Summary
טכנולוגיית מיקרוגל מאפשרת סינתזה מהר מאוד של חלקיקי תחמוצת ברזל לאפיון פלאק טרשת עורקים. השימוש של aminobisphosphonate בצד החיצוני של ננו-החלקיקים מספק הצטברות מהירה בתחום הטרשת העורק.
Abstract
פרוטוקול מונחה מיקרוגל מהיר לשחזור פותח לסינתזה של חלקיקים פונקציונלי neridronate. החל מ הסינתזה של חלקיקים הידרופובי, השיטה שלנו מבוססת על עיבוד משיטת פירוק תרמי סינתזת מיקרוגל מונע. המתודולוגיה החדשה מייצרת ירידת זמני התגובה בהשוואה לנהלים מסורתיים. יתר על כן, השימוש בטכנולוגית המיקרוגל מגביר את השחזור של התגובות, משהו חשוב מנקודת המבט של יישומים קליניים. החידוש של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל זו הוא ההיקשרות הרגשית של Neridronate. השימוש במולקולה זו מוביל מחצית בביספוספונטים כלפי החלק החיצוני של ננו-חלקיקים המספק Ca 2 + מחייב תכונות במבחנה וצבירת סלקטיבית in vivo של פלאק טרשת. הפרוטוקול מאפשר סינתזה זיהוי לוחית כ -3 שעות מאז סינתזה הראשונית מן שרתי רשתמבשרי ג. ההצטברות שלהם בתחום הטרשת העורק בתוך פחות מ -1 hr מספקת חומר ניגוד מתאים במיוחד עבור יישומים קליניים.
Introduction
טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית multifactorial של דופן העורק הנובע מטבוליזם השומנים ושוחררו ו תגובה דלקתית פגום. עקב שכיחות ואת העלויות הכלכליות והחברתיות של מחלות לב וכלי דם זה וקשורים יש התעניינות גוברת בהתמודדות עם הפתולוגיה עם כלים חדשים, מתוכם ננוטכנולוגיה הוא אחד המבטיחים ביותר. 1-3 עם זאת יש מעט מאוד דוגמאות של מהר ייצור ואפיון של בדיקות שהוא בסיסי לתרגום למרפאת 4 בפרוטוקול זה אנו משתמשים סינתזת מיקרוגל של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עבור functionalization נוספת עם בביספוספונטים וב איתור vivo של טרשת ApoE -. / -. עכברי 1 hr 5 חלקיקי תחמוצת ברזל (IONP) הם nanomaterial ידוע ושימוש בו כסוכן בניגוד עבור דימות תהודה מגנטיות (MRI) כבר נקבע לצורך זיהוי של מחלות שונותים בשנים האחרונות. 6-8
סינתזת מיקרוגל (MWS), מאפשרת סינתזת חלקיקים בזמנים קצרים מאוד עם שחזור גבוה ותשואות משופרות. 9,10 בפרוטוקול שלנו נקבל IONP עם מיקוד פלאק יכולה בשלושה שלבים. המכשול האחרון הוא ההיצמדות של aminobisphosphonate, Neridronate, שהיא מפתח באסטרטגיה שלנו בשל מאפייני סידן והמחייבת. בשל pyrophosphate אנלוגי הטבעי שלהם (PPI), Neridronate נעשה שימוש בטיפול Osteogenesis Imperfecta (OI) ו במחלת פאג'ט של העצם (PDB) עבור זיקה גבוהה כלפי המינרלים בעצמות. 11-13
שלושת השלבים של פרוטוקול מסוכמים ערכת 1. שלבים אחד ושניים מתבצעות באמצעות טכנולוגיית מיקרוגל. הצעד הראשון לספק חלקיקי תחמוצת ברזל אולאית מצופה חומצה (OA-IONP) על ידי שינוי של שיטות שפורסמו. 14 פרוטוקול הוא עיבוד סינתזה מיקרוגל של traditסינתזת פירוק תרמי ional. 15,16 תערובת המכילה Fe (acac) 3, חומצה אולאית, oleylamine ו 1,2-dodecanediol מומסת אלכוהול בנזיל נתון בשני תהליכי חימום. הטיהור מתבצעת שטיפה עם EtOH ואיסוף החלקיקים עם מגנט Nd-Fe-B לחסל את העודף של חומרים פעילים שטח ב supernatant. לאחר מכן, OA-IONP מתייצבים CHCl 3. כצפוי, בשל חימום מהיר מאוד, התוצאות החזויות הראו כי חלקיקים מסונתז על ידי מיקרוגל הם קטנים מבחינת הליבה (3.7 ± 0.8 ננומטר) וגודל הידרודינמית (7.5 ננומטר) בהשוואה פירוק תרמי המסורתי; עם זאת, חלקיקים עדיין להציג crystallinity מעולה.
הצעד השני מורכב שינוי כימי ישיר של הקשר הכפול, נוכח החומצה אולאית, באמצעות מחמצן חזק כמו KMnO 4, המתודולוגיה המקורית שפותחה בקבוצה שלנו שונת תנאי MW.17 בשלב ראשון מהווה את המתחמים בין MNO 4 - ואת הקשר הכפול. לאחר מכן, בשלב השני בתנאים חומציים, לייצר את המחשוף של מולקולת חומצה אולאית מתן חומצה אזלאית-IONP. לאחר שני השלבים הללו של 9 דקות כל אחד, המדגם הוא מטוהר, כביסה ראשונה עם NaHSO 3 1% כדי להפחית את עודף MNO 4 - כדי MNO 2 ולאחר מכן עם NaOH 1% לנטרל את החומצה.
לאחר שלב טיהור, אזלאית-IONP מתייצבים 10 מ"מ pH חיץ פוספט = 7.2. מאגר זה הוא את הסביבה הטובה ביותר עבור יציבות קולואידים של החלקיקים בדומה למה שקרה התגובה המקורית, התרמית. 18 השימוש במיקרוגל במשך החמצון הישיר של הקשר הכפול הכלול OA-IONP הוא דוגמא טובה מאוד של היתרונות של שימוש בטכנולוגיה זו בסינתזה של חלקיקים. עם השיטה הקלסית התגובה לוקחת 24 שעות, הניצול של מיקרוגל להקטין את Reactiבזמן עד 18 דקות. יתר על כן, הפרוטוקול מונחה המיקרוגל מראה שחזור מעולה נותן חלקיקים עם 30 ± 5 ננומטר של גודל הידרודינמית לאחר 4 חזרות. מלבד השינוי בגודל הידרודינמית, פוטנציאל זטה הוא פרמטר טוב במהירות כדי לבדוק את המוצלחת של התגובה. בשל נוכחותם של קבוצות קרבוקסיליות החדשות אזלאית-IONP, הערך עבור פוטנציאל זטה הוא סביב -44 mV, דומה מאוד לערך שהשיג הגישה התרמית.
המצורף של neridronate כדי אזלאית-IONP, נטיית EDC / sulfo-NHS מסורתית משמשת. 19 גישה סינטתית זה ומבוססת מאז העסקת carboxylate מופעל עם sulfo-NHS מבטיח יציבות קולואידים במהלך התגובה. לאחר החיסול של חיץ פוספט התגובה עם neridronate מתבצעת 1 חיץ HEPES מ"מ (pH ~ 7). התגובה הופכת Neridronate-IONP עם גודל הידרודינמית של 40 ± 4 ננומטר distr גודל צרibution ו -24.1 mV של פוטנציאל זטה.
ההליך מתואר לסינתזה מהירה של IONP עבור in vivo הדמיה של פלאק טרשת העורק למרות הכדאיות של השיטה מאפשרת התקשרות של כל פפטיד / נוגדן עם אמינים חינם, באמצעות אותם התנאים, למטרות שונות בתוך סוכן T 2 משוקלל ניגוד MRI שדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים
- הכן 1 מ"מ HEPES חוצץ המסת 23.8 מ"ג של HEPES ב 100 מ"ל של מים מזוקקים. התאם את ה- pH ל -7.
- הכן 10% NaHSO 3 המסת 10 גרם של NaHSO 3 ב 100 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים את התערובת במשך 15 דקות.
- כן פתרון NaOH המסת 1 גרם של NaOH ב 100 מ"ל מים. מערבבים למשך 10 דקות.
- כן 10 מ"מ חיץ פוספט המסת 600 מ"ג של לאא 2 PO 4 ב 1 ליטר של מים. הוסף בזהירות 0.34 מ"ל של חומצה זרחתית מערבבים למשך 30 דקות. התאם את ה- pH 2.9 (קבלת טווח 2.7-3.0).
- הכן 10 מ"מ חיץ פוספט המסת 269 מ"ג של לאא 2 PO 4 ו 1.09 גרם של Na 2 HPO 4 למים מזוקקים לעשות נפח של 1 ל התאם את ה- pH ל -7.2.
2. סינתזה של אולאית חומצה מצופה חלקיקים (OA-IONP)
- בבקבוק מיקרוגל מותאם להוסיף 0.5 גרם של Fe (acac) 3, 1.4 מ"ל של עוליג חומצה, 0.6 מ"ל של oleylamine ו 1.19 גר '1,2-hexadodecanediol. הוסף 10 מיליליטר של אתר פניל בזהירות דרך קיר הבקבוק בעזרת פיפטה בוגרת.
- הצג את הבקבוק בכור המיקרוגל להתחיל פרוטוקול המיקרוגל.
הערה: תוכנת מיקרוגל מאפשרת בחירת הגודל עבור פרמטרים שונים כמו טמפרטורה, לחץ, מהירויות ערבוב, כוח וזמן תגובה. יתר על כן, יש לו את האפשרות לטעון שלושה שלבים שונים באותו הפרוטוקול המאפשר סינתזה מתכוננת. לאחר הפרוטוקול הסינטטי הטעון מתחיל, מיקרוגל מחמם את המדגם מהר ככל האפשר (תהליך ramping) ושומר אותו בזמן התגובה שנבחר (ריצת תהליך). בחירת הכח קובעת את הזמן של ramping. - טען מחקר דינמי במיקרוגל. הפרוטוקול מכיל שלושה שלבים:
- שלב 1: להגדיר את הטמפרטורה ל 60 מעלות צלזיוס, זמן 2 דקות, לחץ 250 psi ו -150 וואט. יש מהירות מערבבים להיות בעמדה גבוהה וכוח מקס על.
- צְבִיe 2: להגדיר את הטמפרטורה ל -200 מעלות צלזיוס, זמן 20 דקות, לחץ 250 psi ו -300 וואט. יש מהירות מערבבים להיות בעמדה גבוהה וכוח מקס על.
- שלב 3: להגדיר את הטמפרטורה ל -250 מעלות צלזיוס, זמן 10 דקות, לחץ 250 psi ו -300 וואט. יש מהירות מערבבים להיות בעמדה גבוהה וכוח מקס על.
- לאחר שסיים את הפרוטוקול, לאפשר את הבקבוק להתקרר בטמפרטורת חדר.
הערה: הרגעות התהליך יכול להיעשות עם או בלי זרם הגז. בשני המקרים לספק אותן תוצאות. אגרגטים להופיע בשורת ומערבבים ובקיר של הבקבוק, לשטוף אותו עם EtOH ולשים אותו על Erlenmeyer. - מעבירים את התערובת תגובה על Erlenmeyer באמצעות פיפטה מזכוכית ולהוסיף 10 מ"ל של 98% EtOH. שים מגנט Nd-NB-ב 'להלן הבקבוק, לחכות 5 דקות ולהסיר את supernatant עם טפטפת זכוכית.
- הוסף 10 מ"ל של EtOH, sonicate המדגם ב RT במשך 2 דקות ו -40 kHz, לשים המדגם על המגנט ולחסל את supernatant. חזור על שלב זה ב least שלוש פעמים.
- לפזר חלקיקים אולאית ב 30 מ"ל של CHCl 3 ו sonicate ב 40 kHz עבור 5 דקות ב RT. בדוק את גודל הידרודינמית של Zetasizer לפי הוראות היצרן. שים 0.5 מ"ל של OA-IONP קובט זכוכית ולהוסיף 0.5 מ"ל של CHCl 3. מגוון קבלה 7-10 ננומטר מבוטא גודל Z-ממוצע בעצמה.
הערה: OA-IONP יכול להיות גם פיזור בהקסן.
3. סינתזה של חלקיקים חומצה אזלאית (חומצה אזלאית-IONP)
- ממיסים 44.3 מ"ג של KMnO 4 ו 150.4 מ"ג BTACl בתערובת של H 2 O: 3 CHCl (3: 2 מ"ל). מוסיף את הפתרון הנגרם aliquot 5 מיליליטר של OA-IONP במיקרוגל מותאם בקבוק.
- הפעל את פרוטוקול במיקרוגל במשך חומצה אזלאית-IONP. טמפרטורה שוכנת בגובה 105 מעלות צלזיוס, זמן 9 דקות, לחץ 250 psi והכח ב 300 W. שמים 10 מיליליטר של pH חיץ פוספט = 2.9 לתוך הבקבוק וחזור על פרוטוקול המיקרוגל. לאחר קירור צעד, לשחזר את החלקיקיםבאמצעות מגנט ולחסל את supernatant.
- הוסף 5 מ"ל של 10% NaHSO 3 אל הבקבוק Erlenmeyer, sonicate ב 40 kHz עבור 2 דקות ב 25 מעלות צלזיוס, לאסוף את החלקיקים באמצעות מגנט ולחסל את supernatant. (השלב חוזר 2 פעמים.) שטוף את החלקיקים שלוש פעמים נוספות עם 1% NaOH ולבסוף מחדש ולפזר אותו ב 5 מיליליטר של pH חיץ פוספט = 7.2.
- בדוק את גודל הידרודינמית פוטנציאל זטה. שים 0.7 מיליליטר של אזלאית-IONP לתוך תא נימי מקופל הפנוי ולהכניס אותו אל Zetasizer.
הערה: טווח קבלה עבור גודל 25-35 ננומטר מבוטא גודל Z-ממוצע בעצמה. מגוון קבלה עבור בעלי פוטנציאל Z -45 ± 5 mV. גדולים יותר חלקיקים (~ 70 ננומטר) ניתן לקבל עם pH חיץ פוספט> 7 במקום pH = 2.9 (נ"צ Chem Eur J 2008).
4. סינתזה של Neridronate חלקיקים (Neridronate-IONP)
- להוסיף 12 מ"ג של EDC ו -15 מ"ג של sulfo-NHS בתוך צנטריפוגה עם 2 מ"ל aliquot של אזלאית-IONP. לָשִׂיםאת תערובת מערבולת ב RT במשך 35 דקות.
- שים מגנט מתחת צנטריפוגות כדי לערער את החלקיקים, לשאוב supernatant לשטוף את החלקיקים עם 1.5 מיליליטר של חיץ pH HEPES 1 מ"מ = 7. (חזור על פעולה זו פעמיים.) לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ג neridronate ולנער את התערובת בתוך מעטפת עבור שעה 2.
- חלקיקים נפרדים עם מגנט לשטוף (3 x 2 מ"ל) עם 1 מ"מ HEPES pH = 7 חיץ. לבסוף, לפזר Neridronate-IONP ב 2 מ"ל של 1 מ"מ HEPES pH = 7 חיץ.
- בדוק את גודל הידרודינמית פוטנציאל זטה. שים 0.7 מיליליטר של Neridronate-IONP לתוך תא נימי מקופל הפנוי ולהכניס אותו אל Zetasizer (ראה הגדרת ציוד).
הערה: טווח קבלה עבור גודל 40-45 ננומטר מבוטא גודל Z-ממוצע בעצמה. מגוון קבלה עבור בעלי פוטנציאל Z -20 ± 5 mV.
5. איתור Vivo של לוחית atheroma ב ApoE - / - עכברים באמצעות MRI
- לקראת רכישת MRI
הערה: לשעבר מספרמערכות tra לניסויים בבעלי חיים נחוצות. לכן, זה ידרוש:- יש להשתמש בציוד מתאים כדי להרדים את החיות.
- השג מערכת מים חמה קרובה במחזור במעגל עם אוויר חם חיצוני כדי לשמור על הטמפרטורה של יציבת החיה.
הערה: במקרה זה מערכת ניטור gating התואמת MRI רושמת את הטמפרטורה של החיה בתוך מגנט MRI. - צג הטמפרטורה החיצונית בקרבת החיה, טמפרטורת הגוף (רקטלית מדחום) של החיה, חיישן הנשימה ממוקם מתחת לגוף של חיה ליד בית החזה באמצעות ממשק משולב במסוף MRI.
- ניסוי MRI
- להרדים את החיות עם isoflurane מתאדה (2% לזירוז במהלך שתיים או שלוש דקות ו 1-1.5% לצורך תחזוקה במהלך הניסוי MRI) עם קו 100% חמצן.
- מניח את החיה במרכז המגנט בעזרת רכישת פרופיל.
- לאחר שלב 5.2.2, לכוון את סליל RF עד 300 MHz (7 T) תדר תהודה ולהתאים את העכבה האופיינית של הסליל כדי 50 אוהם עבור קבלת אות אופטימלית.
הערה: שים לב החיווט החיצוני וחיבורים הולכים מערכת המדידה באמצעות המתאם / ספליטר כל חלק של סליל המשדר בנפרד (במקרה שלנו זה היה סליל נצב). - לאחר כוונון והתאמת הסלילים, חבר את הסלילים לתוך הסורק.
- עבור כיול דופק RF (צורה ואורך) והתאמת תדר מרכזית לבצע הן כיול דופק במרכז התדר באופן ידני. בצע את הכיול דופק 90 °, shimming הגס (ראה להלן), התאמות מרכז תדר ומקלט רווח ידני.
- בצע את מיקום מדויק באמצעות שיפוע הד (FLASH או GRE) סריקת מְאַתֵר (רכישת הסקאוט 3 מטוס: צירי, עטרה ועל sagittal, המכונה גם tripilot.
- בצעו את shimming מגנט כדי לייעל את ההומוגניות השדה המגנטי CENter של המגנט. בצע פעולה זו באופן ידני (ראה 5.2.3) תוך שימוש ברצף FID דופק אחד או אחת ולהתאים את shims ההזמנות הראשון והשני או כל רצף shimming אוטומטי נכלל במערכת
הערה: שדה מגנטי ונוקד גם מוכר בקלות נמדד על ידי * T2 (כמו גדול יותר טוב) או FWHM הצר של הספקטרום.
- קליטת נתוני MRI של 5 הלוחית
- להזריק 100 μl (1 מ"ג [Fe] מ"ל -1) של חלקיקים neridronate לווריד לתוך וריד הזנב ולרכוש תמונות 1 שעות שלאחר ההזרקה. טען את הפרמטרים לרכישת MRI של פלאק טרשת עורקים מסתכל על אבי העורקים בבטן (הסתעפות כליות).
- שים-פרוסה רבה, 10 עד 20 פרוסות במצב interleave למזער חפצים.
- רוכשת ספין מהיר ברזולוציה גבוהה הד MRI T1-weighted לאור העטרה או צירית עם הפרמטרים הבאים: FOV 60 x 30 מ"מ (העטרה), 30 x 30 מ"מ (צירית), פורסים 0.8 מ"מ עובי (עם שיתוף סליל שיפוע קטןnfiguration זה יכול להיות מופחת ל -0.6 מ"מ), 400 msec TR, 8 msec TE, 256 x 256 רכישה ונתונים מטריקס השחזור, 6 (שיפוע גדול) עד 8 (שיפוע קטן) ממוצעי אות פעמי רכישה ממוצעות 5-8 דקות.
הערה: TE הוא קריטי במיוחד ואת הנוכחות של אות דם וזרימה וממצאי משמרת כימיות שיכול להגביל את היישומים. במקרים אלה לזרום T2-IR הד ספין מהיר הרגיש יכול לעזור להפחית לכלוכים ורכישת נתונים משלימים באותו המיקום המדויק יכול לעזור לאפיין את הפלאק. בנוסף, דופק presaturation יכול לשמש כדי להפחית את רקמת השומן המקיף את הדופן העורקת עבור תיחום טוב יותר של הגבול החיצוני של הפחתת חפץ הקיר וכימי משמרת. - העבר את התמונות באמצעות פורמט סטנדרטי כגון DICOM ונוף בתוכנה מתאימה (למשל Osirix הדמיה תוכנה או אמיד: בוחן נתונים הדמיה רפואית) 5. לכמת את אפקט הניגוד ידני התוחם את vessel באזור, עובי דופן, אזור לומן ורובד נטל 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה, הסינתזה של שלושה IONP השונים מתוארת. החל מ OA-IONP הידרופובי, חלקיקים יציבים מימיים מתקבלים בעזרת סינתזת מיקרוגל מונחה. כל החלקיקים הציג גודל הידרודינמית אולטרה-קטן (ד"ה <50 ננומטר) בתוך (איור 1 ג ') התפלגות גודל צרה מאוד. השימוש בטכנולוגית מיקרוגל הופך חלקיקי אולטרה קטנים במונחים של גודל ליבה. מאז המיקרוגל לייצר חימום מהיר, קצב גידול ההתגרענות בהשוואה מתודולוגיות אחרים נותנים בגדלים קטנים יותר בליבה של החלקיקים. עם זאת, החלקיקים עדיין להציג crystallinity מעולה כמו מוצג תמונות TEM שם בשולי הסריג על ליבות Fe 3 O 4 ניתן לראות בבירור (איור 1 א, ב). היבט חשוב אחר של השיטה הוא השחזור. אחרי ארבע חזרות של סינתזה של חומצה אזלאית-IONP, את אותן תוצאותבגודל והפצת הידרודינמית התקבלו (1D איור).
אחרי functionalization, Ca 2 + מחייב נכסים בשל ביספוספונטים נוכח חלקיקי neridronate נבדק דוגרי חלקיקים אלה עם כמויות שונות של Ca 2 +. זה היה הראה כי במרווחי זמן רגיעת T 2 ליניארי עם כמות Ca 2 + ואת זמן הדגירה עקב ההיווצרות של אשכולות של ננו-חלקיקים ואילו חלקיקים ללא Ca 2 + נותרים יציבים (איור 1 ד), עומד ההשערה הראשונית שלנו.
בניסויים vivo MRI בוצעו 48 שבועות ApoE - / - עכברים. עורק ראשי ותמונות הבזליים אב עורקים בבטן נלקחו ראשון. הנגע עקב היווצרות של פלאק טרשת עורקים ניתן לראות בבירור. לאחר מכן, 100 μl (1 מ"ג [Fe] מ"ל -1 (איור 2), 1 פוסט hr הזרקת האות מהווה את הפלאק הוא hypointense בהשוואת התמונות הבזליים. בחירת שני ROIs (האזור של עניין) מאפשר כימות של עוצמת האות באזור הנגע עבור השוואה בין הבסיס ו 1 hr תמונות לאחר ההזרקה. שלט יחס שריר שונה מהותי ביניהם (p <0.05, איור 2b).
בנוסף, אות בכבד היה פיקוח בעכברים לאחר ההזרקה של 100 μl של חלקיקי neridronate להעריך אם הפחתת העוצמת נבעה לעת במחזור הדם ולא על ידי הצטברות סלקטיבית. כפי שניתן לראות בתרשים (איור 2 ג), חלקיקים נוקו לגמרי מהמחזור אחרי 20 דק 'המאשר את הצטברות סלקטיביתשל neridronate חלקיקים לכיוון פלאק טרשת עורקים. הדמית היסטולוגיה vivo לשעבר סופיים בוצעו. עכברים הוקרבו ואת aortas חילוץ. הדמיה של aortas עם ובלי חלקיקים הראתה בדלי האות בהסכמה עם בניסויי vivo (איור 2).
תכנית 1:. צעדים סינטטיים המיושמים הפרוטוקול והאפיון בסיסי בכל נקודה על ידי DLS אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 1: Characterization של חלקיקים (א) תמונות TEM, בשתיים בהגדלה עבור OA-IONP.; (ב) תמונות TEM, בשתיים בהגדלה עבור Neridronate-IONP; (ג) גודל הידרודינמית עבור חלקיקים OA-IONP, חומצה אזלאית-IONP ו Neridronate-IONP; (ד) גודל הידרודינמית עבור חומצה אזלאית-IONP בארבע סינתזה שונה ו- (ה) אבולוציה של זמן T 2 הרפיה בתמיסה של Neridronate-IONP כפונקציה של זמן וריכוז סידן (פרוטוקול TEM נ"צ: NIST - פרוטוקול Assay המשותף NCL , PCC-X, מדידת גודל של חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: נתוני MRIשל פלאק (א) בשנת vivo MRI של ApoE - / - עכבר לפני (למעלה) שעה אחת לאחר ההזרקה iv של Neridronate-IONP (למטה).; (ב) שלט עוצמת האות ביחס שריר לפני (basal) ושעה אחת לאחר ההזרקה iv של Neridronate-IONP; (ג) כבד עוצמת אות ביחס שרירים בנקודות זמן שונים לאחר ההזרקה של Neridronate-IONP ו- (ד) לשעבר vivo תמונות של אב העורקים עבור שני עכברים, עם ובלי ההזרקה של חלקיקים 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חלקיקי תחמוצת ברזל (IONP) הם אחד ננו החשוב ביותר והוא שימש במשך יישומים שונים מלפני הרבה זמן. השימוש בחומרים אלה כסוכן בניגוד עבור דימות תהודה מגנטית (MRI) הוא תחום ומבוססת. עם זאת, תוואי סינתזה לעתים קרובות להימשך מספר זמן ההגדרה היא מסובכת. בשל להפחית באופן דרמטי את זמני התגובה ומגבירה שחזור השימוש סינתזה מיקרוגל מונחה נראה להיות אלטרנטיבה טובה לייצור חלקיקים באיכות גבוהה. בפרוטוקול לעיל, טכנולוגית מיקרוגל שמשה במשך הסינתזה של שני חלקיקים שונים. מיקרוגל לאפשר כיוונון עדין של הפרמטרים העיקריים שיכול להשפיע על המאפיינים הסופיים של החלקיקים. חשוב לציין כי התכונות הפיסיקליות של החלקיקים תשתנינה אם אחד מהתנאים המתוארים הם השתנו. מאז כמה כימיקלים המשמשים בהליך הסינטטי, purification צעדים חיוניים כדי להשיג חלקיקים באיכות גבוהה.
ב OA-IONP עודף של חומרים פעילי שטח משמשים כדי להשיג יציבות מספיק חלקיקים. לאחר סינתזה, שלושה צעדים טיהור הם חובה להסיר אותו. לסינתזה של חומצה אזלאית-IONP, בשני שלבים מיקרוגל שונים נדרשים. בשלב השני, הגודל הסופי של חלקיקים יכול להיות מכוון מן IONP אולטרה-קטן (ד ח <50 ננומטר) באמצעות pH = 2.9 לגודל הידרודינמית גדול (D h> 50 ננומטר) באמצעות pH פיזיולוגי. בתחום הטיהור של החומצה אזלאית-IONP, בסך של NaOH בשימוש חיוני. יש כמות די NaOH שיתווסף לייצב את החלקיקים, אולם מדי NaOH יכול desorb הפעיל השטח מן החלקיקים טיוח חומר יציב.
בדרך כלל, IONP להחזיק זמן מחזור קצר בדם אשר הוא אחד החסרונות העיקריים. לשימושו כסוכן לעומת זאת, חלקיקים צריכים CIRculate מספיק זמן בדם להגיע לאזור הרצוי. כדי להאריך את משך הזמן במחזור הדם גישות שונות מתבצעות באופן קלאסי. אסטרטגיות אלה הן בעיקר מבוססות על הקובץ המצורף של מחצית pegylated כי במידת הזמן במחזור של ננו-החלקיקים. עם זאת, במקרה של Neridronate-IONP, ההצטברות מופקת מאוד מהר. השימוש של aminobisphosphonate כמו biomolecule על חלקיקים למקד פלאק טרשת הוא מושג חדש המבוסס על יכולות סידן מסוגים אלה של תרכובות. ההצטברות שלה באזור הנגע בתוך פחות שעות מדגימה את הזיקה הגבוהה של Neridronate-IONP כלפי סידן הכלול פלאק הטרשת.
להדמיה של פלאק טרשת, שיטות הדמיה מתקדמות רבות מועסקות בדרך כלל. ביניהם, טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) ו- MRI הן טכניקות סטנדרטי ביותר. PET מספק את התוצאות הטובות ביותר מבחינת מידע פונקציונלי בשל רגישות גבוההMRI את התוצאות הטובות ביותר מידע אנטומי בשל ברזולוציה הגבוהה. למרות PET יכול להיות האפשרות האידיאלית לעקוב בדיקה סינטתית, הרזולוציה של טכניקה זו בבעלי חיים קטנים (~ 1 מ"מ) מגביל את השימוש בו כדי להמחיש הסתיידויות קטנות טרשת עורקת. MRI הוא חלופה אידיאלית מתן רזולוציה טובה יותר (~ 0.1 מיקרומטר). הרגישות הנמוכה של טכניקה זו לא תמנע את להדמיה של חומר הניגוד באזור הריבית ואת הרזולוציה הטובה יותר מאפשרת זיהוי הסתיידויות קטנות. בנוסף, התוצאות מראות כי השילוב של ההצטברות המהירה הייחודית של Neridronate-IONP עם הרזולוציה הגבוהה של MRI הוא תרחיש אידיאלי לצורך זיהוי של פלאק טרשת בבעלי חיים קטנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microwave Explorer/Discover Hybrid-12 | CEM Corporation, USA | Any microwave for chemical synthesis can be used | |
| Disposable PD-10 desalting columns | GE Healthcare life sciences | 17-0851-01 | Any size exclusion column will work |
| Amicon®Ultra-0.5 ml | Merck Millipore Ltd | ||
| Calibrated pH meter | SI analytics | 285105127 | |
| Neodymium magnet | Aiman Gz | ND010B | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| ZetaSizer Nano ZS | Malvern Instruments | ||
| Standard (macro) cell Optical glass | Labbox | 11718 | |
| Zetasizer nanoseries disponsable folded capillary cells DTS1070 | Malvern | ||
| Bruker Minispec mq60 | Bruker |
References
- Patel, D. N., Bailey, S. R.
- Zhao, X., Zhao, H., Chen, Z., Lan, M. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging contrast agent. J. Nanosci. Nanotechnol. 14, 210-220 (2014).
- Lee, D. E., et al. Multifunctional nanoparticles for multimodal imaging and theragnosis. Chem. Soc. Rev. 41, 2656 (2012).
- Osborne, E. A., et al. Rapid microwave-assisted synthesis of dextran-coated iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging. Nanotechnology. 23, (2012).
- Pellico, J., et al. Microwave-driven synthesis of bisphosphonate nanoparticles allows in vivo visualisation of atherosclerotic plaque. RSC Adv. 5, 1661-1665 (2015).
- Lin, M. M., Kim, D. K., El Haj, A. J., Dobson, J. Development of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONS) for translation to clinical applications. IEEE Trans. Nanobioscience. 7, 298-305 (2008).
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
- Liu, F., Laurent, S., Fattahi, H., Vander Elst, L., Muller, R. N. Superparamagnetic nanosystems based on iron oxide nanoparticles for biomedical imaging. Nanomed. 6, 519-528 (2011).
- Carenza, E., et al. Rapid synthesis of water-dispersible superparamagnetic iron oxide nanoparticles by a microwave-assisted route for safe labeling of endothelial progenitor cells. Acta Biomater. 10, 3775-3785 (2014).
- Osborne, E. A., et al. Rapid microwave-assisted synthesis of dextran-coated iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging. Nanotechnology. 23, 215602 (2012).
- Gatti, D., Rossini, M., Viapiana, O., Idolazzi, L., Adami, S. Clinical development of neridronate: potential for new applications. Ther. Clin. Risk Manag. 9, 139-147 (2013).
- Drake, M. T., Clarke, B. L., Khosla, S. Bisphosphonates: mechanism of action and role in clinical practice. Mayo Clin Proc. 83, 1032-1045 (2008).
- Devogelaer, J. P. Treatment of bone diseases with bisphosphonates, excluding osteoporosis. Curr. Opin. Rheumatol. 12, 331-335 (2000).
- Pascu, O., et al. Surface Reactivity of Iron Oxide Nanoparticles by Microwave-Assisted Synthesis; Comparison with the Thermal Decomposition Route. J. Phys. Chem. C. 116, 15108-15116 (2012).
- Sun, S., Zeng, H.
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of highly crystalline and monodisperse maghemite nanocrystallites without a size-selection process. J. Am. Chem. Soc. 123, 12798-12801 (2001).
- Herranz, F., Morales, M. P., Roca, A. G., Vilar, R., Ruiz-Cabello, J. A new method for the aqueous functionalization of superparamagnetic Fe 2 O 3 nanoparticles. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 215-222 (2008).
- Herranz, F., Morales, M. P., Roca, A. G., Desco, M., Ruiz-Cabello, J. A new method for the rapid synthesis of water stable superparamagnetic nanoparticles. Chem. Weinh. Bergstr. Ger. 14, 9126-9130 (2008).
- Herranz, F., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles conjugated to a grass pollen allergen and an optical probe. Contrast Media Mol. Imaging. 7, 435-439 (2012).
