Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבנות ספקטרומטר רילואן מהיר. מדורג מערך שלב כמעט צילם etalons (VIPA) להשיג מהירות מדידה יותר מ -1,000 פעמים מהר יותר מאשר ספקטרומטרים פברי פרו- סריקה מסורתית. שיפור זה מספק את האמצעים לניתוח רילואן של רקמה וביו-חומרים בכוח הרמות נמוכות in vivo.
Abstract
המטרה של פרוטוקול זה היא לבנות גבוה הכחדה מקבילה וספקטרומטר רילואן האופטי ברזולוציה גבוהה. ספקטרוסקופיה רילואן היא שיטת מדידה ללא מגע, שניתן להשתמש כדי להשיג קריאות ישירות של תכונות חומר viscoelastic. זה כבר כלי שימושי באפיון חומר, ניטור מבני וחישה סביבתית. בעבר, ספקטרוסקופיה רילואן יש בדרך כלל מועסק etalons פברי פרו- סריקה לבצע ניתוח ספקטרלי. תהליך זה דורש כוח הארה גבוה ופעמים רכישה ארוכות, מה שהופך את הטכניקה מתאימה ליישומים ביו-רפואיים. ספקטרומטר רומן הציג לאחרונה מתגבר על האתגר הזה על ידי השימוש בשתי VIPAs בתצורת ציר נגדית. חידוש זה מאפשר ניתוח תת-ג'יגה-הרץ (GHz) רזולוציה רפאים עם זמן תת-שני רכישה וכוח ההארה בגבולות הבטיחות של רקמה ביולוגית. היישומים החדשים הרבים בהנחייתם של שיפור זה הם מ"קrrently נבדקת במחקר ביולוגי ויישום קליני.
Introduction
פיזור רילואן, שתואר לראשונה על ידי לאון ברילואן 1 בשינה 1922, הוא הפיזור קשיח של אור מהמצבים התרמיים ואקוסטי ובמוצק מתנודות צפיפות תרמית בנוזל או גז. משמרת הרפאים של האור המפוזר, בדרך כלל בGHz טווח משנה, מספקת מידע על האינטראקציה בין אור האירוע ופונונים אקוסטי במדגם. כתוצאה מכך, היא יכולה לספק מידע שימושי בנוגע למאפייני viscoelastic של החומר נבדק.
בגרסה הספונטנית שלה, פיזור רילואן בדרך כלל יש חתכים בצו של פיזור ראמאן, וכתוצאה מכך אות חלשה מאוד. בנוסף, משמרות תדירות רילואן הם סדרי גודל קטן יותר ממשמרות ראמאן. כתוצאה מכך, elastically פזורים אור (מריילי או פיזור מ.י.), אור תועה, ולגבות-השתקפויות של המדגם כל בקלות יכולה להאפיל החתימה הספקטרלית רילואן. לָכֵן, ספקטרומטר רילואן צריך להשיג תת-GHz לא רק רזולוציה רפאים אלא גם ניגוד רפאים גבוה או הכחדה.
בספקטרומטרים רילואן מסורתיים דרישות אלה פגשו monochromators הצורם לסריקת, שיטות מכות אופטיות, והכי עממי, התאבכות סריקה מרובה עובר פברי פרו- 2. שיטות אלה למדוד כל רכיב ברצף רפאים. גישה זו מובילה לפעמי רכישה לספקטרום רילואן בודד נע בין כמה דקות לכמה שעות, תלוי במכשיר ועל המדגם. ספקטרומטר VIPA שני השלבים, שנבנה תוך שימוש בפרוטוקול זה, יש את היכולת לאסוף את כל מרכיבי רפאים בתוך פחות משנייה, תוך מתן הכחדה מספיק (> 60 dB) לדכא ביעילות אותות מזויפים אחרים 2.
השילוב של etalons VIPA הוא המרכיב המרכזי בספקטרומטר זה. VIPA הוא Etalon מוצק עם שלושה ג שונהמרחף אזורים: במשטח הקדמי, רצועת ציפוי נגד השתקפות צרה מאפשרת לאור להיכנס לVIPA, בעוד ששאר פני השטח כוללת ציפוי מהורהר מאוד (HR); במשטח האחורי, ציפוי רעיוני באופן חלקי מאפשר חלק קטן (~ 5%) של האור להיות משודר. כאשר התמקד על הכניסה הצרה של VIPA מעט המוטה, קרן האור מקבלת ביטוי בתת-רכיבים עם הפרש מופע קבוע בתוך VIPA 2. התערבות בין המרכיבים תת משיגה פיזור רפאים הגבוה המיוחל. יישור שתי VIPAs ברצף בתצורת ציר נגדית מציג פיזור רפאים בכיוונים מאונך 3. פיזור הרפאים בכיוונים מאונך מרחבית מפריד פסגות רילואן מcrosstalk לא רצוי, המאפשר להרים רק את אות רילואן. איור 1 מציג סכמטי של ספקטרומטר VIPA שני שלבים. החיצים מתחת לאלמנטים האופטיים לציין את מעלותרי של חופש שבו צריכים להיות מכוונים שלבי translational.
איור 1. התקנת אינסטרומנטלי. סיבים אופטיים מספק פיזור רילואן לספקטרומטר. עדשה גלילית C1 (f = 200 מ"מ) מתמקדת האור לתוך הכניסה של VIPA הראשון (VIPA1). עדשה גלילית נוספת C2 (f = 200 מ"מ) ממפה את הפיזור הזוויתי הרפאים להפרדה מרחבית במישור המוקד של C2. במישור זה, מסכה אנכית משמשת לבחירת החלק הרצוי של הספקטרום. תצורה אנלוגית כדלקמן, נטויה בזווית של 90 מעלות. הקרן עוברת דרך S1 (f = 200 מ"מ) עדשה כדורית ולתוך חריץ הכניסה של VIPA השני (VIPA2) ממוקדת. עדשה כדורית S2 (f = 200 מ"מ) יוצרת תבנית המופרדת spectrally דו-ממדית במישור המוקד שלה, שבו עוד מסכה אופקית ממוקמת. Horמסכת izontal הוא צילם על המצלמה EMCCD באמצעות זוג עדשת אכרומטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סטודנט לתואר ראשון עם כמה קורסים אופטיקה וניסיון יישור בסיסי צריך להיות מסוגל לבנות ולהשתמש בספקטרומטר שני שלבים זה. לאחרונה ספקטרומטר הוכח להיות תואם עם מגוון רחב של בדיקות אופטיות סטנדרטיים 3,4,5 (למשל, מיקרוסקופ confocal, אנדוסקופ, מנורת סדק האופתלמוסקופ). כאן, ספקטרומטר מחובר למיקרוסקופ confocal. אור הלייזר מיושר למיקרוסקופ מערכת מחקר הפוך סטנדרטי לאחר שילוב מפצל 90:10 קורה. אור backscattering מהמדגם מצמיד לתוך סיב מצב יחיד, מה שהופך את confocal מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ניתוח ספקטרלי רילואן דורש לייזר יחיד אורך מצב (~ 10 mW במדגם). ליישור מטרות, להשתמש בחלק מאוד מוחלש של קרן לייזר זו (<0.1 mW).
1. הגדרה ראשונית של סיבים וEMCCD מצלמה (אלקטרונים כפול טעינת התקן צמוד)
- לזהות חלל יישור חופשי על 1,600 מ"מ לספקטרומטר על שולחן אופטי.
- הר המצלמה EMCCD בסוף חלל היישור החופשי.
- להשתמש בברגי קבוצה לצרף את המצלמה להודעות. הדק את ההודעות בדואר מחזיקים בשיא הציר האופטי הרצוי. הדק את פוסט הבעלים על השולחן האופטי באמצעות מהדק שולחן.
- הפעל את המצלמה EMCCD. להיות זהיר כדי למנוע הרוויה מצלמה.
- התקנת תוכנת מצלמה במעבדת מחשבים ולחבר את המצלמה למחשב.
- השבת את הרווח ולהגדיר זמן אינטגרציה נמוך (~ 0.01 שניות). התחל רכישת תמונות EMCCD. שים לב לתמונת המצלמהים על מסך המחשב.
- הר collimator הסיבים על 1,600 מ"מ מול המצלמה.
- מניחים את collimator הסיבים במתאם collimator הסיבים.
- הר המתאם על פוסט. הדק את ההודעה להודעת בעל בגובה המשוער של הציר האופטי (גובה של המצלמה). להדק הודעה בעל על שולחן אופטי באמצעות מהדק שולחן.
- ליישר את קרן התפוקה לאורך הציר האופטי.
- השתמש בבורג סט להתחבר איריס סטנדרטית לפוסט. הדק את ההודעה להודעת בעל.
- מניחים את איריס מול collimator הסיבים (<50 מ"מ). התאם את הגובה של איריס לקרן. הזז את איריס לאורך הציר האופטי הרצוי, שאמור להצביע ישירות למצלמה.
- הכנס מסנן צפיפות אופטי ישירות לאחר פלט הלייזר אם מרווית המצלמה. השתמש בברגי ההתאמה של collimator סיבי הר כדי ליישר את הקרן לאורך הציר האופטי. ברגע שזה הושג,קרן תהיה נקי לעבור איריס לאורך כל נתיב הקרן.
- הר זוג תואם אכרומטית עדשה (F = 30 מ"מ) מול המצלמה.
2. שלב אופקי של ספקטרומטר
- הר המסכה אופקית.
- להשתמש בברגי קבוצה לצרף את המסכה אופקית על פוסט. הדק את ההודעה להודעת בעל. הר פוסט בעל על במה translational, המאפשר את המסכה כדי להחליק אופקי ובמתוך נתיב הקרן. (איור 1)
- השתמש בברגים להדק את שלב translational על השולחן האופטי כך שהמסכה היא הדמיה בחדות על מצלמת CCD במרחק המוקד (f = 30 מ"מ) של זוג עדשות אכרומטי.
- הר וליישר את העדשה הכדורית S1 (f = 200 מ"מ) 600 מ"מ מול המסכה אופקית.
- להשתמש בברגי סט לעלות S1 על פוסט בעל. הדק את ההודעה להודעת בעל.
- הר שני אירוסים, כמתואר ב1.5.1. לפני placing S1 בנתיב הקרן, להכניס אחד איריס לפני ואחד אחרי איריס עמדת S1 הרצויה (600 מ"מ מול המסכה אופקית). התאם את הגובה של האירוסים כך שהקרן נקיה עוברת דרך שניהם.
- הנח S1 600 מ"מ מול המסכה אופקית (איור 1). התאם את הגובה וזווית של S1 עד שני, ההשתקפות בחזרה את העדשה ואת הקרן הקרובה-החוצה, בצורה נקיה לעבור אירוסים. הדק את פוסט בעל מחזיק S1 על השולחן האופטי באמצעות מהדק שולחן.
- VIPA2 הר במישור המוקד של העדשה הכדורית (200 מ"מ מול S1).
- הר בעל VIPA על הודעה באמצעות הברגים המסופקים עם בעל. הדק את ההודעה להודעת בעל. הדק את פוסט בעל על במה תרגום אופקית. (איור 1)
- מניחים בזהירות בVIPA2 בעל VIPA עם חריץ הכניסה בכיוון אנכי. (איור 1)
- פיין-להתאים o העמדהו VIPA הר להיות בדיוק במישור המוקד של S1. (בדוק על ידי התחקות המותניים קרן עם כרטיס לבן.)
- השתמש בברגים להדק את שלב translational על VIPA2 השולחן והשקופיות האופטי מהקרן באמצעות מידת חופש של שלב translational.
- הר וליישר את העדשה הכדורית S2 (f = 200 מ"מ) 200 מ"מ אחרי VIPA ו -200 מ"מ מול המסכה אופקית. בצע את הנוהל מתואר ב2.2.1-2.2.3. במקום לצרף את ההודעה בעל על השולחן האופטי, להעלות אותו על במה translational עם דרגת החופש בכיוון לאורך הציר האופטי שלה. (איור 1) השתמש בברגים להדק את שלב translational על השולחן האופטי.
- השתמש בשלב האופקי translational (2.3.4) כדי להחליק את כניסת VIPA2 לנתיב הקרן. שים לב קווים אנכיים על תמונת המצלמה.
- פיין-להתאים S2 באמצעות שלב translational רכוב ב2.4 עד הקווים האנכיים על תמונת המצלמה מופיעיםחַד.
- התאם את הספקטרום עם התואר אופקי-הטיה של חופש על בעל VIPA ושלב translational. השתמש בתואר האופקי-התרגום של חופש כדי לכוון את מיקום הכניסה של הקרן לEtalon. השתמש בתואר אופקי-ההטיה של חופש כדי לכוון את זווית הכניסה של הקרן לEtalon.
- למדוד עידון ותפוקה.
- קח תמונה על ידי לחיצה על F5 או לחלופין על ידי לחיצה על "התקנת רכישה" בפינה השמאלית העליונה והבחירה באפשרות "לקחת תמונה" בתוכנת המצלמה.
- לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולבחור באפשרות "עלילת קו". גרור את הסמן אופקי על פני התמונה כדי ליצור עלילת קו. שחרר את הסמן כדי לבחון את עלילת קו שנוצרה.
- השתמש בעלילת הקו כדי למדוד את העידון. מחלקים את המרחק בין שתי פסגות ברוחב המלא שלהם במחצית המרבית (FWHM). לשאוף> 30.
- לקבוע את התפוקה על ידי measurinז הכח עם מד כוח מייד לפני ואחרי VIPA2. לשאוף> 50%.
- מנגינת זווית הקלט של הקרן לEtalon עם דרגת חופש על בעל VIPA (2.6) ולבחון את התחלופה בין העידון ותפוקה.
- אם עידון ותפוקה אינו משביע רצון לחזור ועדין להתאים את היישור. VIPA2 בטוח לעשות הוא במישור המוקד של S1. חזור על שלבים 2.3.3 -2.7.
3. אנכי שלב של ספקטרומטר
- חלק את VIPA (VIPA2), מיושר בחלק 2, מהקרן באמצעות שלב translational (2.3.4). השלב האופקי של ספקטרומטר עכשיו יתנהג כמו 1: מערכת הדמיה 1.
- הר המסכה האנכית.
- להשתמש בברגי קבוצה לצרף את המסכה האנכית על פוסט. להדק הודעה למתאם הודעה מהדק זווית נכונה. להדק הודעה שנייה למתאם הזווית הנכון והכניס אותו לתוך הודעה בעל. הר פוסט בעל על במה, allowi translational אנכיng המסכה להחליק אנכי ובמתוך נתיב הקרן. (איור 1)
- ברגים שימוש להדק את שלב translational האנכי על השולחן האופטי כך שהמסכה האנכית צילמה בחדות על המצלמה EMCCD 200 מ"מ מול S1.
- הר וליישר את העדשה הגלילית C1 (f = 200 מ"מ) 600 מ"מ מול המסכה האנכית.
- לדפוק את בעל עדשה הגלילי על הודעה. הדק את ההודעה להודעת בעל. בזהירות במקום C1 לבעל העדשה ולהדק את הברגים כדי לתקן את זה במקום.
- הר שני אירוסים, כמתואר ב1.5.1. לפני הצבת C1 בנתיב הקרן, להכניס אחד איריס לפני ואחד אחרי איריס עמדת S1 הרצויה (600 מ"מ מול המסכה האנכית). התאם את הגובה של האירוסים כך שהקרן נקיה עוברת דרך שניהם.
- מקום C1 600 מ"מ מול המסכה האנכית (איור 1). להתאים את הגובה, הטיה, ועמדה לרוחב של C1 עד בזהירותשני, ההשתקפות בחזרה את העדשה ואת הקרן הקרובה-החוצה, מרוכזת על האירוסים. הדק את C1 החזקת פוסט בעל על השולחן האופטי באמצעות מהדק שולחן.
- ההר VIPA1 במישור המוקד של העדשה הגלילית (200 מ"מ מול C1).
- הר בעל VIPA על הודעה באמצעות הבורג המסופק עם בעל. הדק את ההודעה להודעת בעל. הדק את פוסט בעל על במה תרגום אנכית. (איור 1)
- מניחים בזהירות לתוך VIPA1 בעל VIPA עם חריץ כניסת אוריינטציה אופקית. (איור 1)
- פיין-להתאים את המיקום של VIPA הר למקום VIPA1 בדיוק במישור המוקד של C1. (בדוק על ידי התחקות המותניים קרן עם כרטיס לבן.)
- ברגים שימוש להדק את שלב translational האנכי על השולחן האופטי והחליקו VIPA1 מתוך הקרן באמצעות מידת חופש של שלב translational.
- הר וליישרעדשה גלילית C2 (f = 200 מ"מ) 200 מ"מ אחרי VIPA1 ו -200 מ"מ מול המסכה האנכית, בעקבות ההליך המתואר ב3.3.1-3.3.3. במקום לצרף את ההודעה בעל על השולחן האופטי, להעלות אותו על במה translational עם דרגת החופש בכיוון לאורך הציר האופטי שלה. (איור 1) השתמש בברגים להדק את שלב translational על השולחן האופטי.
- השתמש בשלב התרגום (3.4.4) כדי להחליק את כניסת VIPA1 לנתיב הקרן. שים לב קווים אופקיים בתמונת המצלמה.
- פיין-להתאים C2 באמצעות שלב translational רכוב ב3.5 עד הקווים אופקיים בתמונת המצלמה מופיעים חדים.
- התאם את הספקטרום עם התואר אנכי-הטיה של חופש על בעל VIPA ושלב translational. השתמש בתואר האנכי-התרגום של חופש כדי לכוון את מיקום הכניסה של הקרן לEtalon. השתמש בתואר אנכי-ההטיה של חופש כדי לכוון את זווית הכניסה של הקרן לetalעַל.
- למדוד עידון ותפוקה.
- בצע את השלבים 2.7.1 -2.7.2 כדי ליצור עלילת קו אנכי על פני תמונה של מסך המצלמה.
- השתמש בעלילת הקו כדי למדוד את העידון על ידי חלוקת המרחק בין שני קווים אופקיים ברוחב המלא שלהם במחצית המרבית (FWHM). לשאוף> 40.
- מדוד את התפוקה על ידי מדידת הכח עם מד כוח מייד לפני ואחרי VIPA1. לשאוף> 30%.
- מנגינת זווית הקלט האנכית של הקרן לEtalon עם התואר אנכי-ההטיה של חופש על בעל VIPA (3.7). שים לב לתחלופה בין העידון ותפוקה.
- אם עידון ותפוקה אינו משביע רצון לחזור ועדין להתאים את היישור. VIPA1 בטוח לעשות הוא במישור המוקד של C1. חזור על שלב 3.4.3-3.8.
4. שילוב של שני שלבים ויישור סופי
- להחליק בVIPA2. שים לב נקודות במרווחים אופקי ואנכי. נקודות אלהמחדש את החתימה הספקטרלית של לייזר תדר אחד. התאם את שלבי translational של VIPAs עד הנקודות הן בפוקוס חד.
- למדוד עידון ותפוקה של ספקטרומטר.
- בצע את הפעולות 2.7.1.-2.7.2 כדי ליצור עלילת קו האלכסון שתי נקודות הלייזר.
- השתמש בעלילת הקו למדוד עידון על ידי חלוקת המרחק האלכסוני בין שתי נקודות על ידי הרוחב המלא שלהם במחצית המרבית (FWHM). לשאוף> 30.
- לבנות קופסא שחורה לצרף ספקטרומטר.
- השתמש במסילות בנייה לבניית שלד התיבה, שאמורה להקיף את כל ספקטרומטר מcollimator הסיבים למצלמת CCD (63 בx 9 בx 15 ב).
- לכסות את שלד התיבה עם Blackout בד ואת הקלטת אותו בחוזקה בפינות. ודא שהמסכות וVIPAs נגישות בקלות.
- חבר את הסיבים לבדיקה אופטית סטנדרטית, כגון מיקרוסקופ confocal החזרה 4. p האופטי הסטנדרטיגלימות משמשות לאיסוף אור אחורי פזורים-תשא אות רילואן.
5. מדידת Shift רילואן
- מסכות לסגור שני אנכיות ואופקיים עד חתימת הלייזר נעלמה. הזז את שלבי התרגום בהתאם.
- אפשר הרווח ולהגדיל את זמן האינטגרציה של המצלמה ככל האפשר בלי להרוות את המצלמה EMCCD.
- שים לב לשינוי ברילואן של מדגם.
- הנח מדגם במוקד מיקרוסקופ confocal (או בדיקה אופטית אחרת). הרזולוציה מרחבית תהיה תלויה בעדשה האובייקטיבית המשמשת במיקרוסקופ confocal. השתמש בצלחת פלסטיק או קובט לנוזלים. השתמש במתנול למדידה הראשונה.
- כדי לייעל את תפוקת ספקטרומטר, מסכה אחת פתוחה בזמן ולסרוק באמצעות צווי ספקטרומטר ידי הטיית VIPA והתאמת שלב התרגום שלה. מצא את הסדר שבו מופיעה האות החזקה ביותר. מסכה לסגור שוב עד האות לייזר דואר נעלמה. חזור עם המסכה וVIPA (מתואר ב2.6 ו -3.7) האחרים.
- קח מדידה של המדגם.
- קח תמונה של הספקטרום הבא צעד 2.7.1.
- להשיג מדידות כיול על ידי לקיחת תמונה של הספקטרום של מים וזכוכית (או מדגם אחר עם שינוי רילואן ידוע). שמור את התמונה על ידי לחיצה על "קובץ" בפינה השמאלית העליונה והבחירה באפשרות "שמירה בשם". שמור את התמונה בפורמט ".sif" אם ניתוח הנתונים מתבצע בתוכנת המצלמה. שמור את התמונה בפורמט "טיף" אם ניתוח הנתונים מתבצע בתוכנה אחרת חישובית.
6. כיול וניתוח של ספקטרום רילואן
- לקבוע את הטווח החופשי רפאים (FSR) ופיקסל EMCCD ליחס המרת תדר אופטי (PR) בספקטרומטר רילואן.
- טען את הנתונים בתוכנת המצלמה או computa אחרתוכנת tional.
- עקוב צעד 2.7.2 כדי ליצור עלילת קו רוחב הספקטרום של תמונת כיול מים.
- התאם שתי הפסגות של הספקטרום עם קימורים הלורנצית כדי לקבוע עמדות שיא במונחים של עמדת פיקסל (P מים-S, P-המים AS). לחלופין, לקרוא את עמדות השיא ידני על ידי לקיחת נקודת הפסגות הגבוהה ביותר.
- חזור על שלב 6.1.2-6.1.3 עם הספקטרום של תמונת כיול זכוכית.
- לחלופין ל6.1.1-6.1.4, מוסיף שני מסגרות EMCCD ולהתאים את כל ארבע פסגות ובעונה אחת. (איור 2)
- לחשב את יחסי הציבור באמצעות משוואה 1. חבר את הערכים עבור P-המים וכP זכוכית כפי שנקבעה ב6.1.3 ו6.1.4. Ω זכוכית כידוע להיות 29.3 GHz. במקרה זה, שכן טווח הספקטרום החופשי הוא רק 20 GHz זה נראה יהיה כינוי עם שינוי התדר של 9.3 GHz. לשם פשטות להשתמש 9.3 GHz לΩ זכוכית-AS. השתמש 7.46 GHz לΩמים-AS.
- לחשב את FSR באמצעות משוואה 2. חבר את הערכים לP זכוכית-S, P הזכוכית-AS ויחסי הציבור, מחושב ב6.16. השתמש 9.3 GHz לΩ זכוכית-AS.
איור 2. כיול ספקטרומטר. מסגרת () המצלמה EMCCD התקבלה ממדגם כיול. כושר הלורנצית עקומה (אדום) לנתונים שנמדדו (הכחול) (ב). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- לקבוע את המשמרת של רילואןדוגמית.
- עקוב צעד 2.7.2 ליצור קו סריקה על פני הספקטרום של המדגם.
- התאם שתי הפסגות של הספקטרום עם קימורים הלורנצית כדי לקבוע עמדות שיא במונחים של עמדת פיקסל. לחלופין, לקרוא את עמדות השיא ידני על ידי לקיחת נקודת הפסגות הגבוהה ביותר.
- השתמש במשוואות הבאות 4 ו -5 והערכים מחושבים בעבר לFSR ויחסי הציבור כדי לחשב את השינוי ברילואן של המדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 3 מראה ספקטרום רילואן נציג וההתקפים שלהם לחומרים שונים. יש לי VIPAs שני עובי של 5 מ"מ שתוצאת FSR של כ 20 GHz. האינטגרציה הזמן למדידות אלה היה 100 אלפיות שניים. 100 מדידות נלקחו בממוצע. מדידת כיול אחת נלקחה לפני רכישת הספקטרום.
איור 3. רילואן ספקטרה של חומרים שונים. כושר עקום לורנץ (אדום) לנתונים שנמדדו (הכחול). (א) ספקטרום רילואן של מתנול. משמרת רילואן נמדדה היא 5.59 GHz. ספקטרום (ב) רילואן של אתנול. משמרת רילואן נמדדה היא 5.85 GHz. ספקטרום (ג) רילואן של פוליסטירן. משמרת רילואן נמדדה היא 14.12 GHz.מודעה / 53,468 53468fig3large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
משמרות רילואן הושגו מסכימים עם 3,6,7 נתונים שפורסמו בעבר. כדי לקבוע אם היישור של ספקטרומטר הוא אופטימלי, רבות מדידות ספקטרום של אותו החומר שניתן לנקוט ברצף, וסטיית התקן של עמדות השיא יכולה להיות מחושבת. איור 4 א מציג בזמן עקבות של 250 מדידות רילואן של רצף מתנול נלקח ; היסטוגרמה של משמרות רילואן העריכו מוצגת באיור 4. ספקטרומטר מיושר היטב עם 5 mW של אור במדגם וזמן אינטגרציה של 100 אלפיות שניים יהיה סטיית התקן של σ ~ 10 מגה-הרץ. שינויים במשמרת רילואן בתוך קרנית ורקמות עדשה נמדדו להיות בסדר הגודל של 1 GHz 9,10,11. לכן, קריאת משמרת רילואן עם השתנות של ≤10 MHz תאפשר המדידה של רלוונטיוריאציות מכאניות ברקמות.
איור סטייה 4. במשמרת רילואן מעל 250 מדידות מתנול. () זמן-עקבות של 250 מדידות רילואן של מתנול. היסטוגרמה (B) של סטיית משמרת רילואן מעל 250 מדידות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תכונת תכנון מרכזית של תצורת ספקטרומטר זה היא שיכול להיות מיושר שני השלבים באופן עצמאי. כאשר Etalon VIPA הוא החליק אל מחוץ לנתיב האופטי, העדשות הנותרות של שלב ספקטרומטר טופס 1: מערכת הדמיה 1, כך שדפוס הרפאים של כל שלב הוא הדמיה על מצלמת CCD. לכן, זה פשוט לחזור לכל אחד מהשלבים כדי לשפר את הביצועים שלה מבלי להשפיע על היישור של השלב האחר. הסט של שלבי translational ודרגות חופש הציעו בפרוטוקול מעקב פילוסופיה זו של שמירה על היכולת לייעל באופן עצמאי שני השלבים של ספקטרומטר.
קשה לעלות על etalons VIPA כך שתואר ההטיה של חופש מסתובב סביב ציר חלון קלט. בהמשך לכך, בעת הפעלה עם רכיבי אופטו-מכאניים זמינים מסחרי, ההטיה Etalon בהכרח מציג תרגום קטן של חלון הקלט. Translatיון לאורך ציר האלומה האופטי לא צריך לגרום להשפעות שליליות בגלל מגוון הגדול של ריילי עדשת הקלט (~ 3 מ"מ). מצד השני, התרגום במאונך הציר להתפשטות הקרן עשוי להפחית באופן משמעותי את התפוקה של ספקטרומטר. זו הסיבה translational ומעלות ההטיה של חופש על בעל VIPA צריכה להיות מופעל במקביל למקסם את העידון והתפוקה. הוא הציע להתחיל את הליך היישור עם זווית הטיה גבוהה יחסית (~ 3-5 מעלות) כך שצימוד אור לEtalon VIPA הוא כמעט ללא אובדן נתונים. כיישור משפר, זווית ההטיה יכולה להיות ירידה לשפר את העידון. אופטימיזציה של העידון והתפוקה היא חלק חשוב מפרוטוקול היישור, במיוחד עבור יישומים בחומרים ביולוגיים שבו זמן אינטגרציה וכוח הלייזר חייב להישמר נמוכים ככל האפשר.
בפרוטוקול, זה כבר הציע לחלץ את משמרת רילואן מtהוא הניתוח של שתי פסגות רפאים, כלומר פסגות סטוקס ואנטי-סטוקס משני צווי עקיפה סמוכים. זהו הליך מהותי חזק שממזער חפצים בשל מרחף תדר לייזר, או שינויי טמפרטורת Etalon. עם זאת, מדידת פסגות עם משמרת רפאים שונה באופן משמעותי עלולה להיות חסרונות. למעשה, ההליך הניתן לכיול רפאים מבוסס על ההנחה של פיזור רפאים קבוע על פני תבנית הרפאים. במציאות, פיזור הרפאים מגדיל בהזמנות הנמוכות של עקיפה. כתוצאה מכך, האזורים של הספקטרום שמנותח (כלומר, פסגות סטוקס ואנטי-סטוקס משני צווי עקיפה סמוכים) יכולות להיות תפוצות רפאים שונות. במקרה זה, הליך כיול הרפאים נכתב כאן יספק משמרות רילואן לא מדויקות. הוא הציע כי יש להשתמש בחומרים יותר של שינוי רילואן ידוע במצב זה כדי לבנות עקומת כיול רפאים עם כושר פולינום. הדבר חשוב במיוחד אם הערך המוחלט של משמרת רילואן יש השוואה ולא את השינוי היחסי במשמרת רילואן בין שני תנאים.
בדרך כלל, העידון של etalons החופשי-החלל, כולל VIPA מתואר כאן, אינו עולה על 50 ~. כתוצאה מכך, תהיה תחלופה לשקול בין רזולוציה גבוהה רפאים וטווח ספקטרום חופשי. בפרוטוקול זה טווח ספקטרום חופשי של 20 GHz הוא הציע לירוק פעולה (532 ננומטר) לייזר שכן רוב ביו-חומרים משמרות רילואן של פחות מ -10 GHz. רק מחצית מFSR זמינה עבור ניתוח רילואן כי סטוקס ואנטי סטוקס תדר המשמרות גדולים יותר ממחצית FSR יופיע כינוי בספקטרום.
אם קשיים הם נתקלו בהתבוננות אות רילואן, חשוב להכיר אם הנושאים הקשורים לכמות מוגזמת של אור תועה, או למספר נמוך של פוטונים רילואן. l התועה מוגזםight צריך לחסל ביעילות. ודא שמארז הקופסה השחור הוא אור חזק. ללא מדגם, הפעלת אורות בחדר או מכבה את הלייזר לא צריכה לשנות באופן משמעותי את ספירת פוטון רקע המצלמה EMCCD. לחסל לייזר האור מוחזר מן של פני השטח של המדגם, מעט להטות את המדגם, ולהתחיל את התצפית עם מסכות מרחבי סגורות ככל האפשר מבלי לחסום את האות. שני הליכים אלה יאפשר להגדיל את זמן האינטגרציה כדי לאפשר תצפית של אות רילואן מאוד עמומה. אם עדיין אין אות, צפויה שאות רילואן חלשה מדי. השתמש במדגם שונה עם אות רילואן חזקה כגון מתנול, או לבדוק את היישור של אופטיקה האוסף במיקרוסקופ confocal. לאחר התבוננות אות בהצלחה, לייעל אותו עוד יותר על ידי ביצוע הצעד 5.4 מתוארים בפרוטוקול.
אובדן של אור האירוע עקב ספיגה או פיזור יגדיל את r זמן הרכישהequired לניתוח מדגם. כתוצאה מכך, התוצאות הטובות ביותר הן בדרך כלל מתקבלות בחומרים שקופים או דקים. ספקטרומטר מיושר היטב צריך להיות מסוגל לקבל ספירה גבוהה פוטון (> 1000 בשיא) עם 5 mW של אור במדגם ו100ms זמן אינטגרציה לחומרים נוזליים או דגימות פלסטיק שקופות. זה הוא מהיר יותר באופן משמעותי מספקטרומטרים סריקה מסורתיים. בשל כוח זמן רכישה והתאורה הנמוך שלה, ספקטרומטר כזה אפשר שימוש בספקטרוסקופיה רילואן לin vivo ההדמיה -mechanical 3,10,11,12. שימוש בסוג זה של ספקטרומטר, מספר קבוצות הראו מגוון של יישומים, כגון מדידת מאפייני rheological של עדשת העין 13, גילוי דלקת קרום המוח חיידקית בנוזל השדרה 4, וניתוח מודולוס האלסטיות קרני 14.
שיפורים נוספים לספקטרומטר צפויים בעתיד הקרוב, במיוחד אם להקת אולטרה צרה הפסד נמוךלעבור ו / או מסנן חריץ יכול להיות משולב כדי להירגע דרישות הכחדה על פיזור הרפאים VIPA. מאז ספקטרומטר יכול לשמש בשילוב עם מגוון רחב של בדיקות אופטיות סטנדרטיים, לדוגמא מיקרוסקופי confocal 3,4,5, אנדוסקופים, ומנורת סדק אומטלמוסקופ, ספקטרומטר VIPA יכול להיות מרכיב סייע במספר יישומים ביו-רפואיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OPTICS | |||
| VIPA (virtual image phase array) | LIGH MACHINERY | Quantity: 2 | |
| Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers | NEWPORT | 423-MIC | Quantity: 1 |
| SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20 | NEWPORT | 9066-X | Quantity: 1 |
| Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI | NEWPORT | SM-13 | Quantity: 1 |
| Adjustable Width Slit | NEWPORT | SV-0.5 | Quantity: 2 |
| Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in. | NEWPORT | DS40-Z | Quantity: 2 |
| Slotted Base Plate, 25 or 40 mm to 65 mm Stage, 1.1 in. Range | NEWPORT | B-2B | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | THORLABS | TR2-P5 | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2", 5 Pack | THORLABS | PH2-P5 | Quantity: 1 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3", 5 Pack | THORLABS | PH3-P5 | Quantity: 1 |
| Imperial Lens Mount For 2" Optics, 8-32 Tap | THORLABS | LMR2 | Quantity: 2 |
| f=200.0 mm, Ø2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm | THORLABS | AC254-200-A | Quantity: 2 |
| Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed | THORLABS | KM100C | Quantity: 2 |
| Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60" (40.6 mm) | THORLABS | CH1A | Quantity: 2 |
| f=200.00 mm, H=30.00 mm, L=32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm | THORLABS | L1653L1-A | Quantity: 2 |
| Right-Angle Post Clamp, Fixed 90° Adapter | THORLABS | RA90 | Quantity: 1 |
| Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | THORLABS | SM1A9 | Quantity: 1 |
| Studded Pedestal Base Adapter, 1/4"-20 Thread | THORLABS | PB4 | Quantity: 2 |
| Spacer, 2" x 3", 1.000" Thick | THORLABS | Ba2S7 | Quantity: 2 |
| 543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg. | THORLABS | F260APC-A | Quantity: 1 |
| SM1-Threaded Adapter for Ø11 mm collimators | THORLABS | Ad11F | Quantity: 1 |
| Translating Lens Mount for Ø1" Optics, 1 Retaining Ring Included | THORLABS | LM1XY | Quantity: 1 |
| Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long | THORLABS | P3-460B-FC-2 | Quantity: 1 |
| 1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm | THORLABS | MAP103030-A | Quantity: 1 |
| SM1 Lens Tube…length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches | THORLABS | SM1LXX | Quantity: 1 |
| Base Adapters for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | BE1 | Quantity: 8 |
| Clamping Forks for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | CF125 | Quantity: 8 |
| HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series | THORLABS | HW-KIT5 | Quantity: 1 |
| D20S - Standard Iris, Ø20.0 mm Max Aperture | THORLABS | D20S | Quantity: 2 |
| FOR ENCLOSURE | |||
| 25 mm Construction Rail, L = 21" | THORLABS | XE25L21 | Quantity: 6 |
| 1" Construction Cube with Three 1/4" (M6) Counterbored Holes | THORLABS | RM1G | Quantity: 8 |
| Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | THORLABS | XE25A90 | Quantity: 12 |
| 25 mm Construction Rail, L = 15" | THORLABS | XE25L15 | Quantity: 4 |
| 25 mm Construction Rail, L = 9" | THORLABS | XE25L09 | Quantity: 8 |
| High Performance Black Masking Tape, 2" x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll | THORLABS | T743-2.0 | Quantity: 1 |
| Low-Profile T-Nut, 1/4"-20 Tapped Hole, Qty: 10 | THORLABS | XE25T3 | Quantity: 1 |
| 1/4"-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box) | THORLABS | SH25LP38 | Quantity: 1 |
| 60" (W) x 3 yds. (L) x 0.005" (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric | THORLABS | BK5 | Quantity: 1 |
| CAMERA, LASER and MICROSCOPE | |||
| EMCCD camera | ANDOR | iXon Ultra 897 | Quantity: 1 |
| 400 mW single mode green laser | LASER QUANTUM | torus 532 | Quantity: 1 |
| Research Inverted System Microscope | OLYMPUS | IX71 | Quantity: 1 |
References
- Brillouin, L. Diffusion de la lumiere et des rayonnes X par un corps transparent homogene; influence del'agitation thermique. Ann. Phys. (Paris) . 17, 88-122 (1922).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Exp. 19 (11), 10913-10922 (2011).
- Scarcelli, G. Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nat. Phot. 2 (1), 39-43 (2008).
- Nichols, A. J., Evans, C. L. Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy. J. Vis. Exp. (56), e3252 (2011).
- Steelman, Z., Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. V. Brillouin spectroscopy as a new method of screening for increased CSF total protein during bacterial meningitis. J. Biophoton. 8 (5), 1-7 (2014).
- Koski, K. J., Yarger, J. L. Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 87 (6), 061903 (2005).
- Faris, G. W., Jusinski, L. E., Hickman, A. P. High-resolution stimulated Brillouin gain spectroscopy in glasses and crystals. J. Opt. Soc. Am. B. 10 (4), 587-599 (1993).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Exp. 20 (8), 9197-9202 (2012).
- Scarcelli, G., Besner, S., Pineda, R., Kalout, P., Yun, S. H. In Vivo Biomechanical Mapping of Normal and Keratoconus Corneas. Jama Ophtalmol. , (2015).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 103 (22), 221105 (2013).
- Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. Background clean-up in Brillouin microspectroscopy of scattering medium. Opt. Exp. 22 (5), 5410-5415 (2014).
- Reiss, S., Burau, G., Stachs, O., Guthoff, R., Stolz, H. Spatially resolved Brillouin spectroscopy to determine the rheological properties of the eye lens. Biomed. Opt. Exp. 2 (8), 2144-2159 (2011).
- Scarcelli, G., Kling, S., Quijano, E., Pineda, R., Marcos, S., Yun, S. H. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
