Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Stamcelle-lignende Published: February 2, 2016 doi: 10.3791/53474
Automatic Translation
1,2,3,4
1Institut Curie, 2UMR 3387, CNRS, 3PSL Research University, 4Université Paris-Sud

Introduction

Den hvirveldyr nervesystem fremgår neuralpladen som et homogent lag af neuroepitelceller. Forstå, hvordan udviklingsmæssige programmer induceres, kodet, og etableret under en regionalisering af den neurale plade er på nuværende tidspunkt et vigtigt mål i udviklingsmæssige biologi. Sammenlignet med andre systemer, den eksperimentelt medgørlige Xenopus foster er en model af valg for at analysere tidlige trin i neural udvikling 1,2. Det er nemt at få et stort antal af embryoner, og ekstern udvikling giver adgang til de allerførste trin i neurulation 3. Mange værktøjer til rådighed til eksperimentelt manipulere Xenopus laevis (X. laevis) fosterudviklingen. Mikro-injektion af mRNA'er eller morpholinos (MO), herunder inducerbare MOS, sammen med biokemiske og farmakologiske værktøjer, giver mulighed for kontrolleret gevinst på funktion (GOF) og tab af funktion (LOF) og specifik ændring af signalveje 4,5. Blastocoel tag ectoderm, placeret omkring dyrets pol en blastula eller en meget tidlig gastrula embryo, og benævnt "Animal Cap (AC), er en kilde til pluripotente celler, som kan programmeres ved manipulation af genekspression før eksplantater forberedelse. I dette manuskript er detaljerede protokoller til at bruge X. laevis AC eksplantater at teste in vitro og in vivo molekylære mekanismer og cellulære processer underliggende neurale udvikling.

En teknik præsenteres, så fint observation af genekspressionsmønstre i en Xenopus haletudse neuralrøret, et indledende skridt i identifikationen af skæbnen bestemmelse stikord. Ud fra følgende betragtninger observation af flade monteret væv er almindeligt anvendt i studiet af kyllingeembryoer 6, det har ikke været korrekt beskrevet i Xenopus. Manipulation af genekspression ved at injicere syntetisk mRNA eller MO ind blastomererne på 2 eller 4-celle embryoer tillader programmering af ACexplanter 4. For eksempel inhibering af knoglemorfogenetisk protein (BMP) pathway ved ekspression af anti-BMP faktor Noggin, giver en neural identitet til AC celler 3. Protokollen er beskrevet til udførelse af lokal og tidsstyret eksponering af AC eksplantater til ydre signaler via direkte kontakt med en anionbytterharpiks perle. Endelig en teknik er beskrevet til test udviklingsmæssige funktioner i neurale stamceller in vivo ved transplantation af blandede eksplantater fremstillet ud fra forskellige programmerede celler dissocieres og re-associerede.

Frøen embryo er en kraftfuld model til at studere tidlige hvirveldyr neural udvikling. Ved at kombinere manipulation af genekspression eksplanteres in vitro kulturer indeholder vigtige oplysninger i studiet af neuroepithelium regionalisering, proliferation og morfogenese 7-12. Programmeringen af AC eksplantaterne tilladte udvikling af en funktionel hjerte ex vivo 13,14. Brugenaf eksplantatet podning 15 førte til identifikation af den minimale transskriptionskontakt inducere neural crest differentieringsprogram 16. Zona limitans intrathalamica (ZLI) er en signalering center, der udskiller sonisk pindsvin (Shh) for at kontrollere væksten og regionalisering af caudale forhjernen. Når kontinuerligt udsættes for Shh, neuroepitelceller co-udtrykke tre transkriptionsfaktor gener - barH-lignende homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) og Iroquois-3 (irx3) - erhverve to karakteristika ZLI rummet: kompetence til at udtrykke shh, og evnen til at adskille fra anteriore neurale plade celler. Som et modelsystem, vil induktion af en ZLI skæbne i neuroepitelcellerne præsenteres 8.

Disse protokoller til formål at give enkle, billige og effektive værktøjer til udviklingsmæssige biologer og andre forskere til at udforske den grundlæggende mechanisms af centrale neurale celle adfærd. Disse protokoller er meget alsidig og tillade undersøgelse af en lang række ydre og indre neurale beslutsomhed signaler. Den tillader langsigtet in vivo analyser af neurale slægt engagement, induktive interaktioner og celle adfærd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter overholder nationale og europæisk forordning om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål og med internationalt vedtagne principper om erstatning, begrænsning og forfining.

1. Fladskærms-montering af Xenopus laevis Haletudser Anterior Neural Tube Efter Whole-mount in situ-hybridisering

  1. Opnå X. laevis embryoner i henhold til standardprocedurer 4 og alder dem, indtil de når neurula stadie 26 og ældre (ifølge Nieuwkoop og Faber udviklingsmæssige tabel 17.
  2. Fix X. laevis haletudser ved at inkubere dem i en opløsning af 4% paraformaldehyd (PFA). Rock og rotere embryoner i et 2 ml hætteglas, 1 til 1,5 time ved stuetemperatur i trin 26 til trin 38 embryoner, 2 timer ved stuetemperatur i embryoner på senere trin.
    ADVARSEL: PFA er giftigt ved kontakt og en formodet kræftfremkaldende. Det skal manipuleres under en emhætte.
    BEMÆRK: En X. laevis kuld ernormalt fastgjort i en 2 ml hætteglas men en større hætteglas kan anvendes.
  3. Vask embryonerne i samme hætteglas under anvendelse af 1 x PBS med 0,1% Tween (PBT), 3 minutter ved stuetemperatur, to gange.
    BEMÆRK: Medmindre andet angive PBS anvendte med eller uden calcium og magnesium.
  4. Dehydrere embryoner i 100% methanol (MeOH) i mindst 12 timer ved stuetemperatur i samme hætteglas. Skift MeOH 100% mindst to gange under kølerhjelmen ved hjælp af en plastik mikropipette.
    BEMÆRK: MeOH bliver svagt gul som lipider opløst i det. Forsigtig MeOH er giftig ved indånding og skal manipuleres under en hætte.
  5. Rehydrere embryonerne anvender samme hætteglas gennem en gradueret række MeOH bade: MeOH 75% i PBS, MeOH 50% i PBS, MeOH 25% i PBS, PBS to gange, hvert bad 5-10 minutter ved stuetemperatur. MeOH løsninger er ændret under kølerhjelmen ved hjælp af en plastik mikropipette.
  6. Ved hjælp af en plastik pipette embryonet skal dissekeret i en 60 mm petriskål fyldt til toppen med PBT. Brug to fine pincet plejefuldt ud at fjerne øjnene ved at indsætte en fin pincet mellem øjne og neuralrøret, på niveau med den optiske stilk. Frigør øjnene fra det neurale rør. Indføre forsigtigt pincet under ectoderm overliggende neuralrøret. Med omhu, skrælle ectoderm startende fra bag hovedet og kassér den.
  7. Udfør en dobbelt eller enkelt ISH hjælp digoxigenin-mærket eller fluoresceinmærkede prober som tidligere beskrevet 18,19.
  8. Efter ISH overføre embryoner i en ny 60 mm petriskål fyldt til toppen med PBT med en plastik pipette.
  9. Brug fine pincet forsigtigt afmontere neuralrøret fra resten af ​​embryoet. På dette stadium, den forreste neuralrøret adskiller fra den bageste neuralrøret. Løsnes forsigtigt resterende dele af ektoderm overliggende neuralrøret, rygstrengen der løst tilknyttet nedenfor neuralrøret, de øre- vesikler og de resterende dele af mesoderm. Sørg for, at det neurale rør er blottet for eventuelle bilagpå dette tidspunkt.
    BEMÆRK: For at undgå at beskadige neuralrøret udføre alle neurale overføringsrøret / embryo med en plastik overførsel pipette eller en mikropipette om nødvendigt med et tip snit ved sin ende. Diameteren af ​​den spidse ende justeres til størrelsen af ​​neuralrøret.
  10. Overfør det dissekerede neurale rør (se note trin 1.9) i et 1,5 ml rør fyldt med 50% glycerol fortyndet i PBS. Vent, til de neurale rør er faldet til bunden af ​​glycerolopløsning, sædvanligvis O / N ved 4 ° C.
  11. Fjern opløsning af 50% glycerol / PBS under anvendelse af en mikropipette P1000 og tilføj i samme 1,5 ml rør en opløsning af 90% glycerol / PBS under anvendelse af en mikropipette P1000. Vent, til de neurale rør falde til bunden af ​​90% glycerol / PBS-opløsning, sædvanligvis O / N ved 4 ° C.
    BEMÆRK: til langtidsopbevaring, bruger 90% glycerol / PBS plus antibiotika for at forhindre bakteriel udvikling.
  12. Overfør neurale rør på en glasplade eller et objektglas med en plast transfer pipette.
  13. Dissekt de neurale rør langs dorsale og ventrale midlines hjælp wolfram nåle. Under dette trin holdes de neurale rør i 90% glycerol / PBS.
  14. Monter de to sider af neuralrøret i 90% glycerol / PBS ved hjælp af forstærkningsringe dækket med et dækglas.
  15. Fastgør dækglas med lak og holde ved 4 ° C.

2. Animal Cap eksplantater Induktion Brug anionbytterharpiks perler

  1. Overfør 100 ul anionbytterharpiks perler i en 2 ml rør under anvendelse af en mikropipette P1000. Vask perlerne mindst fem på hinanden følgende gange med sterilt destilleret vand. Give perlerne at sedimentere på bunden af ​​røret og erstatte sterilt destilleret vand under anvendelse af en mikropipette P1000. Rør ikke perlerne.
  2. Lad perlerne suge O / N i et 2 ml rør fyldt med sterilt destilleret vand med bovint serumalbumin (BSA) (10 mg / ml) ved 4 ° C.
  3. To timer før opsamling af ACs, sted halvdelen af ​​perlerne i en ny 1,5 mlrør under anvendelse af en mikropipette P1000. Erstatte sterilt destilleret vand med 500 pi af mediet indeholdende det molekyle der skal testes for sin induktive potentiale eller vides at fremkalde en specifik skæbne. Hold den anden halvdel af perlerne, da de vil blive anvendt som en negativ kontrol.
  4. Inkuber perlerne ved 4 ° C i mindst 2 timer.
  5. Udføre alle efterfølgende trin under stereomikroskop og udføre alle AC overførsel med en mikropipette.
  6. Overfør blastulaen eller meget tidlige embryoner gastrula i PBS med calcium og magnesium suppleret med 0,2% BSA ved hjælp af en plast transfer pipette.
    BEMÆRK: Embryoner udvikle ved 12 ° C rækkevidde blastula og gastrula stadier under 20 til 24 timer.
  7. Fjern fosterets vitellinmembranen med pincet som tidligere beskrevet 20. Fastgør foster med en pincet. Klem vitellinmembranen med den side af de andre pincet. Holder membranen, langsomt flå det af embryoet. Udfør denne procedure på ventrale (vegetabilsk) side af embryoet. Undgå at beskadige dyret side af fosteret.
  8. Isoler små ACs som tidligere beskrevet 21. Dyret pol er fosterets pigmenterede del. Ved hjælp af fine tænger skære en lille firkant af væv ud af dyret pol. AC væv indeholder kun de ektodermale celler. Sørg for, at vævet er af ensartet tykkelse. Hvis ikke, skal du fjerne AC fra analysen.
  9. Placer hver AC i en Terasaki flerbrøndsplader i 0,5x Modificeret Barths Saline (MBS) 4. Anbring AC ned i brønden med pigmenteret dyr nedad, i kontakt med det runde bunden af ​​brønden.
    BEMÆRK: belægning pipetter med en 0,1% BSA-opløsning forhindrer adhæsion af små stykker af klæbemiddel væv til plasten.
  10. Placer en vulst på hver hætte ved hjælp af en mikropipette P20. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge pincet til forsigtigt at placere perlen i midten af ​​hætten.
    BEMÆRK: Når dyppet i et konditioneret medium, perlerne farvet i pink. Vælg de fleste colored perler.
  11. Inkuber ved stuetemperatur (18 til 22 ° C) i 6 timer uden at flytte Terasaki flerbrøndspladen. Perlen klæber til AC i mindre end 2 timer.
  12. Placer Terasaki flerbrøndspladen oven på papir gennemvædet i vand. Dæk pladen med en plastbeholder.
    BEMÆRK: Denne "fugtighed kammer« forhindrer for tidlig fordampning af brøndene.
  13. Kultur for ACs i 0,5X MBS eller 3/4 NAM (se trin 4.1) i fugtigt kammer ved 15-20 ° C, indtil de søskende embryoner har nået den korrekte fase for at teste effekten af ​​din faktor.
  14. Fastgør ACs i 1 time i frisk fremstillet 4% PFA. Dehydrere ACs i 100% MeOH som tidligere beskrevet (trin 1.4).

3. Animal Cap Cell Dissociation og reaggregation Før Podning i en Xenopus laevis neurula

  1. Coat petriskåle (60 mm) eller 12-brøndsplader med 3% agarose i sterilt vand eller i PBS uden calcium og magnesium. Tilføj nok agarose til at dække bottom af petriskålen eller brønden. Pre-varme pladerne ved stuetemperatur (18-22 ° C). Eventuelt opbevares pladerne i par dage ved 4 ° C for at forhindre dehydrering.
  2. Forbered Calcium-fri Holtfreter s saltvand (60 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) og Holtfreter s saltopløsning (60 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA pH 7,6) 5. NB: opløsning af CaCl2 ikke kan autoklaveres.
  3. Fyld agarose-coatet godt til toppen med calcium-fri Holtfreter s saltvand.
  4. Forbered blastula eller meget tidlige embryoner gastrula at isolere deres ACs som tidligere beskrevet (trin 2.5 til 2.7).
  5. Isoler mindst 15 eller op til 30, små ACs 21. Ved hjælp af fine tænger skære en lille firkant af væv ud af dyret pol. AC væv indeholder kun ektodermale celler og er derfor af ensartet tykkelse. Hvis ikke, skal du fjerne AC fra analysen.
    BEMÆRK: Dyret pol er Embryo s pigmenteret del.
  6. Overfør ACs i en agarose-coatet godt fyldt til toppen med calcium-fri Holtfreter s saltvand. Placer ACs med deres pigmenteret side opad.
    BEMÆRK: dissociation starter hurtigt i calcium-frit Holtfreter s saltvand.
  7. Vent et par minutter for celler til at begynde at dissociere. Overhold dette gennem opdeling af væv. Brug af fine tænger, adskille det pigmenterede lag fra resten af ​​AC og kassere dem med en mikropipette P20. Komplet celle dissociationsprocessen indikerer adskillelse af celler fra hinanden.
    BEMÆRK: En eller to pigmenterede lag kan stå inden for re-aggregerede eksplantat at hjælpe visualisering under podning.
  8. Centrer cellerne ved hjælp af cirkulære bevægelser af pladen. Ved hjælp af en mikropipette P1000 omhyggeligt fjerne så meget medie som muligt. Pas på ikke at røre cellerne.
  9. Der tilsættes 1 ml Holtfreter s saltvand med calcium til brønden. Overfør dissocierede ACsi et 1,5 ml rør.
    BEMÆRK: 2 ml rør kan ikke anvendes på grund af deres runde bund.
  10. Pelletere cellerne ved centrifugering, 5 min ved en maksimal hastighed på 2.000 rpm i en bænk centrifuge (500 xg). Fjern forsigtigt supernatanten med en mikropipette P1000.
  11. Tilføj til dissocierede celler 20 pi Holtfreter s saltvand med calcium (60 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6) 5.
  12. Hold dissocieret ACs, 3 til 6 timer ved stuetemperatur (18-22 ° C).
    BEMÆRK: Dette er nødvendige tid for cellerne til at re-aggregat. Den re-aggregering ses som cellerne danner en lille kugle ved bunden af ​​røret.
  13. Frigør eksplantatet forsigtigt fra bunden af ​​glasset ved at tilsætte 1 ml 0,5X MBS eller med 1 ml 3/4 NAM (se trin 4.1). Overfør eksplantatet i en ikke-overtrukket plade ved hjælp af en plast transfer pipette.
  14. Stage eksplantaterne ved hjælp af deres kontrol søskende. For langsigtede brug kultur antibiotika: kanamycin (50 pg / ml), ampicillin (50 ug / ml) og gentamycin (50 ug / ml).

4. podning af Animal Caps Eksplantater i Neural Plade af X. laevis Embryo

  1. Forbered 3/4 NAM (110 mM NaCl, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 0,2x PBS, 50 pg / ml gentamycin). Må ikke holde i mere end 1 uge for dissektion og opbevares ved 4 ° C. Ældre NAM kan anvendes til fremstilling af agarose-coatet dissektion retter (nedenfor).
  2. Coat petriskåle (60 mm) med 3% agarose i 3/4 NAM, hvori små huller er foretaget ved hjælp af enten en silikone skimmel, eller dækning af en bordtennisbat.
    BEMÆRK: agarose dækker bunden af ​​petriskål. Efterlad noget plads, så petriskålen at fylde med 3/4 NAM. Alternativt gør dissektion retter med ikke-tørring modellervoks. Inden leret, klemme embryoner lidt under dissektion procedure. Grave små huller iagarose hjælp afrundede pincet Denne "dissektion fad 'hjælper til at holde embryoner under dissektion procedure.
  3. Saml dissektion værktøjer: plast overførselspipetter, en 'øjenbryn kniv' (lavet med øjenbryn hår indlejret i paraffin på spidsen af et glas Pasteur-pipette) 22, to fine dissektion pincet, P1000 mikropipette og tips, en stereosmicroscope med forstørrelse 8-40X, en lys lyskilde med optiske fibre guider. Hold alle dissekere værktøjer ren; efter hvert forsøg, skyl dem to gange med destilleret vand, en gang med 100% ethanol og lad tørre. Opbevares væk fra støv og evt autoklave metal Dissecting værktøjer.
  4. Lad dissocierede og re-aggregeret ACs (protokol 3), og deres søskende X. laevis embryoner udvikler indtil de når stadie 13 (neurula) i henhold til Nieuwkoop og Faber udviklingsmæssige tabel 17. Til transplantation i det neurale plade etape 13 at iscenesætte 15 embryoner anvendes.
  5. Udfør alleefterfølgende trin under stereomikroskop.
  6. Ved hjælp af en plastik overførsel pipette embryoner i PBS med calcium og magnesium suppleret med 0,2% BSA. Fjern fosterets vitellinmembranen som tidligere beskrevet 20. Fastgør foster med en pincet. Klem vitellinmembranen med den side af de andre pincet. Holder membranen fast, langsomt flå det af embryoet.
    BEMÆRK: Gør denne procedure på den ventrale (vegetabilsk) side af embryoet. Undgå at beskadige embryoner neurale plade. Hvis embryoner er blevet beskadiget under fjernelse trin vitellinmembranen, overføre embryoner i en 60 mm petriskål indeholdende 3/4 NAM ved hjælp af en plastik overførsel pipette og vente 15 minutter, en tilstrækkelig tid til helingsprocessen at forekomme.
  7. Udfyld dissektion fad til toppen med frisk 3/4 NAM.
  8. Ved hjælp af en plastik overførsel pipette overføre embryoner uden deres vitellinmembranen i dissektion fad. Placer embryoner dorsalsiden op ibrøndene. Under overførslen ikke tillader embryonet at komme i kontakt med luft-væske grænsefladen siden X. laevis lyseres ved overfladespænding.
  9. Overfør AC eksplantation skal podes ind i dissektion plade ved hjælp af en plastik overførsel pipette eller en mikropipette P1000. Når pipetten er inde væsken, give eksplantaterne langsomt synke ned ved hjælp af tyngdekraften, eller skubbe meget forsigtigt.
  10. Vedligehold embryoner med afrundede pincet. Med øjenbrynet kniv lave et snit i den neurale plade, hvor du har til hensigt at pode dit eksplantat brik.
    BEMÆRK: På trin 14 den forreste bøjning af neurale plade kan bruge som en milepæl, det markerer diencephalon område (Figur 4).
  11. Klip et lille stykke af neuroepithelium, ved hjælp af afrundede pincet og et øjenbryn knive. Skær et lille stykke af eksplantatet med øjenbrynet kniv.
    BEMÆRK: stykke eksplantatet bør være omkring den samme størrelse og form som neuroepithelium ablateret område. Placer stykke eksplantatet ind i neuroepithelium snit ved hjælp af øjenbryn kniv og fine pincet. Sørg for, at eksplantatet hurtigt tillægger fosteret.
  12. Alternativt lægge et stykke dækglas på den substituerede embryo at opretholde transplantatet på plads. For at gøre dette, klippe et fint dækglas i meget små stykker ved hjælp af grove pincet. Sørg for, at størrelsen er ca. 1,5 mm 2. Fordyb stykkerne i en petriskål indeholdende 3/4 NAM eller PBS ved hjælp af pincet. Vælg et stykke glas større end embryonet at undgå at beskadige det. Embryoet vil være lidt fladtrykt.
  13. Vent i mindst 30 minutter uden at flytte, eller kun flytte dissekere pladen forsigtigt. Lad embryo restituere i 30 minutter til 2 timer og fjern forsigtigt dækglasset evt. Pipette forsigtigt de podede embryoner i en ren skål fyldt med 3/4 NAM, ved hjælp af plastik overførsel pipette.
    BEMÆRK: Grafted embryoner tendens til at udvikle bakterier eller svampe forurening. For langsigtet cULTUR bruge antibiotika: kanamycin (50 ug / ml), ampicillin (50 ug / ml) og gentamycin (50 ug / ml).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Baseret på morfologiske overvejelser i forskellige arter, embryologiske manipulationer, og ekspressionsmønsteret for regulerende gener besidder en konceptuel model, neuralpladen er opdelt i tværgående og langsgående segmenter, der definerer en udviklingsmæssig gitter generere forskellige histogenic felter. I den neurale plade, er det primordier af forhjernen, midthjernen, baghjerne og rygmarv alle allerede etableret langs antero-posterior (AP) akse under gastrulation (revideret i 23-25). Under neurulation kan histogenic felter påvises som rumligt begrænsede domæner af genekspression. Baseret på ekspressionsmønstre for regulerende gener, er forhjernen primordium opdelt i seks tværgående segmenter, der genererer forskellige histogenic felter kaldes prosomeres (p). Hver prosomere er opdelt i en ventral (basal) og en dorsal (alar) del (gennemgået i 26,27). I padder, det prosomere 2(p2) giver anledning til epithalamus og thalamus og dets arrangør Z ona L imitans jeg ntrathalamica (ZLI) 8 (revideret i 28,29).

På figur 1 er vist den faste montering af X. laevis og X. tropicalis anterior neurale rør på trin 30, 32 og 35 efter WM-fad. WM-ISH blev udført ifølge protokollen 1 under anvendelse af prober for de transkriptionsfaktorer fezf2 som markerer telencephalon og P3, barhl2 der markerer P2 kortikale kanter og midthjernen, Iroquois-1 (irx1) og Iroquois-3 (irx3), der henholdsvis mark caudale P2 og Alar P2 og for morfogenet shh der markerer ZLI, den basale forhjerne og midthjernen (figur 1E). En sammenlignende analyse af de forskellige genekspressionsmønstre viser, at den forreste grænse af barhl2 p2 ekspression ligger an mod den kaudale grænse for fezf2 ekspression i P3 (figur 1A). Irx3 co-udtrykkes med shh i fremtiden ZLI (figur 1B). Inde p2 irx1 ekspression domæne er komplementær til shh (figur 1C) 8. Ekspressionsmønsteret for barhl2 i X. tropicalis på stadium 35 er vist i figur 1D. Et skematisk diagram af udtrykket områder af disse gener i udviklingen amfibiedyr forhjerne er tilvejebragt i figur 1E.

Anvendelse af protokol 2 evne anionbytterharpiks perler gennemvædet med Shh til at inducere ekspression shh blev undersøgt i tiltrædende landes eksplantater. X. laevis embryoer blev injiceret i de 4 dyr blastomerer på 4 og 8-celler scenen med mRNA'er der koder for den forreste neuroepitel inducer noggin sammen med barhl2, oTX2, irx3 og GFP som en injektion sporstof. Udtrykket af anti-BMP faktor Noggin hæmmer BMP-vejen og giver en neural identitet til AC celler 3. Vi henviser til AC udtrykker Noggin som Anteriorised Animal Cap (AAC). Blastocoel tag eksplantater blev fremstillet som beskrevet i protokol 2. AACS blev dyrket i 48 timer ved 18 ° C i kontakt med en anionbytterharpiks perle gennemvædet med en konditioneret medium (CM) indeholdende eller ikke, det udskilte N-terminale del af morfogenet sonic hedgehog fra rotter (N-Shh). Ekspressionen af endogene shh blev analyseret ved ISH (figur 2). Ekspression af Xenopus shh (Xshh) påvises i celler i kontakt med perlen dyppet i CM med N-Shh, men ikke i celler i kontakt med perlen dyppet i CM uden N-Shh (figur 2B).

Anvendelse af protokol 3 evne forskellige celletyper at adskille fra en anothER blev undersøgt. X. laevis embryoer blev injiceret i de 4 dyr blastomerer på 4 og 8-celler scenen med mRNA'er der koder for noggin med eller uden otx2, barhl2 og irx3, som anført, ved anvendelse af ßGal eller Gfp som sporstoffer (figur 3A). Stage 8/9 ACs dissocieret og re-aggregeret at generere eksplantater sammensat af blandede neuroepitelceller indeholder både ßGal- og GFP-udtrykkende celler. De reaggregated eksplantater blev dyrket i 48 timer ved 18 ° C. ßGal aktivitet blev afsløret i røde ifølge 30 (figur 3A). Opførslen af ​​celler blev observeret ved at følge deres lokalisering inden de genindførte aggregerede eksplantater. I eksplantater hvor AACS celler blandet med AACS celler, der udtrykker Otx2 (rød), skal du gøre ßGal-udtrykkende celler ikke adskille fra GFP-udtrykkende celler begge typer af celler blandet frit (figur 3b, 3c). I modsætning hertileksplantater hvor Otx2-udtrykkende celler (GFP) blandes med Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) udtrykkende celler (ßGal), de ßGal-udtrykkende celler (rød) danner sammenhængende patches og ikke spredes ensartet inden for re-aggregerede eksplantat ( figur 3D, 3E).

Ved hjælp af protokol 4, blev opførslen af programmerede AC celler undersøgt in vivo. X. laevis embryoer blev injiceret i de 4 dyr blastomerer på 4 og 8-celle etaper med mRNA'er der koder for noggin med otx2 enten alene eller sammen med barhl2 og irx3. ßGal blev anvendt som sporstof. Sideløbende hermed blev embryoner injiceret med tilsvarende mRNA'er koder for noggin og det udskilte N-terminale del af morfogenet shh fra rotter (N-shh). På scenen 8/9, blev AC eksplantaterne dissocieret og straks re-aggregeret at generere blandede eksplantater sammensat af neuroepithelial celler, der enten udtrykker N-Shh og Otx2, eller udtrykker N-Shh og Otx2, Barhl2 og Irx3 (BOI3). Små stykker af de blandede eksplantater blev transplanteret ind i det neurale plade af X. laevis embryoner i trin 14. De podede celler blev mærket med ßGal farvning (rød). Ved trin 35 ekspressionen af endogene shh blev analyseret ved ISH. Når de er podet ind i det forreste neurale plade af X. laevis embryoner, blandede eksplantater sammensat af BOI3 og N-Shh udtrykkende celler udviklet to funktioner specifikke for ZLI celler: de podede celler udtrykte Xshh og adskilt fra forreste neuroepitelceller (figur 3C). I modsætning hertil, når blandet eksplantater sammensat af Otx2 - og N-Shh- udtrykkende celler podes i X. laevis neurale plade, har de podede celler ikke udtrykke shh og ikke adskille fra deres naboer (figur 3B) 8.


Figur 1. Flade monteret neurale rør fra X. laevis og X. tropicalis embryoner hel-mount dobbelt ISH (A - D). WM-ISH udføres ved hjælp af fezf2, barhl2, irx1, irx3 og shh som prober på (A - C) X. laevis embryoner på trin 30, 32, og 35 og (D) X. tropicalis embryo i trin 35 som angivet. De neurale rør af repræsentative embryoner dissekeres og flad monteret som beskrevet i protokollen 1. dissekerede neurale rør er vist fra et sidebillede, dorsal up, anterior venstre. Markørerne og faser er angivet. Rostral og caudale grænser p2 er angivet med pile. (AC) Målestokken står for 0,5 mm. (D) SCale bar står for 0,1 mm. . (E) Skematisk af forhjernen markører på st.30 barhl2 udtryk domæne er angivet i skraverede linier; Områder udtryksformer er vist for fezf2 (lyserød), shh (rød), irx3 (gul) og irx1 (grøn). p står for prosomere. Pinealkirtlen placeret på toppen af p2 vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Induktion af shh udtryk i programmerede eksplantater via kontakt med anionbytter harpiksperler. Små ACs er fremstillet af embryoner injiceret med mRNA, der koder for noggin, barhl2, otx2, og irx3, med GFP som sporstof. AAC står feller Anteriorised Animal Cap. Aac eksplantater, der udtrykker Barhl2, Otx2 og Irx3 (AAC BOI3) dyrkes i 48 timer i kontakt med en kugle gennemvædet med en konditioneret medium (CM) enten indeholdende N-Shh, eller ej, som angivet. Eksplantaterne analyseres ved ISH for ekspressionen af Xenopus (X) shh. Skalaen bar står for 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Analyse af celle adskillelse adfærd i genindførte aggregeret eksplantater. (A)   X. laevis embryoner injiceres med mRNA, der koder for noggin, otx2, barhl2 og irx3 som angivet. ßGal og GFP anvendes som sporstof. På trin 8/9 små ACs er forberedt , Dissocieret og re-aggregeret at generere eksplantater lavet af GFP / ßGal blandede celletyper. Eksplantaterne dyrkes i 48 timer ved 18 ° C og ßGal aktivitet er afsløret (rød). (B - E) Repræsentative eksplantater sammensat af blandede celler, som udtrykker proteiner som indikeret er vist. AAC står for Anteriorised Animal Cap. (B, C) ​​ACS celler, der udtrykker Noggin og Otx2 (ßGal) fordelt tilfældigt, når de blandes med AKS celler, der udtrykker Noggin (GFP). (C) forstørret billede af (B). (D) AACS celler, der udtrykker Barhl2, Otx2 og Irx3 (BOI3) (ßGal) omgrupperede og adskilt fra AACS celler, der udtrykker Otx2 (GFP). (E) forstørret billede af (D). (B, D) Målestokken står for 0,5 mm. (C, E) Målestokken står for 0,2 mm.g "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Programmeret eksplantater udstille deres udvikling funktioner, når podning i neurale plade af en scene 14 embryo (A) Eksperimentel ordning:. AAC er fremstillet af embryoner injiceret med mRNA som angivet. På trin 8/9 celler fra taget af blastocoel dissocieres og re-aggregeret at generere eksplantater fremstillet af blandede celletyper udtrykker ßGal (rød). Eksplantaterne dyrkes, indtil deres søskende nåede fase 14. Et lille stykke af blandet eksplantatet (grøn rektangel) sættes i et snit i den forreste neuralpladen. Betjenes embryoner dyrkes indtil scenen 35. drives embryoner analyseres ved WM-ISH hjælp X. laevis shh (Xshh) som probe. ßGal aktivitet er åbenbaret i rødt according til 30. (B, C) ​​De podede sider af scenen 35 repræsentative neurale rør er vist, side udsigter, dorsal op, forreste venstre. (B) podet med blandede AAC udtrykker Otx2 og N-Shh. (C) podet med blandede AAC udtrykker Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) og N-Shh. Transplanterede celler er angivet med en rød stjerne. Den lyserøde stjerne angiver den potentielle diencephalon. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neural udvikling orkestreret af et komplekst samspil mellem cellulære udviklingsmæssige programmer og signaler fra de omgivende væv (Anmeldt i 3,31,32). Her beskriver vi et sæt protokoller, der kan anvendes i X. laevis embryoner til at udforske ydre og indre faktorer involveret i neurale skæbne beslutsomhed og neurale morfogenese in vitro og in vivo. Disse protokoller kan anvendes som sådan på X. tropicalis embryoner dog X. tropicalis embryoner er fire gange mindre derefter X. laevis embryoner. Både tangen og wolfram nåle, der anvendes behovet for at være finere. Når det er muligt, skal du bruge X. laevis.

Præcis visualisering af X. laevis og X. tropicalis neurale histogenic felter kan opnås ved anvendelse af den histologiske flade montering af dissekerede neurale rør fra WM ISH. Denne teknik blev udført med succes på X. laevis embryoner fra scenen 26 tilstadie 45 (figur 1) og på X. tropicalis embryoner fra scenen 30 til fase 45 8,33. Ældre embryoner er lettere at dissekere derefter yngre embryoner. Denne teknik er let at udføre. Den tillader analyse af genekspression mønstre hver for sig eller tilsammen, på neurale rør på forskellige udviklingsstadier. Med denne protokol er det let at sammenligne den ene side af en neuralrøret med den anden. Dette er meget nyttigt i Xenopus GOF og LOF eksperimenter. De fejl observeret på den injicerede side af neuralrøret kan sammenlignes direkte med normale udviklingsmæssige begivenheder observeret om kontrol side. Denne strategi har været anvendt til at analysere GOF og LOF fænotyper i X. laevis embryoner 8,33. Et vigtigt skridt i denne protokol er den korrekte fiksering af de embryonale væv. En ufuldstændig fastgørelse forhindrer effektiv frigørelse af ektoderm fra neuralrøret. Præ-dissektion af neuralrøret letter indtrængningen af i situ prober. Men når isoleret, er det let at miste de neurale rør. Det er tilrådeligt at holde en del af embryoet under ISH procedure for at forebygge tab.

De embryoner til alle disse forsøg skal være robust og har brug for at helbrede godt. Kassér enhver batch af usunde embryoner. For at dissekere ACs og podede eksplantater mellem trin 13 og trin 15 er det muligt at dyrke X. laevis eksplantater og embryoner ved forskellige temperaturer (fra 12-18 ° C og 18-20 ° C). Bemærkelsesværdige X. laevis embryonale celler indeholder nok æggeblomme til at tillade deres overlevelse i flere dage uden tilsætning af nogen ekstern næringsstof. For at ikke beskadige embryonale væv, enhver procedure af embryo, AC, eller eksplantat overførsel, som skal gøres omhyggeligt. Det er tilrådeligt at bruge enten en plastik overførsel pipette eller mikropipette om nødvendigt med et tip snit ved sin ende. Diameteren af ​​den spidse ende justeres til størrelsen af ​​embryonet eller størrelsen af ​​eksplantatet, der skal overføres.Det er værd at bemærke, belægning pipetter med en 0,1% BSA-opløsning forhindrer adhæsion af små stykker af væv til plasten.

AC eksplantater kan programmeres via tvungen genekspression eller ved udsættelse for ydre faktorer på en tids- og rum-kontrolleret måde. Vi beskriver en teknik tillader lokal induktion via direkte kontakt mellem en eksplantat og en perle. Hvis det er nødvendigt perlerne kan yderligere fragmenteret med en pincet. Sammenlignet med andre tidligere beskrevne strategier, denne teknik tillader afprøvning af lokale induktion med rene faktorer, alene eller i kombination, på en præcis tidsvindue.

Ved hjælp af en tidligere beskrevet fremgangsmåde celledissociering og reassociation 34, er det muligt at undersøge cellemotilitet kapacitet, cell segregation adfærd, og dannelse af rum grænser i klemt og blandet AC eksplantater 8. Celledissocieringsopløsningen starter på mindre end 15 min. Undgå Shaking pladen under dissociationstrinnet at forhindre tab af celler. AC pigmenterede lag ikke dissocierer godt. Det anbefales at fjerne dem under dissociation trin. Et par AC pigmenterede lag efterlades i re-aggregerede eksplantation. Det hjælper med at visualisere transplantatet. Det ikke interfererer med analysen på senere udviklingsstadier.

I dette manuskript en protokol til transplantation blandede eksplantater i et neuralt pladen er detaljeret. I Xenopus embryoner, den neurale plade er åben mellem stadie 13 og scene 15. Disse stadier er derfor hensigtsmæssigt til transplantation i neuroepithelium. X. laevis væv klæbende egenskaber ændres med tiden. Det er vigtigt at pode AC eksplantater i en vært på et tilsvarende udviklingstrin. Ved tidlige udviklingsstadier, X. laevis embryoner dyrkes i 3/4 NAM reparation ekstremt hurtigt. Hvis nogle embryoner er blevet beskadiget under fjernelse af vitellinmembranen kan det være nyttigt at vente 15 min,hvilket er den nødvendige tid til helingsprocessen at forekomme. Insertion kan blive begunstiget ved at sætte et stykke dækglas på den substituerede værtsvævet, men det er ikke et krav. Den kraft, der genereres af helingsprocessen kan ekstrudere de podede celler. Morfologi af værtsembryo bevares bedre, når implantatet tvinges ind i det med ydre tryk, som med et dækglas. For at vurdere succesen af ​​transplantatet, kan et fluorescerende sporstof injiceres i eksplantaterne. Tilstedeværelsen af ​​fluorescerende celler i den podede embryo kan visualiseres indtil neuralrøret lukker. Den største ulempe i AC kultur og -transplantation eksperimenter er frekvensen af ​​bakterier eller svampe forurening. Brug rene eller sterile materiale og sterile opløsninger så ofte som muligt for at undgå parabol forurening på alle trin i protokollen. For langsigtet kultur af podede embryoner altid bruge antibiotika og en temperatur på 15 ° C. Undgå længerevarende kontakt med AC eksplantater eller embryoner med agarose. Vi ligeholdeed, at det kan formindske den forventede levetid for eksplantatet. Podningen teknik er stærk, men tidskrævende. Det er ikke tilrådeligt at screene for skæbnen beslutsomhed tidskoder med det, men at erhverve tilstrækkelige oplysninger om dit væv af valg på forhånd.

Ved siden af sine traditionelle fordele, de seneste genetiske fremskridt i Xenopus åbnede vejen for dette modelsystem til at udforske gen regulatoriske netværk ved hjælp af storstilet genomisk analyse af dyb RNA sekventering og Chromatide Immunpræcipitation-sekventering (chip-seq) 5,35. Der er fremragende RNAseq og Chip-Seq henvisning datasæt, der dækker tidlig fosterudvikling. En af chippen-seq analyse ulemper er behovet for at indsamle stor mængde materiale. Programmering af AC eksplantater tillader fremstilling af en stor mængde af en specifik nervevæv, og i det mindste delvist, hjælper til at overvinde denne tekniske grænse.

De udviklingsmæssige programmer underliggende neurale rør orgelogenesis er stort set bevaret, især i hvirveldyr. Oplysninger erhvervet ved hjælp af padder hjælper i forståelsen af cellulære og molekylære processer bag hvirveldyr udvikling 25,32,36-38. Nylige fremskridt inden for induceret pluripotente stamceller (iPSCs) har åbnet op gateways for forskning i regenerativ medicin og lægemiddelforskning. iPSCs er programmeret fra somatiske celler under anvendelse af en kombination af transkriptionsfaktorer. Søgningen af ​​programmering stikord til stamceller er i gang. Assayene beskriver her give et middel til at generere neurale-afledte celletyper in vitro, der kan anvendes i lægemiddelscreening. De giver også en billig og hurtig måde at teste for neurale skæbne determinanter, der kan anvendes til yderligere omprogrammering af iPSCs 39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde VWR  20909.290 Toxic
anion exchange resin beads Biorad 140- 1231
Bovine Serum Albumin  SIGMA A-7888 For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine  GIBCO 15751-045  antibiotic
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906  for bead preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
  2. Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
  3. Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
  4. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  5. Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
  6. Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
  7. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
  8. Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
  9. Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
  10. Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
  11. Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
  12. Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
  13. Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
  14. Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
  15. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
  16. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
  17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  18. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
  22. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
  23. Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
  24. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  25. Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
  26. Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
  27. Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
  28. Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
  29. Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
  30. Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
  31. Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
  32. Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
  33. Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
  34. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
  35. Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
  36. Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
  37. Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
  38. Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27 (2013).
  39. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
  40. Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).

Tags

Developmental Biology Developmental Biology, Embryo neurale graft segregation rum Sonic Hedgehog forhjernen stængel iPSC
Stamcelle-lignende<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Eksplantater at studere Tidlig Neural Udviklingsmæssige Egenskaber<em&gt; In vitro</em&gt; Og<em&gt; In vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Durand, B. C. Stem cell-like… More

Durand, B. C. Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (108), e53474, doi:10.3791/53474 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter