünkü yoğunluk, molekül ağırlığı ve PIPAAm yapısı cel etkileyenl yapışma ve dekolmanı, PIPAAm kaplı yüzey imalatı için kesin teknikler önemlidir. Yukarıda tarif edildiği gibi, bu Langmuir-Schaefer yöntemde, yoğunluk, molekül ağırlığı ve yüzey nano kontrol edilebilir. St-IPAAm yüzeylerde hücre yapışması ve dekolmanı ölçüde çeşitli bir m ve St-IPAAm moleküler kompozisyonu etkilenen ve St-IPAAm bazı koşulları daha optimize edilebilir hücre yapışması ve dekolmanı yüzeyleri bulundu. Bu sonuçlar, bu yöntem, St-IPAAm yüzeyi ve hücreler arasındaki etkileşimi kontrol edilebileceğini gösterir.
tekrarlanabilir sağlam hücre tabakasını geri kazanılması için, bir amfifilik polimerin tasarımı çok önemlidir. Sadece hidrofilik polimerler bir Langmuir-Schaefer yöntemi ile bir yüzey üzerinde imal edildiğinde, kaplanmış polimerler kolayca damıtılmış su veya kültür ortamı ile yıkanır. Bu sonuç, zayıf hidrofobik polimer yeniden üretilebilir, bu Meth hücre tabakasını geri kazanılması için kullanılmamalıdır göstermiştirod polimer modifiye yüzey su durumda kararsız çünkü. Bizim bir yöntemde, bir amfifilik polimerin hidrofilik kademeli bir sulu çözeltisi ile yıkanmasından olmayan bir yüzey üzerine sağlam bir imalat sağlar. Langmuir filmi paralel bu çalışmada, bir cam alt-tabaka aktarıldı İlave olarak, nano ölçekli deniz ada yapılar yüzeyinde gözlenmiştir. Bazal tarafında Langmuir filmin yapısı iyi apikal tarafınkinden farklı olduğu bilinse de, yapı paralel bir aktarım ile tespit edildi.
Hücre tedavisi ve rejeneratif tıp, diğer tedavilere yanıt vermeyen hastalar şifa olasılığı üzerine yoğunlaşmıştır. Laboratuvarımız doku mühendisliğinde potansiyel uygulamalar ile sıcaklık-duyarlı kültür yüzeyinde fabrikasyon hücre sac mühendisliği kullanılarak özgün, benzersiz iskele-serbest doku mühendisliği yaklaşımı geliştirmiştir. hücre tabakaları ile çok sayıda klinik çalışmalar are alreadevam dy ve dokuların 29-31 çeşitli türlerde başarılı sonuçlar ortaya koymuştur. BAECs kök hücreleri dahil olmak üzere hücre tabakaları, diğer hücre kaynaklarına, imal etmek için, hücre kaynağı olarak kullanılmıştır, ancak A m kombinasyonlarını St-IPAAm moleküllerinin moleküler yapısı optimize ederek St-IPAAm yüzeyi yaprak imal etmek için de kullanılabilir. Bu geleneksel olmayan teknoloji nano yapılı yüzeylerinin kolay üretimi için değil, rejeneratif tıpta kullanım için temel bir hücre kültürü stratejilerine sadece katkıda bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
- Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
- Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
- Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
- Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
- Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
- Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
- Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
- Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
- Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
- Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
- Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
- Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
- Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
- Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
- Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
- Yamato, M., Okano, T.
- Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
- Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
- Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
- Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
- Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
- Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
- Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
- Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
- Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
- Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).
