Summary
Hier presenteren we een protocol om een snelle Brillouin spectrometer te bouwen. Cascading vrijwel afgebeeld fase array (VIPA) etalons bereiken van een meetsnelheid meer dan 1000 keer sneller dan de traditionele scannen Fabry-Perot spectrometers. Deze verbetering is het instrument om Brillouin analyse van weefsel en biomaterialen bij lage energieniveaus in vivo.
Abstract
Het doel van dit protocol is een parallelle high-extinctie en hoge-resolutie optische Brillouin spectrometer te bouwen. Brillouin spectroscopie is een contactloze meetmethode kan worden gebruikt om direct uitlezingen van visco-elastisch materiaal eigenschappen te verkrijgen. Het is een nuttig instrument in materiaal karakterisering, structurele bewaking en milieu-sensing. In het verleden heeft Brillouin spectroscopie gewoonlijk toegepast scanning Fabry-Perot etalons spectrale analyse. Dit proces vereist een hoge lichtsterkte en lange overname tijden, waardoor de techniek niet geschikt voor biomedische toepassingen. Een recent geïntroduceerde nieuwe spectrometer ondervangt dit probleem door het gebruik van twee VIPAs in een cross-as configuratie. Deze innovatie maakt sub-Gigahertz (GHz) resolutie spectrale analyse met sub-tweede overname tijd en verlichting macht binnen de veiligheidsgrenzen van biologisch weefsel. De meervoudige nieuwe toepassingen vergemakkelijkt door deze verbetering zijn currently onderzocht in biologisch onderzoek en klinische toepassing.
Introduction
Brillouin verstrooiing, eerst beschreven door Leon Brillouin 1 in 1922, is de inelastische verstrooiing van het licht van de thermische akoestische modes in een vaste en van de thermale dichtheidsfluctuaties in een vloeistof of gas. De spectrale verschuiving van het verstrooide licht, meestal in de sub GHz bereik, geeft informatie over de interactie tussen het invallende licht en de akoestische fononen in het monster. Hierdoor kan nuttige informatie over de visco-elastische eigenschappen van het onderzochte materiaal.
In de spontane versie Brillouin verstrooiing in het algemeen dwarsdoorsneden in de orde van Raman verstrooiing, waardoor een zeer zwak signaal. Daarnaast Brillouin frequentieverschuivingen zijn ordes van grootte kleiner dan Raman verschuivingen. Als gevolg daarvan, elastisch verstrooid licht (van Rayleigh of Mie verstrooiing), strooilicht, en back-reflecties van het monster kan de Brillouin spectrale signatuur allemaal gemakkelijk overschaduwen. Dus, Een Brillouin spectrometer moet niet alleen bereiken sub-GHz spectrale resolutie, maar ook een hoge spectrale contrast of uitsterven.
In de traditionele Brillouin spectrometers aan deze eisen wordt voldaan door scannen raspen monochromatoren, optische afstraffing methoden, en, het meest in de volksmond, multiple-pas scanning Fabry-Perot interferometers 2. Deze methoden meten elke spectrale component sequentieel. Deze benadering leidt tot acquisitietijden voor één Brillouin spectrum variërend van enkele minuten tot enkele uren, afhankelijk van het instrument en het monster. De tweetraps VIPA spectrometer gebouwd met dit protocol, heeft de mogelijkheid om alle spectrale componenten te verzamelen in minder dan een seconde terwijl voldoende extinctie (> 60 dB) beteugelen andere stoorsignalen 2.
De integratie van de VIPA etalons is het belangrijkste element van deze spectrometer. Een VIPA is een solide etalon met drie verschillende cdrijvende gebieden: in de voorzijde, een smalle antireflectielaag strip laat het licht aan het VIPA te voeren, terwijl de rest van het oppervlak is voorzien van een sterk reflecterend (HR) coating; in het achteroppervlak, een gedeeltelijk reflecterende coating geeft een klein deel (~ 5%) van het licht wordt uitgezonden. Toen richtte zich op de smalle ingang van de iets gekanteld VIPA, wordt de lichtbundel gereflecteerd in sub-componenten met vaste faseverschil binnen de VIPA 2. Interferentie tussen de sub-componenten bereikt de geambieerde hoge spectrale dispersie. Uitlijnen van twee VIPAs opeenvolgend in cross-as configuratie introduceert spectrale dispersie in orthogonale richtingen 3. De spectrale dispersie in orthogonale richtingen ruimtelijk scheidt de Brillouin pieken van ongewenste overspraak, waardoor het mogelijk op te halen alleen de Brillouin signaal. Figuur 1 toont een schema van de tweetraps VIPA spectrometer. De pijlen onder de optische elementen aangeven degree van vrijheid waarin de translationele etappes moet worden gericht.
Figuur 1. Instrumental setup. Een optische vezel levert de Brillouin verstrooiing in de spectrometer. Een cilindrische lens C1 (f = 200 mm) richt het licht in de ingang van de eerste VIPA (VIPA1). Nog een cilindrische lens C2 (f = 200 mm) beeldt de spectrale hoekige dispersie in een ruimtelijke scheiding in het brandvlak van C2. In dit vlak wordt een verticale masker om het gewenste deel van het spectrum te selecteren. Een analoge configuratie volgt gekanteld 90 graden. De bundel gaat door een sferische lens S1 (f = 200 mm) en is gericht naar de ingang gleuf van de tweede VIPA (VIPA2). Een sferische lens S2 (f = 200 mm) maakt het tweedimensionale spectraal gescheiden patroon in haar brandvlak, waarbij een horizontaal masker wordt geplaatst. De horzontale masker is afgebeeld op de EMCCD camera met behulp van een Achromaat pair. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een undergraduate student met een aantal optische cursussen en fundamentele uitlijnen ervaring moeten kunnen bouwen en gebruiken van deze twee-traps spectrometer. De spectrometer is onlangs aangetoond compatibel met een aantal standaard optische sondes 3,4,5 (bijvoorbeeld, confocale microscoop, endoscoop, spleet-lamp oftalmoscoop) zijn. Hier wordt de spectrometer verbonden met een confocale microscoop. Het laserlicht wordt gericht in een standaardonderzoek systeem omgekeerde microscoop na integratie van een 90:10 bundelsplitser. De terugverstrooiing licht van het monster wordt gekoppeld in een single mode fiber, waardoor de confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Brillouin spectrumanalyse volstaat één enkele longitudinale modus-laser (~ 10 mW bij het monster). Voor het uitlijnen doeleinden, gebruik dan een sterk verzwakt deel van deze laserstraal (<0,1 mW).
1. Eerste installatie van Fiber en de EMCCD (Electron Vermenigvuldigde Charge Coupled Device) Camera
- Identificeren ongeveer 1600 mm vrije uitlijnen ruimte voor de spectrometer op een optische tafel.
- Monteer de EMCCD camera aan het einde van de vrije ruimte uitlijnen.
- Gebruik set schroeven om de camera op berichten. Draai de berichten in functionarissen op de gewenste optische as hoogte. Draai de functionarissen op de optische tafel met behulp tafel klemmen.
- Schakel de EMCCD camera. Wees bewust van de camera verzadiging te voorkomen.
- Installeer de camera software op lab computer en sluit de camera aan op de computer.
- Uitschakelen van de winst en stel lage integratie tijd (~ 0,01 sec). Start verwerven EMCCD beelden. Observeer het camerabeelds op het computerscherm.
- Monteer de vezel collimator ongeveer 1.600 mm in de voorkant van de camera.
- Plaats de vezel collimator in de vezel collimator adapter.
- Monteer de adapter op een post. Draai de post in een functionaris bij de geschatte hoogte van de optische as (hoogte van de camera). Draai na de houder op de optische tafel met behulp tafel klemmen.
- Lijn de uitgang bundel langs de optische as.
- Gebruik een stelschroef om een standaard iris te sluiten op een post. Draai de post in een functionaris.
- Plaats de iris voor de vezel collimator (<50 mm). Stel de hoogte van de iris aan de balk. Verplaats de iris langs de gewenste optische as, die direct moeten wijzen in de camera.
- Plaats een optische dichtheid filter direct na de laser-uitgang als de camera verzadigd. Met de stelschroeven van de vezel collimator monteren aan de bundel langs de optische as af te stemmen. Zodra dit is bereikt, debeam zal netjes passeren de iris langs de gehele bundel pad.
- Monteer een matched achromatische lens pair (f = 30 mm) voor de camera.
2. Horizontale Fase van Spectrometer
- Monteer de horizontale masker.
- Gebruik set schroeven om de horizontale masker te bevestigen op een paal. Draai de post in een functionaris. Monteer de post houder op een translationeel podium, waardoor het masker te glijden horizontaal in en uit de bundel pad. (Figuur 1)
- Gebruik kolomschroeven de translationele fase op de optische tafel zodanig dat het masker scherp wordt afgebeeld op de CCD-camera op de brandpuntsafstand (f = 30 mm) van het achromatische lenzenpaar scherpen.
- Mount en lijn de sferische lens S1 (f = 200 mm) 600 mm vóór het horizontale masker.
- Gebruik set schroeven S1 monteren op een post houder. Draai de post in een functionaris.
- Monteer twee irissen, zoals beschreven in 1.5.1. Voordat placing S1 in de stralengang, plaatst een iris voor en een iris nadat de gewenste positie S1 (600 mm vóór het horizontale masker). De hoogte van de irissen zodanig dat de balk netjes passeert beiden.
- Plaats S1 600 mm vóór het horizontale masker (figuur 1). Pas de hoogte en de hoek van S1 totdat beide, de achterkant reflectie van de lens en de coming-out balk, netjes passeren de irissen. Draai de post holding houder S1 op de optische tafel met behulp tafel klemmen.
- Mount VIPA2 in het brandvlak van de sferische lens (200 mm voor S1).
- Monteer de VIPA houder op een post met behulp van de meegeleverde schroeven aan de houder. Draai de post in een functionaris. Draai de post houder op een horizontale vertaling podium. (Figuur 1)
- Plaats VIPA2 voorzichtig in het VIPA houder met de ingangsspleet verticaal georiënteerd. (Figuur 1)
- Fijn stel de positie of de VIPA monteren precies in het brandvlak van S1. (Controleer door het traceren van de bundel taille met een witte kaart.)
- Gebruik schroeven om de translationele stadium vast op de optische tafel en schuif VIPA2 uit de bundel met de mate van vrijheid van de translationele podium.
- Mount en lijn de sferische lens S2 (f = 200 mm) 200 mm na de VIPA en 200 mm in de voorkant van de horizontale masker. Volg de procedure beschreven in 2.2.1-2.2.3. In plaats van het bevestigen van de functionaris op de optische tafel, zet het op een translationeel podium met een vrijheidsgraad georiënteerd langs de optische as. (Figuur 1) Gebruik schroeven om de translationele fase draai op de optische tafel.
- Gebruik de horizontale translationele stadium (2.3.4) aan de VIPA2 ingang schuiven in de bundel pad. Houd u verticale lijnen op het camerabeeld.
- Fine-S2 te passen met behulp van de translationele podium gemonteerd in 2.4 tot en met de verticale lijnen op de afbeelding van de camera verschijnenscherp.
- Pas het spectrum met de horizontale-tilt mate van vrijheid op het VIPA houder en de translationele podium. Gebruik de horizontale-vertaling mate van vrijheid om af te stemmen de ingang positie van de bundel in de etalon. Gebruik de horizontale-tilt mate van vrijheid om af te stemmen de input hoek van de bundel in de etalon.
- Meet finesse en doorvoer.
- Neem een beeld door op F5 te drukken of als alternatief door te klikken op "verwerving setup" in de linker bovenhoek en te kiezen voor de optie 'nemen het "in de camera software.
- Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en kies de optie "lijn plot". Sleep de cursor horizontaal over het beeld om een lijn plot te genereren. Laat de cursor naar de gegenereerde lijn plot te observeren.
- Gebruik de lijn complot om de finesse meten. Verdeel de afstand tussen twee pieken van de breedte op halve hoogte (FWHM). Streven naar> 30.
- Bepaal de doorvoer door measuring het vermogen met een vermogensmeter onmiddellijk vóór en na VIPA2. Streven naar> 50%.
- Tunen van de ingang hoek van de bundel in de etalon met de mate van vrijheid op het VIPA houder (2.6) en let op de trade-off tussen finesse en doorvoer.
- Als finesse en doorvoer zijn niet bevredigend ga terug en fine-pas de uitlijning. Zorg ervoor dat VIPA2 is in het brandvlak van S1. Herhaal de stappen 2.3.3 -2,7.
3. Verticale Fase van Spectrometer
- Schuif het VIPA (VIPA2), uitgelijnd in deel 2, uit de bundel met behulp van de translationele stadium (2.3.4). De horizontale stand van de spectrometer wordt nu gedragen als een 1: 1 beeldvormingssysteem.
- Monteer de verticale masker.
- Gebruik set schroeven om de verticale masker te bevestigen op een paal. Draai een post in een rechte hoek na klem adapter. Draai een tweede bericht in de juiste hoek adapter en zet het in een post houder. Monteer de post houder op een verticale translationeel podium, allowing het masker verticaal schuiven in en uit de stralengang. (Figuur 1)
- Gebruik kolomschroeven de verticale translatie stadium draai op de optische tafel zodanig dat de verticale masker scherp afgebeeld op het EMCCD camera 200 mm vóór S1.
- Mount en lijn de cilindrische lens C1 (f = 200 mm) 600 mm vóór het verticale masker.
- Schroef de cilindrische lens houder op een post. Draai de post in een functionaris. Plaats voorzichtig C1 in de lens houder en draai de schroeven om het te repareren in plaats.
- Monteer twee irissen, zoals beschreven in 1.5.1. Alvorens C1 in de stralengang, plaatst een iris voor en een iris nadat de gewenste positie S1 (600 mm vóór het verticale masker). De hoogte van de irissen zodanig dat de balk netjes passeert beiden.
- Plaats C1 600 mm vóór het verticale masker (figuur 1). Zorgvuldig aanpassen van de hoogte, tilt, en de laterale positie van C1 totzowel de achterkant reflectie van de lens en de coming-out balk, zijn gecentreerd op de irissen. Draai de post houder bedrijf C1 op de optische tafel met behulp tafel klemmen.
- Mount VIPA1 in het brandvlak van de cilindrische lens (200 mm voor C1).
- Monteer de VIPA houder op een post met de schroef voorzien van de houder. Draai de post in een functionaris. Draai de post houder op een verticale vertaling podium. (Figuur 1)
- Plaats VIPA1 voorzichtig in de VIPA houder met de ingangsspleet horizontaal georiënteerd. (Figuur 1)
- Fijn stel de positie van de VIPA monteren precies plaatsen VIPA1 in het brandvlak van C1. (Controleer door het traceren van de bundel taille met een witte kaart.)
- Gebruik schroeven om de verticale translationele stadium vast op de optische tafel en schuif VIPA1 uit de bundel met de mate van vrijheid van de translationele podium.
- Mount en uitlijnencilindrische lens C2 (f = 200 mm) 200 mm na VIPA1 en 200 mm vóór het verticale masker, volgens de procedure beschreven in 3.3.1-3.3.3. In plaats van het bevestigen van de functionaris op de optische tafel, zet het op een translationeel podium met een vrijheidsgraad georiënteerd langs de optische as. (Figuur 1) Gebruik schroeven om de translationele fase draai op de optische tafel.
- Gebruik de vertaling podium (3.4.4) aan de VIPA1 ingang schuiven in de bundel pad. Acht horizontale lijnen op het camerabeeld.
- Fine-C2 passen met behulp van de translationele podium gemonteerd in 3,5 tot de horizontale lijnen op de afbeelding van de camera verschijnen scherp.
- Pas het spectrum met de verticale-tilt mate van vrijheid op het VIPA houder en de translationele podium. Gebruik de verticale-vertaling mate van vrijheid om af te stemmen de ingang positie van de bundel in de etalon. Gebruik de verticale-tilt mate van vrijheid om af te stemmen de input hoek van de bundel in de etalop.
- Meet finesse en doorvoer.
- Volg de stappen 2.7.1 -2.7.2 om een lijn plot verticaal over een beeld van het scherm van de camera te genereren.
- Gebruik de lijn complot om de finesse meten door de afstand tussen twee horizontale lijnen te delen door hun volle breedte op halve hoogte (FWHM). Streven naar> 40.
- Meet het debiet door het meten van het vermogen met een vermogensmeter onmiddellijk vóór en na VIPA1. Streven naar> 30%.
- Tunen van de verticale ingang hoek van de balk in de etalon met de verticale-tilt mate van vrijheid op het VIPA houder (3.7). Let op de trade-off tussen finesse en doorvoer.
- Als finesse en doorvoer zijn niet bevredigend ga terug en fine-pas de uitlijning. Zorg ervoor dat VIPA1 is in het brandvlak van C1. Herhaal stap 3.4.3-3.8.
4. Combinatie van de twee fasen en Final Alignment
- Schuif in VIPA2. Observeren horizontaal en verticaal op afstand stippen. Deze punten eenopnieuw de spectrale signatuur van de enkele frequentie laser. Pas de translationele stadia van de VIPAs totdat de puntjes zijn scherp.
- Meet finesse en doorvoer van de spectrometer.
- Volg de stappen 2.7.1.-2.7.2 om een lijn plot diagonaal over twee van de laser punten te genereren.
- Gebruik de lijn complot om finesse meten door de diagonale afstand tussen twee punten te delen door hun volle breedte op halve hoogte (FWHM). Streven naar> 30.
- Bouwen van een zwarte doos met de spectrometer omsluiten.
- Gebruik constructie rails aan de box skelet, waarbij de gehele spectrometer moet omsluiten van de vezel collimator op de CCD camera (63 cm x 9 cm x 15 in) te bouwen.
- Bedek de doos skelet met Blackout Fabric en plak hem vast op de hoeken. Zorg ervoor dat de maskers en de VIPAs zijn gemakkelijk bereikbaar.
- Sluit de vezel op een standaard optische sonde, zoals een reflectantie confocale microscoop 4. Standaard optische pgewaden gebruikt om back-verstrooid licht te verzamelen zal een Brillouin signaal te dragen.
5. Het meten van de Brillouin Shift
- Close zowel de verticale en horizontale maskers totdat de laser signature verdwijnt. Verplaats de vertaling stadia dienovereenkomstig.
- Schakel de versterking en verhoging van de integratietijd van de camera zoveel mogelijk zonder verzadigen EMCCD camera.
- Let op de Brillouin verschuiving van een monster.
- Plaats een monster in het brandpunt van een confocale microscoop (of andere optische sonde). De ruimtelijke resolutie hangt af van de objectieve lens in de confocale microscoop. Gebruik een plastic schaaltje of een cuvet voor vloeistoffen. Gebruik Methanol voor de eerste meting.
- Om de spectrometer doorvoer, opent u een masker te optimaliseren op een tijd en scannen via de spectrometer bestellingen door het kantelen van de VIPA en het aanpassen van de vertaling podium. Vind de volgorde waarin het signaal verschijnt het sterkste. Sluiten masker opnieuw tot the laser signaal verdwijnt. Herhaal dit met de andere masker en VIPA (in 2.6 en 3.7 beschreven).
- Neem een meting van het monster.
- Neem een beeld van het spectrum volgende stap 2.7.1.
- Verkrijgen kalibratiemetingen door het nemen van een beeld van het spectrum van water en glas (of ander monster met bekende Brillouin verschuiving). Sla de afbeelding door te klikken op "file" in de linker bovenhoek en kiezen voor de optie "opslaan als". Sla de afbeelding in "SIF" formaat als de data-analyse wordt uitgevoerd in de camera software. Sla de afbeelding in ".tif" formaat als de data-analyse wordt uitgevoerd in een ander rekensoftware programma.
6. kalibratie en de Analyse van de Brillouin Spectrum
- Bepaal het vrije spectrale bereik (FSR) en de EMCCD pixel optische frequentie conversie ratio (PR) in de Brillouin spectrometer.
- Laad de gegevens in de camera software of andere computationele programma.
- Volg stap 2.7.2 om een lijn plot over het gehele spectrum van het water kalibratie genereren.
- Monteer de twee toppen van het spectrum met Lorentz bochten om piekposities bepalen in termen van pixelpositie (P Water-S, P Water-AS). Als alternatief leest de piekposities handmatig door het nemen van de hoogste punt van de pieken.
- Herhaal stap 6.1.2-6.1.3 met het spectrum van het glas kalibratie.
- Als alternatief voor 6.1.1-6.1.4, voeg zowel EMCCD frames en passen op alle vier pieken tegelijk. (Figuur 2)
- Bereken de PR met behulp van vergelijking 1. Sluit de waarden voor P Water-AS en P Glas-Zoals bepaald in 6.1.3 en 6.1.4. Ω Glas-AS is bekend 29,3 GHz. In dit geval, omdat de vrije spectrale bereik slechts 20 GHz zal verschijnen alias de frequentieverschuiving van 9,3 GHz. Voor de eenvoud gebruiken 9.3 GHz voor Ω Glas-AS. Gebruik 7,46 GHz voor ΩWater-AS.
- Bereken de FSR met behulp van vergelijking 2. Sluit de waarden voor P Glas-S, P Glas-AS en PR, berekend 6,16. Gebruik 9,3 GHz voor Ω Glas-AS.
Figuur 2. Spectrometer kalibratie. (A) EMCCD camera beeld verkregen van de kalibratie monster. (B) Lorentz curve fit (rood) om de gemeten gegevens (blauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bepaal de Brillouin verschuiving vaneen monster.
- Volg stap 2.7.2 om een lijn scan over het gehele spectrum van het monster te genereren.
- Monteer de twee toppen van het spectrum met Lorentz bochten om piekposities bepalen in termen van pixelpositie. Als alternatief leest de piekposities handmatig door het nemen van de hoogste punt van de pieken.
- Gebruik de volgende vergelijkingen 4 en 5 en de eerder berekende waarden voor FSR en PR de Brillouin verschuiving van het monster te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3 toont representatieve Brillouin spectra en hun past voor verschillende materialen. De VIPAs beide een dikte van 5 mm waardoor een FSR van ongeveer 20 GHz. De integratie tijd voor deze metingen was 100 msec. 100 metingen werden genomen en gemiddeld. Een kalibratie meting werd genomen voorafgaand aan het verwerven van de spectra.
Figuur 3. Brillouin Spectra -uitvoeringen. Lorentz curve fit (rood) om de gemeten gegevens (blauw). (A) Brillouin spectrum methanol. De gemeten Brillouin verschuiving is 5,59 GHz. (B) Brillouin spectrum van ethanol. De gemeten Brillouin verschuiving is 5,85 GHz. (C) Brillouin spectrum van polystyreen. De gemeten Brillouin verschuiving is 14,12 GHz.ad / 53.468 / 53468fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De verkregen Brillouin verschuivingen eens met eerder gepubliceerde gegevens 3,6,7. Om te bepalen of de uitlijning van de spectrometer optimaal, veel spectrale metingen van hetzelfde materiaal na elkaar worden genomen en de standaarddeviatie van de piekposities worden berekend. Figuur 4A toont een tijd-spoor van 250 Brillouin metingen van methanol taken sequentieel ; een histogram van de geëvalueerde Brillouin verschuivingen weergegeven in figuur 4B. Een goed uitgelijnd spectrometer met 5 mW licht aan het monster en een integratietijd van 100 ms wordt een standaardafwijking van σ ~ 10 MHz. Veranderingen in Brillouin verschuiving binnen het hoornvlies en de lens weefsel zijn gemeten om op de orde van 1 GHz 9,10,11. Daarom zal Brillouin verschuiving lezingen met variabiliteit van ≤10 MHz de meting van de desbetreffende staatmechanische variaties in weefsel.
Figuur 4. Afwijking in Brillouin verschuiving meer dan 250 methanol metingen. (A) Tijd-spoor van 250 Brillouin metingen van methanol. (B) Histogram van Brillouin verschuiving afwijking van meer dan 250 metingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een sleutelelement in het ontwerp van de spectrometer configuratie is dat de twee fasen afzonderlijk worden uitgelijnd. Wanneer een VIPA etalon is geschoven buiten het optische pad, de resterende lenzen van de spectrometer fase vormen een 1: 1 beeldvormingssysteem, zodat de spectrale patroon van elke trap wordt afgebeeld op de CCD camera. Daarom is het eenvoudig om terug te gaan naar een van de stappen om de prestaties te verbeteren zonder dat de uitlijning van de andere fase. De set van translationeel podia en vrijheidsgraden voorgesteld in het protocol te volgen deze filosofie van het behoud van de mogelijkheid om zelfstandig te optimaliseren beide fasen van de spectrometer.
Het is moeilijk de VIPA etalons monteren zodat de kanteling vrijheidsgraad roteert rond het invoervenster as. Vervolgens, bij gebruik met commercieel verkrijgbare opto-mechanische componenten, kantelen de etalon onvermijdelijk introduceert een kleine vertaling van het invoervenster. De translation langs de optische bundel as niet negatieve effecten vanwege de grote Rayleigh bereik van de invoerlens (~ 3 mm) induceren. Anderzijds kan de translatie op de as loodrecht op de bundel propagatie verminderen significant de doorvoer van de spectrometer. Daarom is de translationele en tilt vrijheidsgraden op het VIPA houder moeten worden gecombineerd om finesse en te maximaliseren te bedienen. Er wordt voorgesteld om de uitlijning te starten met een relatief hoge hellingshoek (~ 3-5 graden), zodat de koppeling licht in de VIPA etalon bijna lossless. Als de uitlijning verbetert, kan de hellingshoek worden verlaagd tot de finesse verbeteren. Het optimaliseren van de finesse en de doorvoersnelheid is een belangrijk onderdeel van de uitlijning protocol, vooral voor toepassingen in biologische materialen waarbij integratietijd en laservermogen zo laag mogelijk moeten worden gehouden.
In het protocol is gesuggereerd om de Brillouin verschuiving van t extraherenhij analyse van spectrale pieken, namelijk de Stokes en anti-Stokes toppen van twee aangrenzende buigingsordes. Dit is intrinsiek deugdelijke procedure die artefacten vanwege laserfrequentie afwijkingen of etalon temperatuurveranderingen minimaliseert. Echter, het meten van pieken met significant verschillende spectrale shift kan nadelen hebben. In feite is het voorzien procedure voor de spectrale ijking op basis van de aanname van constante spectrale spreiding over de spectrale patroon. In werkelijkheid, de spectrale dispersie toeneemt in de lagere ordes van diffractie. Dientengevolge, de gebieden van het spectrum die zijn geanalyseerd (dwz de Stokes en anti-Stokes toppen van twee aangrenzende buigingsordes) kunnen verschillende spectrale dispersies. In dit geval zal de spectrale kalibratie geschreven verstrekken onjuiste Brillouin verschuivingen. Er wordt gesuggereerd dat meer materialen van bekende Brillouin verschuiving worden gebruikt in deze situatie een spectrale kalibratiecurve met polynoomfit bouwen. Dit is vooral belangrijk wanneer de absolute waarde van de Brillouin verschuiving moet eerder vergelijken dan de relatieve verandering van Brillouin verschuiving tussen twee condities.
Kenmerkend de finesse van vrijeruimtegebieden etalons, waaronder VIPA hier beschreven, niet overtreffen ~ 50. Als gevolg daarvan zal er een trade-off te overwegen tussen de hoge spectrale resolutie en de vrije spectrale bereik. In dit protocol een vrij spectraal bereik van 20 GHz wordt voorgesteld voor groen (532 nm) laserwerking omdat de meeste biomaterialen Brillouin verschuiving van minder dan 10 GHz. Slechts de helft van het FSR is beschikbaar voor Brillouin analyse omdat de Stokes en anti-Stokes verschuivingen frequentie groter dan de helft FSR zal verschijnen alias in het spectrum.
Als de problemen worden ondervonden bij het observeren van de Brillouin-signaal, is het belangrijk om te herkennen of de problemen zijn gerelateerd aan een overmatige hoeveelheid strooilicht, of een klein aantal fotonen Brillouin. Overmatig verdwaalde lechts moet effectief worden geëlimineerd. Zorg ervoor dat de zwarte doos behuizing is lichtdicht. Zonder monster moet draaien op de kamer verlichting of het uitschakelen van de laser niet significant veranderen de EMCCD camera achtergrond foton tellen. Elimineren laserlicht gereflecteerd van het oppervlak van het monster, licht kantelen van het monster, en start de waarneming ruimtelijke maskers gesloten zoveel mogelijk zonder blokkeren van het signaal. Deze twee procedures mogelijk maakt de integratietijd voor observatie van een zeer zwak signaal Brillouin toestaan. Als er nog steeds geen signaal is, is het waarschijnlijk dat de Brillouin signaal te zwak is. Gebruik een ander monster met sterke Brillouin signaal zoals methanol, of kijk op de uitlijning van de collectie optica in de confocale microscoop. Na een signaal succes observeren, het optimaliseren van het verder door het volgen van stap 5.4 in het protocol beschreven.
Verlies van invallend licht door absorptie of verstrooiing zal de overname tijd r verhogenerplicht voor monster analyse. Hierdoor worden optimale resultaten gewoonlijk verkregen in transparante of dunne materialen. Een goed uitgelijnd spectrometer moet in staat zijn om een hoge foton telling (> 1000 op het hoogtepunt) met 5 mW van licht op het monster en 100ms van de integratie tijd te krijgen voor vloeibare stoffen of doorzichtig plastic monsters. Dit is aanzienlijk sneller dan de traditionele scannen spectrometers. Door zijn lage overname tijd en verlichting macht, heeft zo'n spectrometer met Brillouin spectroscopie voor in vivo -mechanische beeldvorming 3,10,11,12 ingeschakeld. Met behulp van dit type spectrometer, hebben verschillende groepen een verscheidenheid aan toepassingen zoals het meten van de rheologische eigenschappen van de ooglens 13, detectie van bacteriële meningitis bij spinale vloeistof 4 en analyseren van de cornea elastische modulus 14 aangetoond.
Verdere verbeteringen van de spectrometer worden verwacht in de nabije toekomst, met name als low-loss extreem smalle bandpasseren en / of notch-filter kan worden opgenomen om het uitsterven eisen aan de VIPA spectrale dispersie ontspannen. Omdat de spectrometer kan worden gebruikt in combinatie met een aantal standaard optische probes, bijvoorbeeld confocale microscopen 3,4,5, endoscopen en spleetlamp oftalmoscopen, kan de spectrometer VIPA een instrumentele component in verscheidene biomedische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OPTICS | |||
| VIPA (virtual image phase array) | LIGH MACHINERY | Quantity: 2 | |
| Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers | NEWPORT | 423-MIC | Quantity: 1 |
| SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20 | NEWPORT | 9066-X | Quantity: 1 |
| Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI | NEWPORT | SM-13 | Quantity: 1 |
| Adjustable Width Slit | NEWPORT | SV-0.5 | Quantity: 2 |
| Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in. | NEWPORT | DS40-Z | Quantity: 2 |
| Slotted Base Plate, 25 or 40 mm to 65 mm Stage, 1.1 in. Range | NEWPORT | B-2B | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | THORLABS | TR2-P5 | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2", 5 Pack | THORLABS | PH2-P5 | Quantity: 1 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3", 5 Pack | THORLABS | PH3-P5 | Quantity: 1 |
| Imperial Lens Mount For 2" Optics, 8-32 Tap | THORLABS | LMR2 | Quantity: 2 |
| f=200.0 mm, Ø2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm | THORLABS | AC254-200-A | Quantity: 2 |
| Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed | THORLABS | KM100C | Quantity: 2 |
| Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60" (40.6 mm) | THORLABS | CH1A | Quantity: 2 |
| f=200.00 mm, H=30.00 mm, L=32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm | THORLABS | L1653L1-A | Quantity: 2 |
| Right-Angle Post Clamp, Fixed 90° Adapter | THORLABS | RA90 | Quantity: 1 |
| Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | THORLABS | SM1A9 | Quantity: 1 |
| Studded Pedestal Base Adapter, 1/4"-20 Thread | THORLABS | PB4 | Quantity: 2 |
| Spacer, 2" x 3", 1.000" Thick | THORLABS | Ba2S7 | Quantity: 2 |
| 543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg. | THORLABS | F260APC-A | Quantity: 1 |
| SM1-Threaded Adapter for Ø11 mm collimators | THORLABS | Ad11F | Quantity: 1 |
| Translating Lens Mount for Ø1" Optics, 1 Retaining Ring Included | THORLABS | LM1XY | Quantity: 1 |
| Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long | THORLABS | P3-460B-FC-2 | Quantity: 1 |
| 1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm | THORLABS | MAP103030-A | Quantity: 1 |
| SM1 Lens Tube…length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches | THORLABS | SM1LXX | Quantity: 1 |
| Base Adapters for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | BE1 | Quantity: 8 |
| Clamping Forks for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | CF125 | Quantity: 8 |
| HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series | THORLABS | HW-KIT5 | Quantity: 1 |
| D20S - Standard Iris, Ø20.0 mm Max Aperture | THORLABS | D20S | Quantity: 2 |
| FOR ENCLOSURE | |||
| 25 mm Construction Rail, L = 21" | THORLABS | XE25L21 | Quantity: 6 |
| 1" Construction Cube with Three 1/4" (M6) Counterbored Holes | THORLABS | RM1G | Quantity: 8 |
| Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | THORLABS | XE25A90 | Quantity: 12 |
| 25 mm Construction Rail, L = 15" | THORLABS | XE25L15 | Quantity: 4 |
| 25 mm Construction Rail, L = 9" | THORLABS | XE25L09 | Quantity: 8 |
| High Performance Black Masking Tape, 2" x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll | THORLABS | T743-2.0 | Quantity: 1 |
| Low-Profile T-Nut, 1/4"-20 Tapped Hole, Qty: 10 | THORLABS | XE25T3 | Quantity: 1 |
| 1/4"-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box) | THORLABS | SH25LP38 | Quantity: 1 |
| 60" (W) x 3 yds. (L) x 0.005" (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric | THORLABS | BK5 | Quantity: 1 |
| CAMERA, LASER and MICROSCOPE | |||
| EMCCD camera | ANDOR | iXon Ultra 897 | Quantity: 1 |
| 400 mW single mode green laser | LASER QUANTUM | torus 532 | Quantity: 1 |
| Research Inverted System Microscope | OLYMPUS | IX71 | Quantity: 1 |
References
- Brillouin, L. Diffusion de la lumiere et des rayonnes X par un corps transparent homogene; influence del'agitation thermique. Ann. Phys. (Paris) . 17, 88-122 (1922).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Exp. 19 (11), 10913-10922 (2011).
- Scarcelli, G. Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nat. Phot. 2 (1), 39-43 (2008).
- Nichols, A. J., Evans, C. L. Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy. J. Vis. Exp. (56), e3252 (2011).
- Steelman, Z., Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. V. Brillouin spectroscopy as a new method of screening for increased CSF total protein during bacterial meningitis. J. Biophoton. 8 (5), 1-7 (2014).
- Koski, K. J., Yarger, J. L. Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 87 (6), 061903 (2005).
- Faris, G. W., Jusinski, L. E., Hickman, A. P. High-resolution stimulated Brillouin gain spectroscopy in glasses and crystals. J. Opt. Soc. Am. B. 10 (4), 587-599 (1993).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Exp. 20 (8), 9197-9202 (2012).
- Scarcelli, G., Besner, S., Pineda, R., Kalout, P., Yun, S. H. In Vivo Biomechanical Mapping of Normal and Keratoconus Corneas. Jama Ophtalmol. , (2015).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 103 (22), 221105 (2013).
- Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. Background clean-up in Brillouin microspectroscopy of scattering medium. Opt. Exp. 22 (5), 5410-5415 (2014).
- Reiss, S., Burau, G., Stachs, O., Guthoff, R., Stolz, H. Spatially resolved Brillouin spectroscopy to determine the rheological properties of the eye lens. Biomed. Opt. Exp. 2 (8), 2144-2159 (2011).
- Scarcelli, G., Kling, S., Quijano, E., Pineda, R., Marcos, S., Yun, S. H. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
