Summary
マイクロ波技術は、アテローム性動脈硬化症のプラークの特徴付けのための酸化鉄ナノ粒子の非常に高速な合成を可能にします。ナノ粒子の外部側のアミノビスフォスフォネートの使用は、アテローム性動脈硬化症領域での高速蓄積を提供します。
Abstract
迅速かつ再現可能なマイクロ波駆動型プロトコルはネリドロネート官能化ナノ粒子の合成のために開発されました。疎水性ナノ粒子の合成から出発し、私たちの方法は、マイクロ波駆動の合成と熱分解法から適応に基づいています。新しい方法論は、従来の手順と比較して反応時間の減少を生成します。また、マイクロ波技術の使用は、臨床応用の観点から重要な何かを反応の再現性を向上させます。この酸化鉄ナノ粒子の新規性は、ネリドロネートの結合です。この分子の使用は、Caを提供し、ナノ粒子2+ vitroおよびアテロームプラークのin vivoでの選択的蓄積の結合特性の外側に向かってビスホスホネート部分をリードしています。プロトコルはorganiから初期合成以来、約3時間での合成およびプラークの検出を可能にしますC前駆体。 1時間未満でのアテローム性動脈硬化症の領域での蓄積は、臨床用途に特に適した造影剤を提供します。
Introduction
アテローム性動脈硬化症は、無秩序な脂質代謝不良炎症反応から生じる動脈壁の多因子の慢性炎症性疾患です。罹患率およびこれと関連する心血管疾患の経済的・社会的コストにナノテクノロジーは最も有望なの一つとなっている新しいツール、との病理に対処する上で関心が高まっている。1-3。しかし、高速の非常に少数の例があります診療所への変換のための基本であるプローブの産生および特徴4このプロトコルでは、我々はビスホスホネートとし、アポEにおけるアテローム性動脈硬化症のin vivo検出のさらなる官能化のために酸化鉄ナノ粒子のマイクロ波合成を使用する- 。/ - 。1時間のマウスを5酸化鉄ナノ粒子（IONP）はよく知られているナノ材料および磁気共鳴画像（MRI）用の造影剤としての使用の異なる疾患の検出のために確立されています最後の年での6-8
マイクロ波合成（MWS）は、高い再現性と強化された収率で非常に短い時間でナノ粒子を合成することができます。私たちのプロトコルでは9,10我々はプラークは3つのステップで機能を標的とするIONPを得ます。最後の一つは、そのカルシウム結合特性のために私たちの戦略の鍵であるアミノビスフォスフォネート、ネリドロネート、のアタッチメントです。それらの天然のアナログピロリン酸（PPI）のために、ネリドロネートは骨形成不全（OI）及び骨のパジェット病骨に対するそれらの高い親和性（PDB）の治療に使用されている。11-13
プロトコルの3つのステップが1ステップ1および2は、マイクロ波技術を用いて行われるスキームに要約されています。最初のステップは、公表された方法の修飾によって、オレイン酸被覆酸化鉄ナノ粒子（OA-IONP）を提供する。14プロトコルはtraditのマイクロ波合成に適応したものですional熱分解合成。15,16のFe（ACAC）3を含有する混合物、オレイン酸、オレイルアミン、1,2-ドデカンジオールをベンジルアルコールに溶解し、2つの加熱工程に供されます。精製をEtOHで洗浄し、上清中の界面活性剤の過剰を除去するためにNd-Fe-B磁石で粒子を収集が行われます。その後、OA-IONPをCHCl 3で安定化されます。非常に高速加熱に、予想されたように、予想される結果は、マイクロ波によって合成されたナノ粒子は、コア（3.7±0.8 nm）で、伝統的な熱分解と比較して、流体力学的サイズ（7.5 nm）との点で小さくなっていることを示しました。しかし、ナノ粒子は、依然として良好な結晶性を提示します。
第二段階は、我々のグループで開発したオリジナルの方法論は、MWの条件のために変更された、のKMnO 4のような強力な酸化剤を使用して、オレイン酸中に存在する二重結合の直接的な化学修飾、で構成されています。二重結合- 17第一段階はのMnO 4との間の複合体を形成しています。その後、酸性条件下での第二段階は、アゼライン酸IONPを与えるオレイン酸分子の切断を生成します。酸を中和するのMnO 2を、次いで水酸化ナトリウム1％ - 10分間それぞれのこれらの二つの段階の後、サンプルはのMnO 4の過剰を減少させるためのNaHSO 3の1％で精製し、最初の洗浄です。
精製工程、アゼライン-IONP後、10 mMリン酸緩衝液pH = 7.2で安定化されます。このバッファは、同様にオリジナルの、熱反応で起こったことへの粒子のコロイド安定性のための最高の環境です。18は、OA-IONPに含まれる二重結合の直接酸化のためのマイクロ波を使用することは利点の非常に良い例ですナノ粒子の合成は、この技術を使用します。反応は24時間を取る古典的な方法では、マイクロ波の利用はをReactiを減少させます18分までの時間に。また、マイクロ波駆動型プロトコルは、4回繰り返した後、流体力学的サイズの30±5 nmのでナノ粒子を与える優れた再現性を示しています。流体力学的サイズの変化離れて、ゼータ電位は素早く反応の成功を確認する良いパラメータです。アゼライン-IONPで新しいカルボキシル基の存在のために、ゼータ電位の値は、熱的なアプローチにより得られた値に24 -44 mVで、非常に類似しています。
アゼライン-IONPにネリドロネートの付着のために、伝統的なEDC /スルホ-NHS結合が使用される。この合成アプローチは、十分に確立されている19で活性化カルボキシレートを使用するので、スルホ-NHSは、反応中にコロイド安定性を確保します。リン酸緩衝液の除去は、ネリドロネートとの反応は、1mMのHEPES緩衝液中で行われた後（pH約7）。反応は狭いサイズ競合製品で40±4nmの流体力学的サイズとネリドロネート-IONPをレンダリングibutionとゼータ電位の-24.1 mVの。
この方法の実現可能性は、同じ条件を用いて、遊離アミンを持つ任意のペプチド/抗体の結合を可能にするが、手順は、T 2強調造影剤MRI内で異なる目的のために、動脈硬化性プラークのin vivo可視化のためのIONPの高速合成について記載されていますフィールド。
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Protocol
試薬の調製
- 100mlの蒸留水にHEPESの23.8ミリグラムを溶解させる1 mMのHEPESバッファーを準備します。 pHを7に調整します。
- 10％のNaHSO 3を 100mlの蒸留水にのNaHSO 3の10グラムを溶解準備します。 15分間混合物を撹拌しました。
- 水100mlに水酸化ナトリウム1gを溶解するのNaOH溶液を調製します。 10分間攪拌します。
- 水1LでのNaH 2 PO 4の600 mgの溶解10mMのリン酸緩衝液を準備します。リン酸注意深く0.34 mlを加え、30分間撹拌しました。 2.9（合格範囲2.7〜3.0）にpHを調整します。
- 1 Lの体積は7.2にpHを調整する作るためのNaH 2 PO 4の269 mgを、蒸留水へのNa 2 HPO 4の1.09グラムを溶解し、10mMのリン酸緩衝液を準備します。
オレイン酸コーティングされたナノ粒子（OA-IONP）の2.合成
- 電子レンジでフラスコは、Feの0.5グラム（ACAC）3、oleiの1.4ミリリットルを追加適応C酸、オレイルアミンの0.6ミリリットル及び1,2- hexadodecanediolの1.19グラム。卒業ピペットを用いてフラスコの壁を通して慎重フェニルエーテルの10ミリリットルを追加します。
- マイクロ波反応器中でフラスコを導入し、マイクロ波プロトコルを開始します。
注：電子レンジのソフトウェアは、温度、圧力、攪拌スピード、パワー、反応時間などのさまざまなパラメータの大きさを選択することができます。また、調整可能な合成を可能にする同一のプロトコルで三つの異なる段階をロードする可能性があります。ロードされた合成プロトコルが開始されると、マイクロ波は、（プロセスをランピング）できるだけ速くサンプルを加熱し、（プロセスを実行している）選択された反応時間の間にそれを維持します。電力の選挙は、ランピングの時間を決定します。 - 電子レンジで動的研究をロードします。プロトコルは3段階が含まれています。
- ステージ1：60℃、時間2分、圧力250 PSIおよび電力の150 Wまで温度を設定します。撹拌速度は上に高い位置と最大電力にしておく必要があります。
- スタッグE 2：200℃、時間20分、圧力250 PSIおよび電力の300 Wまで温度を設定します。撹拌速度は上に高い位置と最大電力にしておく必要があります。
- ステージ3：250℃、時間10分、圧力250 PSIおよび電力の300 Wまで温度を設定します。撹拌速度は上に高い位置と最大電力にしておく必要があります。
- プロトコルの終了後、フラスコを室温に冷却します。
注：プロセスは、ガス流の有無にかかわらず行うことができる冷却。いずれの場合も、同じ結果を提供します。凝集体はEtOHでそれを洗って、撹拌棒で、フラスコの壁に表示され、の三角の上にそれを置きます。 - ガラスピペットを使用しての三角に反応混合物を移し、エタノール98％の10ミリリットルを追加します。 、フラスコ以下のNd-NB-B磁石を入れて5分待ってからガラスピペットで上清を除去します。
- 、エタノールの10ミリリットルを追加2分および40 kHzのために室温でサンプルを超音波処理、磁石上にサンプルを置き、上清を除去します。 LEAで、この手順を繰り返します三回のt。
- 室温で5分間、40 kHzでの CHCl 3および超音波処理の30ミリリットル中のオレインナノ粒子を分散させます。製造元の指示に従ってゼータサイザーに流体力学的サイズを確認してください。ガラスキュベットにOA-IONPの0.5ミリリットルを入れし、CHCl 3の0.5ミリリットルを追加します。受け入れ範囲は7-10 nmのは、強度のZ平均サイズとして表現しました。
注記：OA-IONPヘキサンで十分に分散させることができます。
アゼライン酸ナノ粒子の3合成（アゼライン酸-IONP）
- CHCl 3（3：2ミリリットル）のKMnO 4の44.3 mgであり、H 2 Oの混合物でBTAClの150.4 mgの溶かします。マイクロ波適応フラスコ内のOA-IONPの5ミリリットルのアリコートに得られた溶液を追加します。
- アゼライン酸IONPためのマイクロ波プロトコルを開始します。 105℃の設定温度は、時間9分、300 W.での圧力250 PSIとパワーをフラスコにリン酸緩衝液pH = 2.9の10ミリリットルを入れ、マイクロ波プロトコルを繰り返します。冷却工程後、ナノ粒子を回収します磁石を使用して、上清を除去します。
- 、三角フラスコに10％のNaHSO 3の5ミリリットルを加え、25℃で2分間、40 kHzの超音波処理、磁石を用いて粒子を収集し、上清を除去します。 （ステップ2回繰り返した。）を1％NaOHを用いてナノ粒子を3回洗浄し、最後にリン酸塩緩衝液pHを5ml = 7.2で再分散させます。
- 流体力学的サイズとゼータ電位を確認してください。使い捨て折り畳まれたキャピラリーセルにアゼライン-IONPの0.7ミリリットルを入れて、ゼータサイザーにそれを挿入します。
注：強度のZ平均サイズとして表現nmのサイズ25-35の受け入れ範囲。 Z-潜在-45±5 mVでの受け入れ範囲。より大きなナノ粒子（約70nmの）をリン酸緩衝液pH> 7に代えてpH = 2.9（REF CHEMユーロJ 2008）を用いて得ることができます。
4.ネリドロネートナノ粒子の合成（ネリドロネート-IONP）
- アゼライン-IONP 2mlのアリコートと遠心分離機でEDCの12 mgであり、スルホNHS 15mgのを追加します。置きます35分間室温でボルテックスで混合。
- 、ナノ粒子を不安定に上清を吸引し、HEPES、1mMのをpH = 7の緩衝液1.5ミリリットルを有する粒子を洗浄するために遠心分離機の下に磁石を入れてください。 （このステップを2回繰り返します。）その後、ネリドロネート5mgを追加し、2時間ボルテックスで混合物を振ります。
- 1 mMのHEPES pH = 7に緩衝液を用いて磁石と洗浄（3×2ミリリットル）で区切りナノ粒子。最後に、1mMのHEPESでpH = 7の緩衝液2ミリリットルにネリドロネート-IONPを分散させます。
- 流体力学的サイズとゼータ電位を確認してください。使い捨て折り畳まれたキャピラリーセルにネリドロネート-IONPの0.7ミリリットルを入れ、（機器のセットアップを参照してください）ゼータサイザーにそれを挿入します。
注：強度のZ平均サイズとして表現nmのサイズ40-45の受け入れ範囲。 Z-潜在-20±5 mVのための受け入れ範囲。
アポEにおける動脈硬化プラークのin vivo検出5. - / - MRIによるマウス
- MRI取得のための準備
注：いくつかの例：動物実験のためのTRAシステムが必要とされています。このように、それは必要になります。- 動物を麻酔するために適切な装置を使用してください。
- 動物の安定した温度を維持するために外部の暖かい空気との緊密な回路循環温水システムを取得します。
注：この場合、MRI適合監視およびゲーティングシステムは、MRI磁石内部の動物の温度を登録します。 - 動物の近接性、動物の体内（直腸体温計）温度、MRIコンソールで統合されたインターフェースを使用して胸部に近い動物の体の下に位置する呼吸センサで外部温度を監視します。
- MRI実験
- 100％の酸素ラインを持つ（2または3分のMRI実験中のメンテナンスのための1から1.5パーセントの間、誘導のための2％）気化イソフルランで動物を麻酔。
- プロファイル取得の助けを借りて磁石の中心に動物を置きます。
- ステップ5.2.2の後、曲は300MHz（7 T）共振周波数にRFコイルと、最適な信号受信のための50オームへのコイルの特性インピーダンスと一致しています。
注：（私たちのケースでは、直交コイルであった）個別に送信コイルの各部分にアダプタ/スプリッタを経由して測定系に行く外部配線との接続に注意してください。 - コイルのチューニングと照合した後、スキャナにコイルを接続します。
- RFパルスのキャリブレーション（形状や長さ）と中心周波数調整のために手動で周波数のパルス校正とセンターの両方を実行します。手動で90°パルス較正、粗いシミング（下記参照）、中心周波数と受信機のゲイン調整を行います。
- アキシャル、コロナル、サジタル、とも呼ばれるtripilot：グラディエントエコー（FLASHまたはGRE）ローカライザースキャン（3面のスカウト取得を使用して正確な位置を実行します。
- CENで磁場均一性を最適化するために、磁石のシミングを行います磁石のター。 1または単一パルスFIDシーケンスを使用して（5.2.3を参照）この手順を手動で実行し、第一及び第二の注文シムを調整したり、システムに含まれる任意の自動シミングシーケンス
注：よくシム磁界が容易に認識およびT2 *で測定される（としてより大きな）またはスペクトルの狭いFWHM。
- プラーク5のMRIデータ集録
- 尾静脈に100μlのネリドロネートナノ粒子の（1 mgの[鉄]ミリリットル-1）を注入し、画像を1時間後に注射を獲得。腹部大動脈（腎分岐部）を見て動脈硬化性プラークのMRI取得のためのパラメータをロードします。
- アーティファクトを最小限にするために、インターリーブモードでマルチスライス、10〜20のスライスを入れてください。
- 小さな勾配コイル共同でFOV 60×30ミリメートル（冠状）、30×30ミリメートル（軸）、スライス厚0.8ミリメートル（：次のパラメータを使用して冠状又は軸方向視でT1強調MRIエコー高解像度高速スピンを獲得nfigurationこれは0.6ミリメートル）、400ミリ秒のTR、8ミリ秒のTE、5-8分の平均取得時間のための8（小勾配）信号の平均値に256×256の取得及び再構成行列データ、6（大きな勾配）に減少させることができます。
注：TEが特に重要とアプリケーションを制限することができ、血液信号と流量との化学シフトアーチファクトの存在です。これらの場合には鈍感な高速スピンエコーT2-IRを流すアーティファクトを低減するのを助けることができるとまったく同じ場所に相補データの取得は、プラークを特徴付けるために助けることができます。また、プリサチュレーションパルスは、外壁の境界と化学シフトアーチファクト低減の良好な描写のために動脈壁の周囲の脂肪組織を減少させるために使用することができます。 - 5：このようなダイコムとビュー適切なソフトウェア（医用画像データ官例えば OsiriXのイメージングソフトウェアまたはアミド）などの標準フォーマットを使用して画像を転送します。手動でVESを区切る造影効果の定量化SEL領域、壁の厚さ、内腔面積、プラーク負担5。
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Representative Results
このプロトコルでは、三つの異なるIONPの合成が記載されています。疎水性のOA-IONPから出発し、水性安定したナノ粒子は、マイクロ波駆動型合成の助けを借りて得られます。すべてのナノ粒子は、非常に狭いサイズ分布（ 図1c）で超小型流体力学的サイズ（DH <50 nm）を示しました。マイクロ波技術の使用は、コアサイズの点で超小型のナノ粒子をレンダリングします。電子レンジので高速加熱、ナノ粒子のコアに小さなサイズを与え、他の方法と比較して核の増加率を作り出します。 Fe 3 O 4コアに格子縞が明確に見られるTEM画像に示されているようしかし、粒子は依然として優れた結晶性を提示する（図1A、B）。方法の他の重要な態様は再現性です。アゼライン酸IONPの合成の4回繰り返した後、同じ結果流体力学的サイズ及び分布に（ 図1D）を得ました。
官能化した後、ネリドロネートナノ粒子内に存在するビスフォスフォネートによる結合特性のCa 2+のCa 2+の量が異なるこれらのナノ粒子をインキュベートチェックしました。 Ca 2+のないナノ粒子は我々の最初の仮説を準拠し、安定した（ 図1eのを ）のままであったことに起因ナノ粒子のクラスターの形成に直線のCa 2+の量およびインキュベーションの時間でそのT 2緩和時間の増分を示しました。
- / -マウスのインビボ MRI実験で 48週齢のApoEで行いました。頸動脈と腹部大動脈の基底画像が最初に撮影しました。アテローム硬化性プラークの形成に起因する病変を明らかに見ることができます。その後、100μlの（1 mgの[鉄]ミリリットル-1 図2）に示されるように、信号は、プラークを形成し、1時間後の注射は、基礎画像と比較して低強度です。 2つのROI（関心領域）の選択は、基礎と1時間後噴射画像間の比較のために、病変領域内の強度信号の定量化を可能にします。筋肉比プラーク（p <0.05、 図2b）、それらの間で有意に異なっています。
また、肝臓での信号は、強度の低下は血液中の循環時間によるものではなく、選択的蓄積によってかどうかを評価するためにネリドロネートナノ粒子の100μlを注射した後のマウスでモニターしました。グラフが示す（ 図2c）のように、ナノ粒子が完全に選択的蓄積を確認した20分後に循環から除去しました。動脈硬化性プラークに向けてネリドロネートナノ粒子の。ファイナルのex vivoイメージングおよび組織学を行いました。マウスを屠殺し、大動脈を抽出しました。ナノ粒子とすることなく大動脈のイメージングは、in vivo実験（ 図2d）と一致して、信号の違いを示しました。
スキーム1は： 合成手順は、DLSによって各ポイントでのプロトコルと基本的な特徴付けに続く。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図1：キャラナノ粒子のcterization（a）の TEM像、OA-IONPのための2つの倍率、で。 （b）は、ネリドロネート、IONPための2つの倍率でのTEM画像を、。 （c）のナノ粒子OA-IONP、アゼライン酸IONPとネリドロネート-IONPのための流体力学的サイズ。 （d）の四つの異なる合成時間とカルシウム濃度（refのTEMプロトコルの機能としてネリドロネート-IONPの溶液中でのT 2緩和時間の（e）の進化におけるアゼライン酸IONPのための流体力学的サイズ：NIST - NCL共同アッセイプロトコル、PCC-X、透過型電子顕微鏡を用いたナノ粒子のサイズを測定する）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：MRIデータプラークの（A） にアポEの生体内 MRI - / -ネリドロネート-IONP（下）の静脈内注射後（上）と1時間前にマウス。 （基礎）とネリドロネート-IONPの静脈注射後の1時間前に筋肉の相対的な信号強度への（b）のプラーク。 （c）のネリドロネート-IONPおよび（d）の注射後の異なる時点で筋肉の相対信号強度に肝臓2匹のマウスのための大動脈のex vivo画像、とナノ粒子5の注入なし。 大きいを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のバージョン。
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Discussion
酸化鉄ナノ粒子（IONP）最も重要なナノ物質の一つであり、それは、昔からの異なる用途に使用されてきました。磁気共鳴イメージング（MRI）用の造影剤としてのこれらの材料の使用は、十分に確立された分野です。しかし、合成の経路は、多くの場合、いくつかの時間がかかるし、設定が複雑です。劇的に反応時間を短縮し、再現性を高めるによるマイクロ波駆動型合成の使用は、高品質のナノ粒子を製造するための良い代替であると思われます。上述のプロトコルでは、マイクロ波技術は、二つの異なるナノ粒子の合成に使用されています。マイクロ波は、粒子の最終的な特性に影響を与えることができる主なパラメータの微調整を可能にします。記載された条件のいずれかが変更された場合、ナノ粒子の物理的特性が変化することに注意することが重要です。いくつかの化学物質は、合成手順中に使用されるので、purification個のステップは、高品質のナノ粒子を得るために重要です。
界面活性剤のOA-IONP過剰でナノ粒子に十分な安定性を得るために使用されます。合成後、3の精製工程は、それを削除することが必須です。アゼライン酸IONPの合成のために、二つの異なるマイクロ波段階が必要です。第2段階では、粒子の最終的なサイズは、生理的pHを使用して<（D hの大きい流体力学的サイズのpH = 2.9を使用して（50 nmの50 nm）の超小型IONP DのH）>から調整することができます。アゼライン酸IONPの精製において、使用される水酸化ナトリウムの量が重要です。 NaOHでの十分な量は、ナノ粒子を安定化するために添加されなければならない、しかし、あまりにも多くのNaOHを不安定な材料をレンダリングするナノ粒子から界面活性剤を脱着することができます。
一般的に、IONPは、主な欠点の一つである血液中の短い循環時間を有しています。造影剤としての使用のために、ナノ粒子は、CIRに必要所望の領域に到達するために血液中に十分な時間をculate。血中の循環時間を増加させる別のアプローチは、古典的に行われます。これらの戦略は、主に、その程度のナノ粒子の循環時間をペグ化部分の結合に基づいています。しかしながら、ネリドロネート、IONPの場合には、蓄積が非常に速く生成されます。アテロームプラークを標的とするナノ粒子上の生体分子としてアミノビスフォスフォネートの使用は、化合物のこれらの種類のカルシウム能力に基づいて、新しい概念です。時間未満で病変領域におけるその蓄積は、アテロームプラークに含まれるカルシウムの方のネリドロネート-IONPの高い親和性を示しています。
アテロームプラークの可視化のために、多くの高度なイメージング技術は、通常使用されます。これらの中でも、陽電子放出断層撮影（PET）及びMRIは、ほとんどの標準化された技術です。 PETによる高感度に機能情報の面で最高の結果を提供し、高解像度による解剖学的情報で最良の結果をMRI。 PETは合成プローブをたどるのに理想的な選択肢かもしれないが、小動物（〜1ミリメートル）で、この技術の解像度は、アテローム性動脈硬化病変に小さい石灰化を可視化するためのその使用を制限します。 MRIは優れた分解能（〜0.1μm）を提供する理想的な選択肢です。この技術の低い感度は、関心領域における造影剤の可視化を回避しないと良好な分解能は、小さな石灰化を識別することができます。また、結果は、MRIの高解像度のネリドロネート-IONPのユニークな高速蓄積の組み合わせは、小動物におけるアテロームプラークの検出のための理想的なシナリオであることを示しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microwave Explorer/Discover Hybrid-12 | CEM Corporation, USA | Any microwave for chemical synthesis can be used | |
| Disposable PD-10 desalting columns | GE Healthcare life sciences | 17-0851-01 | Any size exclusion column will work |
| Amicon®Ultra-0.5 ml | Merck Millipore Ltd | ||
| Calibrated pH meter | SI analytics | 285105127 | |
| Neodymium magnet | Aiman Gz | ND010B | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| ZetaSizer Nano ZS | Malvern Instruments | ||
| Standard (macro) cell Optical glass | Labbox | 11718 | |
| Zetasizer nanoseries disponsable folded capillary cells DTS1070 | Malvern | ||
| Bruker Minispec mq60 | Bruker |
References
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