Introduction
Nanostrukturerede overflader har for nylig tiltrukket betydelig opmærksomhed på grund af deres forskellige anvendelsesmuligheder, herunder mønster, cellekultur, rengøring, og overflade skift. For eksempel superhydrophobic overflader inspireret af nanostruktur af lotus blade og andre responsive overflader er i stand til at reagere på ydre stimuli 1-4.
Langmuir film er en af de mest undersøgte polymerovertræk. En Langmuir film dannes ved at dryppe amfifile molekyler på en luft-vand grænsefladen 5-8. Filmen kan derefter overføres på en fast overflade ved fysisk eller kemisk adsorption, og den molekylære konformation på en fast overflade kan styres ved hjælp vertikale og horisontale overførselsmetoder 9-12. Densiteten af Langmuir film kan styres nøjagtigt ved at komprimere luft-vand-grænsefladen. For nylig er denne metode også vist sig effektiv til fremstilling nanoskalerede sea-island struktues ved at udnytte amfifile blokcopolymerer. Nanostrukturer antages at bestå af en kerne af hydrofobe segmenter og en skal af hydrofile segmenter 13-17. Desuden er antallet af nanostrukturer på en overflade reguleres ved at styre det areal pr molekyle (A m) af blokcopolymeren ved grænsefladen.
Vi har fokuseret på en original, unik stillads-fri vævsmanipulering tilgang, cellelaget teknik, ved anvendelse af en temperaturfølsom kultur overflade. Den udviklede teknologi er blevet anvendt på regenerative behandlinger for forskellige organer 18. En temperatur-responsive kultur overflade blev fremstillet ved podning af poly (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), en temperaturfølsom molekyle, på en overflade 19-27. PIPAAm og dets copolymerer udviser en lavere kritisk opløsningstemperatur (LCST) i vandige medier ved temperaturer nær 32 ° C. Kulturen overflade udviste også en temperaturfølsom alternati på mellem hydrofobicitet og hydrofilicitet. Ved 37 ° C, den PIPAAm-transplanterede overflade blev hydrofob, og cellerne let fastgøres og prolifererede på overfladen såvel som på konventionel vævskulturpolystyren. Når temperaturen blev sænket til 20 ° C, overfladen blev hydrofil, og cellerne spontant løsrevet fra overfladen. Derfor kunne dyrkede sammenflydende celler på overfladen høstes som et intakt ark ved at ændre temperaturen. Disse celleadhæsion og udstationeringsprocedurer egenskaber blev også vist ved en overflade fremstillet ved Langmuir filmcoating til laboratorie- demonstration 26, 27. En Langmuir film af blokcopolymerer bestående af polystyren (P (St)) og PIPAAm (St-IPAAm) blev fremstillet. Langmuir film med en specifik A m kunne horisontalt overført til en hydrofobisk modificeret glassubstrat. Desuden blev celleadhæsion på og adskillelse fra den forberedte overflade i afhængighed af temperatur evalueres.
_content "> Her beskriver vi protokoller til fremstilling af en nanostrukturerede Langmuir film bestående af termo-responsive amfifile blokcopolymerer på et glas substrat. Vores metode kan give en effektiv fabrikation teknik til økologiske nanofilms i forskellige områder af overfladen videnskab og kan lette mere effektiv kontrol af celleadhæsion på og spontan frigørelse fra en overflade.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af Polystyrene- blok-poly (N -isopropylacrylamide) ved To trin Vendbar Addition-fragmentering Chain Transfer (FLÅDE) Radikal polymerisation
- Opløs styren (153,6 mmol), 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic acid (ECT; 0,2 mmol) og 4,4'-azobis (4-cyanovalerianesyre) (ACVA; 0,04 mmol) i 40 ml 1, 4-dioxan. Frys opløsningen i flydende nitrogen under vakuum i 15-20 minutter til fjernelse af de reaktive species og gradvist tø op ved stuetemperatur. Sørg for, at løsningen er helt optøet og gentage denne fryse-pumpe-tø afgasning cyklus tre gange.
- Finde et polystyren (PSt) (Mw: 13.500) som en makro RAFT middel ved polymerisation ved 70 ° C i 15 timer i et oliebad.
- Bundfald PSt makro FLÅDE agent med 800 ml ether og tør under vakuum.
- Opløs IPAAm monomer (4,32 mmol), PSt makro RAFT middel (0,022 mmol), og ACVA (0,004 mmol) i 4 ml 1,4-dioxan.
- Fjerneoxygenet i opløsningen af fryse-pumpe-tø afgasningscykler som nævnt i trin 1.1.
- Udfør en polymerisation ved 70 ° C i 15 timer i et oliebad efter afgasning. Opnå syntetiseret St-IPAAm molekyle (Mw: 32.800) på samme måde som PST makro FLÅDE agent.
2. Udarbejdelse af Silanized Hydrofobisk modificerede Glas Substrater
- Vask glassubstrater (24 mm x 50 mm) med et overskud af acetone og ethanol og soniker i 5 minutter til fjernelse af overfladeforureninger.
- Tør substrater i en ovn ved 65 ° C i 30 minutter. Så brug oxygenplasma (400 W, 3 min) for at aktivere overfladerne af substraterne ved stuetemperatur.
- Fordybe substraterne i toluen indeholdende 1% hexyltrimethoxysilane natten over ved stuetemperatur til silanize substratet.
- Vask de silaniserede substrater i toluen og fordybe i acetone i 30 min til fjernelse af uomsatte midler.
- Annealing substrater i 2 timer ved 110 ° C for grundigt at immobilisere sverflade.
- Skær silaniserede substrater ved et glas cutter til 25 mm x 24 mm til at passe til cellekultur retter (parabol størrelse: φ35 mm).
3. Udarbejdelse af Langmuir Film og Film-overførte Surface
- Placer Langmuir film instrument i et skab for at forhindre ophobning af støv.
- Vask Langmuir truget (størrelse: 580 mm x 145 mm) og barrierer med destilleret vand og ethanol for at fjerne urenheder.
- Tør truget og barrierer ved at tørre med en fnugfri håndklæde. Derefter fylde truget med ca. 110 ml destilleret vand, og sæt de barrierer på begge sider af truget. Bemærk, at der skal tilføjes destilleret vand uden at spilde i de følgende trin 3,5-3,13.
- Varm en platin Wilhelmy plade (perimeter: 39,24 mm) til overvågning af overfladespændingen med en gasbrænder, indtil pladen bliver rød og derefter vaske med destilleret vand for at fjerne urenheder. Suspendere Wilhelmy plade på en ledning fæstnet tiloverfladen-tryk-måling instrument.
- Nul overfladen-tryk-måling instrument ifølge producentens protokol. Komprimere luft-vand-grænsefladen på truget af hindringer på begge sider af truget, indtil grænsefladen når ca. 50 cm2 uden nogen dråber polymer.
- Aspirer små kontaminanter indtil overfladen trykket er næsten 0 mN / m.
- Flyt de barrierer på begge sider, og tilsæt destilleret vand for at kompensere for faldet i destilleret vand fra trin 3.6.
- Opløs 5 mg af den syntetiserede St-IPAAm molekyle i 5 ml af en udvikling opløsning af chloroform.
Bemærk: dichlormethan eller toluen, kan også anvendes som opløsningsmidlet. - Forsigtigt drop 27 ul St-IPAAm opløst i chloroform på truget ved hjælp af en mikrosprøjte eller mikropipette.
- Efter at have ventet i 5 min for at tillade fuldstændig fordampning af chloroform, bevæge begge barrierer vandret for at komprimere St-IPAAm molecule ved grænsefladen. Bevar komprimering af barriererne på 0,5 mm / sek indtil målområdet på 50 cm 2 er nået.
Bemærk: En hurtig kompression sats forårsager fejl i Langmuir filmen. - Mål overfladetrykket (π) -A m isotermer med platin Wilhelmy plade fastgjort til overfladen-tryk-måling instrument under kompression ifølge producentens protokol.
- Efter at have nået målområdet størrelse, vedligeholde overfladen i 5 min at lade St-IPAAm molekyler til at slappe af; molekylerne ikke nå ligevægt umiddelbart efter komprimering.
- Overfør Langmuir film til en hydrofobisk modificeret glassubstrat under anvendelse af en overførsel apparat til 5 min til robust adsorbere filmen. Fastgør den hydrofobe glas substrat parallelt på enheden. Slut enheden til en tilpasning scenen og bevæge sig vinkelret.
- Løft substratet vandret med overførsel apparat og tør i 1 dag i en desiccator.
4. dyrkning af celler og Optimering Cell Adhæsion og Detachment på Langmuir Film Overført Surface
- Til fremstilling cellesuspensioner, kultur bovin carotid arterie endotelceller (BAECs) til en tredjedel konfluens ved 37 ° C i 5% CO2 og 95% luft på vævskulturpolystyren (TCPS) med Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin.
- Efter konfluens er nået, behandle BAECs med 3 ml 0,25% trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 ° C i 5% CO2 og 95% luft.
- Deaktivere trypsin-EDTA ved tilsætning af 10 ml af DMEM indeholdende 10% FBS, og indsamle cellesuspensionen til en 50 ml konisk rør.
- Centrifuger ved 120 xg i 5 min, og aspireres supernatanten. Resuspender cellerne med 10 ml af DMEM.
- Placer St-IPAAm overflader under ultraviolet lys på en ren bænk til sterilisering i 5 min.
- Seed den genvundne ceLLS på ST-IPAAm overflader ved en koncentration på 1,0 x 10 4 celler / cm2 tælles af en engangs hæmocytometer og observere cellerne på overfladerne af et mikroskop udstyret med en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 95% luft.
Bemærk: Sterilisere St-IPAAm overflader ved ultraviolet lys udstyret til en ren bænk. - Optag time-lapse billeder af vedhængende BAECs til ca. 24,5 timer ved 37 ° C ved en fasekontrastmikroskop med 10X forstørrelse. Efter BAEC vedhæftning, rekord løsrivelse af BAECs fra St-IPAAm overflade ved 20 ° C i ca. 3,5 time.
5. Cell Sheet Fabrication på Langmuir Film-overførte Overflader
- Kultur BAECs anvendes på samme måde som beskrevet i afsnit 4.
- Seed i alt 1,0 x 10 5 celler / cm2 på St-IPAAm overflader og inkuberes i 3 dage ved 37 ° C i 5% CO2. Konfluente BAECs spontant løsrevet ved 20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blokcopolymerer sammensat af polystyren og poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) med specifikke molekylvægte blev syntetiseret ved RAFT radikalpolymerisation. ECT blev fremstillet som et kædeoverførselsmiddel som beskrevet i Moad et al. 28. To St-IPAAm molekyler af forskellige PIPAAm kædelængder blev syntetiseret, og de opnåede blok-polymerer blev karakteriseret ved 1H kernemagnetisk resonans (NMR) og gelpermeationschromatografi (GPC). Molekylvægtene af St-IPAAms var 32.800 og 67.900, med en snæver molekylvægtsfordeling (1,31 og 1,50). Monomeren konverteringer af polystyren makro RAFT middel og PIPAAm fandtes at være 17,4% og mere end 85,0%. Den syntetiserede St-IPAAms blev navngivet St-IPAAm170 og St-IPAAm480 hhv.
Langmuir film med forskellige områder per molekyle (A M) blev fremstillet ved enluft-vand-grænsefladen ved at droppe St-IPAAm molekyler opløst i chloroform-opløsning (figur 1A). Efter slippe St-IPAAm molekyler, blev overfladen trykket af luften-vand-grænsefladen fastsat til 0 mN / m og øget kontinuerligt ved at lukke grænsefladen under komprimering med barrierer (figur 1b). Eventuelle fejl i Langmuir-film dannet på en luft-vand-grænsefladen kunne udledes af π-A m isoterm. Den forberedt St-IPAAm Langmuir filmen blev overført til en hydrofobisk modificeret glas substrat (St-IPAAm overflade) (figur 1C). Filmen-overførte overflade blev vurderet ved atomic force mikroskopi (AFM). Figur 2 viser AFM topografiske billeder (1 x 1 um) af ST-IPAAm170 og St-IPAAm480 overflader. Nanostrukturer blev observeret på St-IPAAm overflader, mens sådanne strukturer blev kun sjældent observeret på den nøgne hydrofobe substrat. Størrelsen og formen af nanostrukturer var stærkt dependent på en m og sammensætningen af St-IPAAm. AFM topografiske billeder bekræftede, at Langmuir-film kunne homogent overføres til det hydrofobe modificerede glassubstrat og at overflademorfologier kan kontrolleres ved den molekylære sammensætning og A m.
Stabiliteten af St-IPAAm Langmuir film blev evalueret af en svækket total refleksion Fourier-transform infrarød spektroskop (ATR / FT-IR). Mængden af PIPAAms på den hydrofobe glassubstrat kunne estimeres ved en kalibrering linje opnået fra topintensitet forhold på 1.000 cm-1 afledt af glas (Si-O) og 1650 cm-1 stammer fra PIPAAm (C = O). Kalibreringen linje blev beregnet ud fra en række kendte mængder PIPAAm slåes den hydrofobe glas. Mængderne af PIPAAm St-IPAAm170 (10 nm 2 / molekyle) og St-IPAAm480 (40 nm 2 / molekyle) på substratet blev fundet at være 0,87 mg/ cm2 og 0,63 pg / cm2 hhv. Mængden af PIPAAm på overfladen efter vask med destilleret vand var næsten de samme som dem på overfladerne uden vask. Disse resultater viste, at de fabrikerede St-IPAAm overflader var stabile i en vand tilstand.
Vi næste undersøgte vedhæftning og udstationering af bovin carotis arterie endotelceller (BAECs) på St-IPAAm overflader. Time-lapse fotografering af vedhængende og aftagning BAECs på St-IPAAm480 overflade ved 40 nm 2 / molekyle vises i animerede figur 1. Adhærerende BAECs ved 37 ° C blev hurtigt løsrevet fra både St-IPAAm170 og St-IPAAm480 efter faldende temperaturen holdes på 20 ° C. Antallet af adhærente celler på St-IPAAm170 og St-IPAAm480 ved 37 ° C var 0,6 x 10 4 celler / cm2 og 0,9 x 10 4 celler / cm2, hvilket viser, at antallet af adhærente celles blev moduleret af sammensætningen af St-IPAAm overflade. Cell ark kunne også genvindes ved at tage sammenflydende dyrkede BAECs fra disse St-IPAAm overflader. Det udvundne cellelaget blev visualiseret som en todimensional cellestruktur (figur 3). Cellerne nåede sammenflydning efter tre dage i kultur på St-IPAAm170 og St-IPAAm480 overflader ved 37 ° C, og cellelaget blev hurtigt udvundet efter reduktion af temperaturen fra 37 ° C til 20 ° C. Effekten af molekylvægt og A m for St-IPAAms på cellelaget opsving er opsummeret i tabel 1. Levedygtighed cellelag blev evalueret ved trypanblåt-farvning uden tilknyttet BAECs ark. Celler behandlet med trypsin-EDTA på glassubstratet ved 37 ºC, blev anvendt som kontrol. Dead-forhold på St-IPAAm170, St-IPAAm480 og den hydrofobe glassubstrat som en kontrol blev beregnet til at være ca. 11,0%, 7,7% og 11,7%, henholdsvis. Disse resultater indikerede, at cell levedygtighed blev næsten ikke påvirkes af reduktion temperatur.
Figur 1:. Fremstilling af en termoresponsiv Langmuir film-overført overflade (A) polystyrene- blok-poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAm) chloroformopløsning blev forsigtigt dryppet på en luft-vand grænsefladen. Overfladen trykket blev målt under komprimering at opdage eventuelle fejl i Langmuir filmen. (B) to barrierer blev anvendt til at komprimere St-IPAAm molekyler på grænsefladen indtil et målområde på 50 cm2 blev nået. (C) Efter kompressionen blev en hydrofobisk modificeret dæksel glassubstrat horisontalt placeret på grænsefladen med en tilpasning stadium i 5 minutter. Substratet blev løftet vandret og tørret i 1 dag. Dette tal er blevet ændret en smule fra offentliggørelsen af Sakuma et al. 27
Figur 2:. Atomic force mikroskopi (AFM) topografiske billeder (1 x 1 um) af Langmuir film-overførte overflader (St-IPAAm overflade) Venstre panel: Nanostrukturerede overflader af St-IPAAm170 med en A m på 10 nm 2 / molekyle. Højre panel: Nanostrukturerede overflader af St-IPAAm480 med en A m på 40 nm 2 / molekyle. AFM billeder blev opnået i aflytning tilstand under anvendelse af et phosphat-doteret silicium cantilever med en fjederkonstant på 3 N / m og resonansfrekvens 70-90 kHz.
Tabel 1:. Bovin carotidarterie endotelcelle (BAEC) folie genvinding af en Langmuir film-overført overflade med forskellige tætheder og PIPAAm kædelængder "Good" betegner intakt cell ark opsving. "Næppe inddrives" betyder, at cellerne kunne være confluently dyrkes, og de dyrkede celler udviste ringe eller ingen adskillelse fra overfladen selv efter en reduktion i temperatur. "Svag adhæsion", at cellerne ikke blev dyrket til konfluens ved 37 ° C i 3 dage. 
Figur 3: Makroskopisk billede af genvundne celle ark på en Langmuir film-overførte overflade med St-IPAAm480 og en A m på 40 nm 
Animeret Figur 1: . (Højreklik for at downloade) Time-lapse billeder af BAECs vedhæftning og løsrivelse på en Langmuir film-overførte overflade med St-IPAAm480 og en Am på 40 nm 2 / molekyle. Billederne blev indsamlet ved 2-min intervaller og de indsamlede billeder blev leveret som en film på 960x hastighed. Detskala bar i filmen er 50 um. St-IPAAm170 St-IPAAm480 3 [nm2 / molekyle] 10 [nm2 / molekyle] 40 [nm2 / molekyle] 3 [nm2 / molekyle] 10 [nm2 / molekyle] 40 [nm2 / molekyle] svag vedhæftning God næppe inddrevet svag vedhæftning svag vedhæftning God
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En temperatur-responsive overflade blev fremstillet ved Langmuir-Schaefer metoden, og overfladeegenskaberne for celleadhæsion / løsgørelse og cellelaget recovery blev optimeret. Når denne metode anvendes til fremstilling af overflader, adskillige trin er kritiske. Den molekylære sammensætning af St-IPAAm molekyler har en stor effekt på overfladen struktur og stabilitet af overfladen, og i forlængelse heraf, om celleadhæsion og løsrivelse. Navnlig bør de St-IPAAm molekyler har en snæver molekylvægtsfordeling. I vores fremgangsmåde blev to St-IPAAm molekyler med varierende PIPAAm kædelængder syntetiseret ved FLÅDE polymerisation, hvilket tillader kontrol af molekylvægten og molekylvægtfordelingen.
Der bør tages skridt til at forhindre forurening af luft-vand grænseflade under forberedelsen af St-IPAAm overflade for at undgå fejl i nanostrukturer. Før den faldt polymermolekyler på grænsefladen, contaminants bør aspireres indtil overfladen trykket når ca. 0 mN / m. Kontaminering tendens til at ophobe omkring kanterne af renden og Wilhelmy plade. Fordi Wilhelmy plade havde nogle forurening på overfladen, blev det udglødet. Når der anvendes et papir Wilhelmy plade bør aspiration trin ved grænsefladen gentages mindst to gange. Den π-A m isoterm kurve afhænger også af et angreb på luft-vand-grænsefladen. Vi anbefaler, at der opnås kurven for isotermerne mere end én gang før fremstillingen af filmen. Idet forurening af den hydrofobe modificerede glassubstrat også kan forekomme, bør substratet blæses med frisk luft eller nitrogengas for at fjerne forurening.
Til konsekvent fabrikere Langmuir film-overført overflader (St-IPAAm overflade), det hydrofobe segment af en polymer er vigtig, fordi den hydrofobe vekselvirkning mellem Langmuir film og hydrofobt modificeret glas i er den drivende kraft af reaktionen. I denne undersøgelse fordi blokcopolymeren var sammensat af polystyren, som er stærkt hydrofob, og hydrofile PIPAAm ved stuetemperatur, den overførte film blev stabilt klæbet til substratet selv under vand eller celledyrkningsbetingelser. Dette indikerer, at hydrofobe segmenter spiller en vigtig rolle i fremstilling af en robust St-IPAAm overflade.
For at styre celleadhæsion og løsrivelse på en temperaturfølsom overflade, både den molekylære sammensætning og den præcise styring af tætheden er vigtige. I denne Langmuir-Schaefer fremgangsmåde kan det areal pr molekyle (A m) af polymer syntetiseret ved en given mængde faldt molekyler og målområdet af en luft-vand-grænsefladen styres ved kompression. A m for at droppe St-IPAAm molekyler kan i teorien beregnes ved følgende ligning:
d / 53.465 / 53465eq1.jpg "/>
hvor A er arealet af grænsefladen, Mw er molekylvægten af St-IPAAms, c er koncentrationen af chloroformopløsningen, N A er Avogadros tal, og V er rumfanget af polymeropløsningen droppet. Nanoskala hav-ø strukturer er observeret på St-IPAAm overflader efter fremstilling, fordi amfifile polymerer danner selvorganiserende strukturer på en luft-vand-grænseflade, som beskrevet i tidligere undersøgelser 13-17. Størrelsen og mængden af nanoskala strukturer blev kontrolleret af en m og molekylvægten af St-IPAAms.
Celleadhæsion og frigørelse blev vurderet på PIPAAm-coatede overflader fremstillet ved forskellige fremgangsmåder, herunder elektronbestråling, overflade-initieret RAFT polymerisation og spincoating 19-27. Fordi densitet, molekylvægt og PIPAAm struktur påvirker cell vedhæftning og detachement, præcise teknikker til fabrikere PIPAAm-overflade er vigtige. I denne Langmuir-Schaefer metode, kunne densitet, molekylvægt og overflade nanostrukturer styres som beskrevet ovenfor. Cell vedhæftning og detachement på St-IPAAm overflader drastisk påvirket af diverse En m og St-IPAAm molekylære sammensætning, og nogle betingelser for St-IPAAm overflader for celle vedhæftning og løsrivelse kunne optimeres yderligere. Disse resultater indikerer, at denne metode kan styre interaktionen mellem St-IPAAm overflade og celler.
For reproducerbart udvinding intakt celle ark, udformningen af en amfifil polymer er vigtigst. Når det kun hydrofile polymerer er fremstillet på en overflade af en Langmuir-Schaefer metode, overtrukne polymerer let udvaskes af destilleret vand eller dyrkningsmediet. Dette resultat indikerede, at den svage hydrofobe polymer ikke bør anvendes til reproducerbart udvinding cellelaget i denne method fordi polymeren med modificeret overflade var ustabil i en vand tilstand. I vores fremgangsmåde, den hydrofile segment i en amfifil polymer muliggør robust fabrikation på en overflade uden vask af en vandig opløsning. Eftersom Langmuir film parallelt blev overført til et glassubstrat i denne undersøgelse blev observeret i nanoskala sea-island strukturer på overfladen. Selvom strukturen af Langmuir film på den basale side er velkendt at være forskellig fra den på den apikale side, blev strukturen fastsat ved en parallel overførsel.
Celleterapi og regenerativ medicin har været fokuseret på muligheden for healing patienter, som ikke reagerer på andre behandlinger. Vores laboratorium har udviklet en original, unik stillads-fri vævsmanipulering tilgang med celle ark engineering fremstillet på en temperatur-reagerende kultur overflade med potentielle anvendelser i tissue engineering. Flere kliniske forsøg med celle ark er already gang og har demonstreret vellykkede resultater for flere typer af væv 29-31. Selvom BAECs blev anvendt som cellekilde at fremstille cellelag, andre cellekilder, herunder stamceller, kan anvendes til at fremstille ark på en St-IPAAm overflade ved at optimere kombinationerne af A m og den molekylære sammensætning af St-IPAAm molekyler. Denne ikke-konventionel teknologi vil bidrage ikke kun til den nemme fremstilling af nanostrukturerede overflader, men også til de grundlæggende cellekultur strategier til anvendelse i regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
- Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
- Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
- Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
- Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
- Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
- Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
- Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
- Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
- Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
- Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
- Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
- Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
- Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
- Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
- Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
- Yamato, M., Okano, T.
- Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
- Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
- Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
- Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
- Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
- Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
- Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
- Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
- Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
- Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).
