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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Stem Cell-like Published: February 2, 2016 doi: 10.3791/53474
Automatic Translation
1,2,3,4
1Institut Curie, 2UMR 3387, CNRS, 3PSL Research University, 4Université Paris-Sud

Introduction

Le système nerveux des vertébrés émerge de la plaque neurale comme une couche homogène de cellules neuro-épithéliales. Comprendre comment les programmes de développement sont induites, codés, et établis au cours de la régionalisation de la plaque neurale est, à l'heure actuelle, un objectif majeur en biologie du développement. Par rapport à d'autres systèmes, l'embryon de Xenopus prêtent expérimentalement est un modèle de choix pour l'analyse des étapes précoces de développement neural 1,2. Il est facile d'obtenir un grand nombre d'embryons, et le développement externe donne accès aux toutes premières étapes de la neurulation 3. De nombreux outils sont disponibles pour manipuler expérimentalement Xenopus laevis (X. laevis) de développement embryonnaire. Micro-injection d'ARNm ou morpholinos (MO), y compris OM inductibles, ainsi que des outils biochimiques et pharmacologiques, permet gain de fonction (GOF) et la perte de fonction (LOF) et altération spécifique des voies de signalisation 4,5 contrôlé. Le blastocoel toit ectoderme, situé autour du pôle animal d'une blastula, ou une gastrula embryon très tôt, et désigné comme le «Cap animale» (AC), est une source de cellules pluripotentes qui peut être programmé par la manipulation de l'expression génique avant explants préparation. Dans ce manuscrit sont des protocoles détaillés pour utiliser X. explants laevis AC pour tester in vitro et in vivo mécanismes moléculaires et cellulaires de développement processus neuronal sous-jacent.

Une technique est présentée, permettant l'observation fine de profils d'expression génique dans un tube neural têtard de Xenopus, une étape préliminaire dans l'identification de la détermination du destin des indices. Considérant que l'observation des tissus plates-montée est couramment utilisé dans l'étude des embryons de poulet 6, il n'a pas été correctement décrit dans Xenopus. Manipulation de l'expression génique par injection d'ARNm synthétique ou MO dans les blastomères de 2 ou 4 embryons au stade de la cellule permet la programmation de l'AC4 explants. Par exemple inhibition de la voie Bone Morphogenetic Protein (BMP) par l'expression du facteur anti-BMP noggine, donne une identité à des cellules neurales AC 3. Le protocole est détaillé pour la réalisation d'une exposition locale et contrôlée dans le temps des explants AC aux signaux extrinsèques par contact direct avec une perle de résine échangeuse d'anions. Enfin, une technique est décrite pour tester des fonctionnalités de développement de progéniteurs neuronaux in vivo par la transplantation d'explants mixte préparé à partir de cellules distinctes programmé dissociées et ré-associés.

L'embryon de la grenouille est un modèle puissant pour étudier le développement neural vertébrés tôt. Combinant manipulation de l'expression génique pour explantation des cultures in vitro fournit des renseignements importants dans l'étude de neuroépithélium régionalisation, la prolifération et la morphogenèse 7-12. La programmation des explants AC permis le développement d'un cœur fonctionnel ex vivo 13,14. L'utilisationexplant de greffage 15 a conduit à l'identification de l'interrupteur de transcription induisant minimal du programme de différenciation de la crête neurale 16. Le limitans zona intrathalamica (ZLI) est un centre de signalisation qui sécrète sonic hedgehog (Shh) pour contrôler la croissance et la régionalisation du cerveau antérieur caudale. Lorsque permanence exposé à Shh, les cellules neuro co-exprimant le facteur trois gènes de transcription - Barh-like Homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) et Iroquois-3 (irx3) - acquièrent deux caractéristiques du compartiment ZLI: la compétence pour shh exprimer, et la capacité à séparer à partir de cellules de la plaque neurale antérieure. En tant que système modèle, l'induction d'une destinée neuro-épithéliales dans des cellules ZLI sera présenté 8.

Ces protocoles visent à fournir, et des outils efficaces simples et bon marché pour les biologistes du développement et d'autres chercheurs pour explorer le mec fondamentalehanisms de comportements clés de cellules neurales. Ces protocoles sont très polyvalents et permettent à l'enquête sur une large gamme de extrinsèques et intrinsèques détermination signaux neuronaux. Il permet long terme dans l'analyse in vivo de l'engagement de la lignée de neurones, les interactions inductives et les comportements cellulaires.

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Protocol

Des expériences sont conformes à la réglementation nationale et européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et aux principes établis à l'échelle internationale de remplacement, de réduction et de raffinement.

1. plat montage des têtards de Xenopus laevis antérieure Neural Tube Après totalité montage hybridation in situ

  1. Obtenir X. laevis embryons selon les procédures standard et les 4 vieillir jusqu'à ce qu'ils atteignent neurula étage 26 ans et plus (selon Nieuwkoop et Faber tableau de développement 17.
  2. Fix X. laevis têtards en les incubant dans une solution de paraformaldehyde à 4% (PFA). Roche et faire tourner les embryons dans un flacon de 2 ml en verre, de 1 à 1,5 heure à température ambiante pour l'étape 26 à l'étape 38 embryons, 2 heures à température ambiante pour les embryons à des stades ultérieurs.
    ATTENTION: PFA est toxique par contact et soupçonné d'être cancérigène. Il doit être manipulé sous une hotte.
    REMARQUE: One X. laevis couvaingénéralement fixé dans un flacon de 2 ml en verre, mais un plus grand flacon en verre peut être utilisé.
  3. Laver les embryons dans le même flacon avec 1x PBS avec 0,1% de Tween (PBT), 3 min à température ambiante, deux fois.
    REMARQUE: Sauf indication contraire de la PBS est utilisé avec ou sans calcium et magnésium.
  4. Déshydrater les embryons dans 100% de methanol (MeOH) pendant au moins 12 heures à température ambiante dans le même flacon. Changez le MeOH 100% au moins deux fois sous le capot à l'aide d'une micropipette plastique.
    NOTE: Le MeOH jaunit légèrement en lipides dissous. Attention le MeOH est toxique par inhalation et doit être manipulé sous une hotte.
  5. Réhydrater les embryons en utilisant le même flacon à travers une série de bains à gradient de MeOH dans du MeOH à 75% dans du PBS, 50% de MeOH dans du PBS, 25% de MeOH dans du PBS, PBS deux fois, chaque bain de 5 à 10 min à température ambiante. Les solutions MeOH sont changés sous le capot à l'aide d'une micropipette plastique.
  6. En utilisant une pipette en plastique, transférer l'embryon à être disséqué dans un plat 60 mm de Pétri remplie à ras bord de PBT. L'utilisation de deux pinces fines soinssupprimer complètement les yeux en insérant une pince fine entre les yeux et le tube neural, au niveau de la tige optique. Détachez les yeux du tube neural. Introduire délicatement la pince ci-dessous l'ectoderme recouvrant le tube neural. Avec des soins, décoller l'ectoderme à partir de derrière la tête et le jeter.
  7. Effectuez une ISH double ou simple en utilisant digoxigénine ou des sondes marquées à la fluorescéine comme décrit précédemment 18,19.
  8. Après l'ISH transférer les embryons dans une nouvelle boîte de 60 mm de Pétri remplie vers le haut avec PBT aide d'une pipette en plastique.
  9. En utilisant des pinces fines soigneusement détacher du tube neural du reste de l'embryon. A ce stade, le tube neural antérieur sépare du tube neural postérieur. Détacher soigneusement parties restantes de l'ectoderme neural recouvrant le tube, la notochorde qui est fixée de façon lâche au-dessous du tube neural, les vésicules otiques et autres parties du mésoderme. Assurez-vous que le tube neural est dépourvue de tout annexesà ce stade.
    NOTE: Pour éviter d'endommager le tube neural effectuer tous les transferts / tube neural embryonnaire avec une pipette de transfert en plastique ou une micropipette si nécessaire avec une coupe de pointe à son extrémité. Le diamètre de l'extrémité de pointe est adaptée à la taille du tube neural.
  10. Transférer le tube neural disséqué (voir la note étape 1.9) dans un tube de 1,5 ml remplie avec 50% de glycérol dilué dans du PBS. Attendez jusqu'à ce que les tubes neuronaux sont tombés au fond de la solution de glycérol, habituellement O / N à 4 ° C.
  11. Retirer la solution de glycerol à 50% / PBS aide d'une micropipette P1000 et ajouter dans le même tube de 1,5 ml d'une solution de 90% de glycérol / PBS aide d'une micropipette P1000. Attendez jusqu'à ce que les tubes de neurones tombent au fond de la solution 90% de glycérol / PBS, habituellement O / N à 4 ° C.
    REMARQUE: pour le stockage à long terme, utiliser 90% de glycérol / PBS plus des antibiotiques pour prévenir le développement des bactéries.
  12. Transférer les tubes neuraux sur une plaque de verre ou une lame de microscope avec une pipette de transfert en plastique.
  13. Dissecte tubes neuronaux le long de la dorsale et ventrale médianes l'aide d'aiguilles de tungstène. Au cours de cette étape, les tubes neuraux sont conservés dans 90% de glycérol / PBS.
  14. Monter les deux côtés du tube neural dans 90% de glycérol / PBS en utilisant des anneaux de renforcement recouvertes d'une lamelle de verre.
  15. Fixer les lamelles avec vernis et de garder à 4 ° C.

2. Cap animaux explants induction en utilisant des billes de résine d'échange d'anions

  1. Transférer 100 pl de perles de résine échangeuse d'anions dans un tube de 2 ml en utilisant une micropipette P1000. Laver les billes au moins cinq fois de suite avec de l'eau distillée stérile. Permettre aux billes de sédiments au fond du tube et remplacer l'eau distillée stérile à l'aide d'une micropipette P1000. Ne touchez pas les perles.
  2. Laissez tremper les perles O / N dans un tube de 2 ml remplie avec de l'eau distillée stérile avec sérum albumine bovine (BSA) (10 mg / ml) à 4 ° C.
  3. Deux heures avant la collecte de l'AC, le lieu de la moitié des billes dans un nouveau 1,5 mltube à l'aide d'une micropipette P1000. Remplacer l'eau distillée stérile avec 500 ul de milieu contenant la molécule à tester pour sa capacité inductive, ou connus pour induire une destinée spécifique. Garder l'autre moitié des billes, car ils seront utilisés comme contrôle négatif.
  4. Incuber les perles à 4 ° C pendant au moins 2 heures.
  5. Effectuer toutes les étapes ultérieures sous la loupe binoculaire et effectuer tous les transferts AC avec une micropipette.
  6. Transfert blastula ou très jeunes embryons gastrula dans du PBS avec calcium et magnésium complété avec 0,2% de SAB en utilisant une pipette de transfert en plastique.
    REMARQUE: Les embryons en développement à 12 ° C portée blastula et gastrula étapes de 20 à 24 h.
  7. Retirer la membrane vitelline de l'embryon en utilisant une pince comme décrit précédemment 20. Fixer l'embryon avec une pince. Pincer la membrane vitelline à côté des autres pinces. Tenir la membrane, peler lentement hors de l'embryon. Effectuez cette procédure sur le ventrale (végétale) côté de l'embryon. Ne pas endommager le côté animal de l'embryon.
  8. Isoler petites AC comme décrit précédemment 21. Le pôle animal fait partie pigmentée de l'embryon. Utilisation des pinces fines découpées un petit carré de tissu sur le pôle animal. Le tissu AC ne contient que les cellules ectodermiques. Assurez-vous que le tissu a une épaisseur uniforme. Sinon, retirez le secteur de l'analyse.
  9. Placez chaque secteur dans un Terasaki plaques à puits multiples à 0.5x modifiés Saline (MBS) de Barth 4. Placez l'AC dans le puits avec son côté animal pigmenté vers le bas, en contact avec le fond rond du puits.
    REMARQUE: pipettes de revêtement avec une solution de BSA à 0,1% empêche l'adhérence de petits morceaux de tissu adhésif à la matière plastique.
  10. Placer une bille sur chaque capuchon à l'aide d'une micropipette P20. Si nécessaire, utilisez une pince pour placer soigneusement le talon dans le centre de la calotte.
    REMARQUE: Lorsque trempé dans un milieu conditionné, les perles sont colorées en rose. Sélectionnez les la plupart des colored perles.
  11. Incubation à température ambiante (18 à 22 ° C) pendant 6 heures sans bouger la plaque multi-puits Terasaki. La perle colle à la AC en moins de 2 heures.
  12. Placer la plaque à puits multiples Terasaki sur le dessus de papiers trempés dans l'eau. Recouvrir la plaque avec un récipient en plastique.
    NOTE: Cette «chambre d'humidité 'empêche l'évaporation prématurée des puits.
  13. Culture l'AEC 0,5x MBS ou 3/4 NAM (voir l'étape 4.1) dans la chambre d'humidité à 15-20 ° C jusqu'à ce que les embryons frères et sœurs ont atteint le stade approprié pour tester l'effet de votre facteur.
  14. Fixer le CA pendant 1 h à 4% fraîchement préparé PFA. Déshydrater le CA dans 100% de MeOH comme décrit précédemment (étape 1.4).

3. Cap dissociation des cellules animales et réagrégation avant la greffe dans un Xenopus laevis Neurula

  1. Manteau de plats de Petri (60 mm) ou 12 puits des plaques avec 3% d'agarose dans de l'eau stérile ou dans du PBS sans calcium et magnésium. Ajouter suffisamment d'agarose pour couvrir le bOttom de la boîte de Pétri ou le bien. Préchauffer les plaques à température ambiante (18-22 ° C). En option, les plaques stockées pour deux jours à 4 ° C pour éviter la déshydratation.
  2. Préparer sans calcium la saline de Holtfreter (60 mM de NaCl, KCl 0,7, 4,6 mM HEPES, 0,1% de BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) et une solution saline de Holtfreter (60 mM de NaCl, KCl 0,7 mM, CaCl 0,9 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% de BSA, pH 7,6) 5. REMARQUE: la solution de CaCl 2 ne peut pas être stérilisé à l'autoclave.
  3. Remplissez le agarose revêtu ainsi vers le haut avec une solution saline de calcium sans Holtfreter.
  4. Préparez blastula ou très jeunes embryons gastrula pour isoler leurs AC tel que décrit précédemment (étapes 2.5 à 2.7).
  5. Isolez au moins 15 ou jusqu'à 30, petite AC 21. Utilisation des pinces fines découpées un petit carré de tissu sur le pôle animal. Le tissu AC ne contient que des cellules ectodermiques et est donc d'une épaisseur uniforme. Sinon, retirez le secteur de l'analyse.
    NOTE: Le pôle animal est le Embrypartie pigmentée de o.
  6. Transférer les CA dans un agarose revêtu bien rempli vers le haut avec une solution saline sans calcium de Holtfreter. Placez le CA avec leur côté pigmentée vers le haut.
    Remarque: Le processus de dissociation commence rapidement sans calcium saline de Holtfreter.
  7. Attendez quelques minutes pour que les cellules commencent à se dissocier. Observez ce grâce à la désagrégation des tissus. En utilisant des pinces fines, séparer la couche pigmentée du reste de l'AC et de les jeter avec un P20 micropipette. Complete processus de dissociation cellulaire indique la séparation des cellules les unes des autres.
    REMARQUE: Une ou deux couches pigmentées peuvent être laissés à l'expiant de ré-agrégées pour aider à la visualisation lors du greffage.
  8. Centrer les cellules en utilisant des mouvements circulaires de la plaque. Avec une micropipette P1000 enlevez soigneusement autant moyen que possible. Veillez à ne pas toucher les cellules.
  9. Ajouter 1 ml de solution saline de calcium avec Holtfreter au puits. Transférer les CA dissociéesdans un tube de 1,5 ml.
    Note: 2 ml tubes ne peuvent pas être utilisés en raison de leur fond rond.
  10. Pellet les cellules par centrifugation, 5 min à une vitesse maximale de 2000 tours par minute pendant une centrifugeuse de paillasse (500 xg). Retirer soigneusement le surnageant avec une micropipette P1000.
  11. Ajouter aux cellules dissociées 20 ul d'une solution saline de Holtfreter avec calcium (60 mM de NaCl, KCl 0,7 mM, 0,9 mM de CaCl2, 4,6 mM de HEPES, 0,1% de BSA (Sigma A-7888 pH 7,6) 5.
  12. Gardez les CA dissocié, 3 à 6 heures à température ambiante (18-22 ° C).
    NOTE: Ceci est temps nécessaire pour que les cellules réagréger. La ré-agrégation est visible que les cellules forment une petite boule en bas du tube.
  13. Détachez l'expiant attentivement du fond du tube en ajoutant 1 ml de 0,5x MBS ou de 1 ml de 3/4 NAM (voir l'étape 4.1). Transférer l'expiant dans une plaque non-revêtu en utilisant une pipette de transfert en plastique.
  14. Stade, les explants utilisant leurs frères et sœurs de contrôle. Pour l'utilisation des antibiotiques culture à long terme: kanamycin (50 ug / ml), de l'ampicilline (50 ug / ml) et de gentamycine (50 ug / ml).

4. Intensification des animaux Caps explants dans la plaque neurale de X. laevis embryon

  1. Préparation 4.3 NAM (110 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO 3) 2, 1 mM de MgSO 4, 0,1 mM d'EDTA, 1 mM de NaHCO 3, 0,2 x PBS, 50 pg / ml de gentamycine). Ne pas garder pour plus de 1 semaine pour la dissection et conserver à 4 ° C. NAM plus ancien peut être utilisé pour la préparation de plats de dissection agarose revêtues (ci-dessous).
  2. Manteau plats de Petri (60 mm) avec 3% d'agarose en 3/4 NAM dans laquelle de petits trous ont été réalisés en utilisant soit un moule en silicone, ou le couvercle d'une raquette de tennis de table.
    NOTE: L'agarose recouvre le fond de la boîte de Pétri. Laissez un espace de sorte que la boîte de Pétri à remplir avec 3/4 NAM. Alternativement faire des plats de dissection avec des non-séchage pâte à modeler. Dans l'argile, serrer les embryons légèrement au cours de la procédure de dissection. Creuser de petits trous dans laagarose en utilisant une pince arrondis Ce «plat de dissection» contribue à maintenir les embryons pendant la procédure de dissection.
  3. Recueillir des outils de dissection: pipettes de transfert en plastique, un «couteau de sourcil» (faite avec des cheveux de sourcil inclus dans la paraffine à la pointe d'une pipette Pasteur en verre) 22, deux pinces à dissection fines, P1000 micropipette et des conseils, un stereosmicroscope avec un grossissement 8-40X, une source de lumière avec des guides de fibre optique. Gardez tous les outils de dissection propre; après chaque expérience, les rincer deux fois avec de l'eau distillée, une fois avec 100% d'éthanol et laisser sécher. Stocker à l'écart de la poussière et si nécessaire autoclave les outils de dissection de métal.
  4. Laissez le dissociée et ré-agrégées ACS (protocole 3), et leurs frères et sœurs X. laevis embryons se développent jusqu'à ce qu'ils atteignent l'étape 13 (neurula) selon Nieuwkoop et Faber tableau de développement 17. Pour la transplantation de neurones dans le stade de la plaque 13 à l'étape 15 embryons sont utilisés.
  5. Effectuer tousétapes ultérieures sous la loupe binoculaire.
  6. En utilisant une pipette de transfert en plastique, le transfert des embryons dans du PBS avec calcium et magnésium complété avec 0,2% de BSA. Retirer la membrane vitelline de l'embryon comme décrit précédemment 20. Fixer l'embryon avec une pince. Pincer la membrane vitelline à côté des autres pinces. Tenir la membrane fermement, peler lentement hors de l'embryon.
    REMARQUE: Effectuez cette procédure sur le (végétale) face ventrale de l'embryon. Ne pas endommager les embryons plaque neurale. Si les embryons ont été endommagés lors de l'étape d'enlèvement de membrane vitelline, transférer les embryons dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant 3/4 NAM en utilisant une pipette de transfert en plastique et attendre 15 minutes, un temps suffisant pour le processus de guérison de se produire.
  7. Remplissez le plat de dissection vers le haut avec des produits frais 3/4 NAM.
  8. En utilisant une pipette de transfert en plastique, transférer les embryons sans leur membrane vitelline dans le plat de dissection. Placez les embryons côté dorsale vers le haut dansles puits. Pendant le processus de transfert ne permet pas l'embryon d'entrer en contact avec l'interface air-liquide depuis X. laevis sont lysées par tension superficielle.
  9. Transférer l'expiant AC à greffer dans la plaque de dissection à l'aide d'une pipette de transfert en plastique ou une micropipette P1000. Une fois que la pipette est à l'intérieur du liquide, les explants permettre à couler lentement vers le bas par gravité, ou poussent très doucement.
  10. Maintenir les embryons avec des pinces arrondis. Avec le couteau de sourcil faire une incision dans la plaque neurale, où vous avez l'intention de greffer le morceau de votre explantation.
    REMARQUE: À l'étape 14 la flexion antérieure de la plaque neurale peut être utilisé comme un point de repère, il marque le territoire de diencéphale (figure 4).
  11. Découpez un petit morceau de neuroépithélium, en utilisant des pinces et un couteau arrondis de sourcil. Coupez un petit morceau de l'expiant avec le couteau de sourcil.
    NOTE: La pièce d'explantation devrait être d'environ la même taille et la forme que la zone d'ablation neuroépithélium. Placez le morceau de explantation dans l'incision de neuroépithélium utilisant le couteau de sourcil et pinces fines. Assurez-vous que l'explant se fixe rapidement à l'embryon.
  12. Sinon placez un morceau de lamelle de verre sur l'embryon greffé à maintenir la greffe en place. Pour ce faire, couper une lamelle de verre fin en très petits morceaux à l'aide de forceps grossières. Assurez-vous que la taille est d'environ 1,5 mm 2. Plongez les morceaux dans une boîte de Pétri contenant 3/4 NAM ou PBS en utilisant une pince. Choisissez un morceau de verre plus grand que l'embryon d'éviter de l'endommager. L'embryon sera un peu aplatie.
  13. Attendez au moins 30 minutes sans bouger, ou seulement déplacer délicatement la plaque de dissection. Laissez l'embryon récupérer pendant 30 min à 2 h et retirez délicatement la lamelle si nécessaire. Pipetter prudemment les embryons greffés dans un plat propre rempli de 3/4 NAM, l'aide de la pipette de transfert en plastique.
    NOTE: greffé embryons ont tendance à développer des bactéries ou des champignons de la contamination. Pour long terme culture utiliser des antibiotiques: la kanamycine (50 ug / ml), de l'ampicilline (50 ug / ml) et de gentamycine (50 ug / ml).

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Representative Results

Sur la base de considérations morphologiques chez différentes espèces, les manipulations embryonnaires, et le profil d'expression des gènes régulateurs, un modèle conceptuel qui tient la plaque neurale est divisé en segments longitudinaux et transversaux qui définissent une grille de développement histogène générer des champs distincts. Dans la plaque neurale, les ébauches du cerveau antérieur, le mésencéphale, le cerveau postérieur et la moelle épinière sont tous déjà établie le long de l'axe antéro-postérieur (AP) pendant la gastrulation (revue dans 23-25). Au cours de la neurulation, les champs histogène peuvent être détectés comme des domaines dans l'espace restreint de l'expression génique. Sur la base des profils d'expression des gènes de régulation, le primordium de cerveau antérieur est divisé en six segments transversaux qui génèrent des champs histogène distinctes appelées prosomeres (p). Chaque prosomere est divisé en une ventrale (de base) et une partie (de alaire) dorsale (Évalué à 26,27). Dans les amphibiens, la prosomere 2(p2) donnent lieu à l'épithalamus et le thalamus et de l'organisateur du ona Z L I imitans ntrathalamica (ZLI) 8 (revue dans 28,29).

Sur la figure 1 sont présentés la-montage à plat de X. laevis et X. tropicalis antérieure tubes neuronaux à des étapes 30, 32, et 35 après WM-plat. WM-ISH ont été effectués conformément au protocole 1 en utilisant des sondes pour les facteurs de transcription fezf2 qui marque le télencéphale et p3, barhl2 qui marque p2, les ourlets corticales et le mésencéphale, iroquois-1 (irx1) et Iroquois-3 (irx3) qui, respectivement marque caudale p2 et p2 alaires et pour la chut de morphogène qui marque la ZLI, le cerveau antérieur basal et le mésencéphale (figure 1E). Une analyse comparative des différents profils d'expression de gènes révèle que la limite antérieure de barhl2 p2 expression bute contre la limite caudale d'expression fezf2 en p3 (figure 1A). Irx3 est co-exprimé avec shh à l'avenir ZLI (figure 1B). A l'intérieur p2 domaine d'expression de irx1 est complémentaire de celle de shh (figure 1C) 8. Le profil d'expression de barhl2 dans X. tropicalis au stade 35 est représenté en figure 1D. Un schéma des territoires d'expression de ces gènes dans le cerveau antérieur des amphibiens de développement est fourni à la figure 1E.

Utilisation du protocole 2 de la capacité des billes de résine échangeuses d'anions trempés dans Chut chut pour induire l'expression a été étudiée dans des explants AEC. X. laevis embryons ont été injectés dans les blastomères 4 animales au niveau des cellules de 8 et 4 étages avec ARNm codant pour la antérieure neuroépithéliale inducteur caboche avec barhl2, oTX2, irx3 et GFP comme traceur d'injection. L'expression du facteur anti-BMP noggine inhibe la voie BMP et donne une identité à des cellules neurales AC 3. Nous nous référons à AC exprimant caboche que Anteriorised Cap animale (AAC). Blastocoel explants de toit ont été préparés comme décrit dans le protocole 2. Les PAC ont été cultivées pendant 48 heures à 18 ° C en contact avec une perle de résine échangeuse d'anions imprégné d'un milieu conditionné (CM) contenant, ou non, la partie N-terminale sécrétée de Sonic le hérisson morphogène de rat (N-Shh). L'expression de Shh endogène a été analysé par ISH (figure 2). Expression de Xenopus chut (Xshh) est détectée dans les cellules en contact avec le bourrelet trempé dans CM avec la N-Shh, mais pas dans les cellules en contact avec le bourrelet trempé dans CM sans N-Shh (figure 2B).

Utilisation du protocole 3 la capacité de différents types de cellules pour séparer les uns des anotha été étudiée er. X. laevis embryons ont été injectés dans les blastomères 4 animales au niveau des cellules 8-4 et le stade avec des ARNm codant pour la caboche avec ou sans otx2, barhl2 et irx3, comme indiqué, en utilisant ßGal Gfp ou comme traceurs (figure 3A). Scène 8/9 AC ont été dissociées et ré-agrégées pour générer des explants composées de cellules neuroépithéliales mixtes contenant à la fois ßGal- et les cellules exprimant la GFP. Les explants refusionnés ont été cultivées pendant 48 heures à 18 ° C. ßGal activité a été révélée en rouge selon l'une 30 (figure 3A). Le comportement des cellules a été observé par suite de leur localisation au sein des explants de ré-agréger. Dans explants où les cellules AACS sont mélangés avec AACS cellules exprimant Otx2 (rouge), les cellules exprimant ßGal ne se séparent pas des cellules exprimant la GFP deux types de cellules entremêlées librement (Figure 3b, 3c). En revanche, dansexplants où les cellules (GFP) Otx2 exprimant sont mélangés avec Barhl2, Otx2, irx3 (BOI3) des cellules exprimant (ßGal), les cellules ßGal exprimant (rouge) forment des taches cohésives et ne se propagent pas de manière uniforme au sein de l'explant de ré-agrégées ( Figure 3D, 3E).

Utiliser le protocole 4, le comportement des cellules ca programmé a été étudiée in vivo. X. laevis embryons ont été injectés dans les blastomères 4 animaux aux étapes 4 et 8 avec des cellules ARNm codant pour la noggine avec otx2 soit seul, soit ensemble avec barhl2 et irx3. ßGal a été utilisée comme traceur. En parallèle, les embryons ont été injectés avec similaire ARNm codant pour la caboche et la partie sécrétée N-terminale de la chut de morphogène de rat (N-chut). A l'étape 8/9, explants AC ont été dissociées et immédiatement ré-agrégées pour générer des explants mixte composée de neuroepitHELIAL cellules exprimant soit N-Shh et Otx2, ou d'exprimer N-Shh et Otx2, Barhl2 et irx3 (BOI3). De petits morceaux de les explants mixtes ont été greffées dans la plaque neurale de X. laevis embryons au stade 14. Les cellules greffées ont été marqués avec ßGal coloration (rouge). Au stade 35 l'expression de Shh endogène a été analysée par ISH. Lorsque greffé dans la plaque neurale antérieure de X. laevis embryons, explants mixte composée de BOI3 et N-Shh cellules exprimant développé deux caractéristiques spécifiques des cellules ZLI: les cellules greffées ont exprimé Xshh et isolés à partir de cellules neuroépithéliales antérieures (figure 3C). En revanche, lorsque des explants mixte composée de Otx2 - et N-Shh- cellules exprimant sont greffés dans le X. laevis plaque neurale, les cellules greffées ne exprimaient chut et ne se séparent de leurs voisins (figure 3B) 8.


Figure 1. plats monté tubes neuronaux de X. laevis et X. tropicalis embryons entiers de montage à double ISH (A - D). WM-ISH est effectuée à l'aide fezf2, barhl2, irx1, irx3, et chut comme sondes sur (A - C) X. laevis embryons à des stades 30, 32, et 35 et (D) X. tropicalis embryon au stade 35 comme indiqué. Les tubes de neurones d'embryons représentatifs sont disséqués et plat montés comme décrit dans le protocole 1. Les tubes neuronaux disséqués sont présentés à partir d'une vue de côté, jusqu'à dorsale, antérieure gauche. Les marqueurs et les étapes sont indiquées. Les limites rostrale et caudale de p2 sont indiqués par des flèches. (AC) La barre d'échelle représente 0,5 mm. (D) Les sbar cale signifie 0,1 mm. . (E) Schéma de marqueurs du cerveau antérieur à ST.30 barhl2 domaine d'expression est indiqué dans les lignes hachurées; Domaines d'expression sont indiqués pour fezf2 (rose), chut (rouge), irx3 (jaune) et irx1 (vert). p signifie prosomere. La glande pinéale située sur le dessus de p2 est montré. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. induction de l'expression de Shh dans des explants programmées par contact avec des billes de résine échangeuse d'anions. Petites AC sont préparés à partir d'embryons injectés avec l'ARNm codant pour la caboche, barhl2, otx2 et irx3, avec la GFP comme traceur. AAC se fou Anteriorised Cap animale. Les explants AAC exprimant Barhl2, Otx2 et irx3 (AAC BOI3) sont cultivées pendant 48 heures en contact avec une bille trempée dans un milieu conditionné (CM) contenant soit N-Shh, ou non, comme indiqué. Les explants sont analysés par ISH pour l'expression de Xenopus (X) chut. La barre d'échelle représente 0,5 mm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Analyse du comportement de la ségrégation des cellules dans des explants de ré-agrégées. (A)   Embryons X. laevis sont injectés avec l'ARNm codant pour la caboche, otx2, barhl2 et irx3 comme indiqué. ßGal et la GFP sont utilisées comme traceur. A l'étape 8/9 petites AC sont préparés , Dissocié et ré-agrégées pour générer des explants en / ßGal types de cellules mixtes GFP. Les explants sont mis en culture pendant 48 heures à 18 ° C et l'activité est révélée ßGal (rouge). (B - E) explants représentatifs composés de cellules exprimant des protéines mixtes comme indiqué sont représentés. AAC signifie Anteriorised Cap animale. (B, C) ​​des cellules exprimant ACs Noggin et Otx2 (ßGal) répartis au hasard lorsqu'il est mélangé avec Noggin cellules exprimant ACs (GFP). (C) de la vue agrandie de (B). Cellules (D) AACS exprimant Barhl2, Otx2 et irx3 (BOI3) (ßGal) regroupés et isolés à partir de cellules exprimant Otx2 AACS (GFP). (E) de la vue agrandie de (D). (B, D) La barre d'échelle représente 0,5 mm. (C, E) La barre d'échelle représente 0,2 mm.g "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. programmée explants présentent leurs caractéristiques de développement lorsqu'ils sont greffés dans la plaque neurale d'une étape 14 embryon (A) dispositif expérimental:. PAC sont préparés à partir d'embryons injectés avec des ARNm comme indiqué. A l'étape 8/9 cellules du toit de la blastocoel sont dissociés et ré-agrégées pour générer des explants en types de cellules mixtes exprimant ßGal (rouge). Les explants sont cultivés jusqu'à leurs frères et sœurs ont atteint l'étape 14. Un petit morceau de expiant mixte (rectangle vert) est mis dans une incision au sein de la plaque neurale antérieure. Embryons exploités sont cultivés jusqu'au stade 35. embryons exploités sont analysés par WM-ISH utilisant X. laevis chut (Xshh) comme sonde. ßGal activité est révélé dans acc rougeording à 30. (B, C) ​​Les côtés greffés de l'étape 35 tubes neuronaux représentatifs sont présentés, vue de côté, jusqu'à dorsale, antérieure gauche. (B) greffé avec PAC mixtes exprimant Otx2 et N-Shh. (C) greffé avec PAC mixtes exprimant Barhl2, Otx2, irx3 (BOI3) et N-Shh. Cellules greffées sont indiqués par une étoile rouge. L'étoile rose indique le diencéphale prospective. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le développement neuronal est orchestré par une interaction complexe entre les programmes de développement et les signaux cellulaires des tissus environnants (Avis à 3,31,32). Nous décrivons ici un ensemble de protocoles qui peut être utilisé dans X. laevis embryons à explorer facteurs extrinsèques et intrinsèques impliquées dans la détermination du destin de neurones et de la morphogenèse neuronale in vitro et in vivo. Ces protocoles peuvent être utilisés tels quels sur X. embryons tropicalis, cependant X. embryons tropicalis sont quatre fois plus petite que X. laevis embryons. Tant les forceps et les aiguilles de tungstène utilisées besoin d'être plus fine. Lorsque cela est possible, utilisez X. laevis.

La visualisation précise de X. laevis et X. histogène champs neuronaux tropicalis peuvent être obtenus en utilisant le montage à plat histologique de tubes neuronaux disséqués de WM ISH. Cette technique a été réalisée avec succès sur X. laevis embryons de l'étape 26 àétape 45 (figure 1) et sur ​​X. tropicalis embryons de l'étape 30 à l'étape 45 de 8,33. Embryons âgés sont plus faciles à décortiquer puis plus jeunes embryons. Cette technique est facile à réaliser. Il permet l'analyse des profils d'expression génique, séparément ou combinés, sur les tubes de neurones à différents stades de développement. Avec ce protocole, il est facile de comparer un côté d'un tube neural avec l'autre. Ceci est très utile dans des expériences de Xenopus et LOF GOF. Les défauts observés sur le côté injecté du tube neural peuvent être comparées directement à des événements normaux de développement observés sur le côté de contrôle. Cette stratégie a été utilisée pour analyser GOF et LOF phénotypes dans X. laevis embryons 8,33. Une étape importante dans ce protocole est la fixation correcte des tissus embryonnaires. Une fixation incomplète empêche le détachement efficace de l'ectoderme du tube neural. Le pré-dissection du tube neural facilite la pénétration dans les sitsondes u. Cependant, une fois isolé, il est facile de perdre les tubes neuronaux. Il est conseillé de conserver une partie de l'embryon au cours de la procédure de l'ISH pour éviter toute perte.

Les embryons utilisés pour toutes ces expériences doivent être robustes et ont besoin de bien guérir. Jeter tout lot d'embryons malsaines. Afin de disséquer AC et explants greffés entre l'étape 13 et l'étape 15, il est possible de cultiver X. laevis explants d'embryons et à différentes températures (de 12 à 18 ° C et 18-20 ° C). Il convient de noter X. laevis cellules embryonnaires contiennent assez jaune pour permettre leur survie pendant plusieurs jours sans addition de tout élément nutritif externe. Pour ne pas endommager les tissus embryonnaires, toute procédure de transfert de l'embryon, AC, ou explant doit être fait avec soin. Il est conseillé d'utiliser une pipette de transfert en plastique ou micropipette si nécessaire avec une coupe de pointe à son extrémité. Le diamètre de l'extrémité de pointe est adaptée à la taille de l'embryon, ou la taille de l'expiant, à transférer.Il est digne de remarque, pipettes de revêtement avec une solution de BSA à 0,1% empêche l'adhésion des petits morceaux de tissu pour le plastique.

Explants AC peuvent être programmés par l'expression forcée de gène, ou par exposition à des facteurs extrinsèques d'une manière contrôlée du temps et de l'espace. Nous décrivons une technique permettant l'induction locale par contact direct entre une explantation et une perle. Si nécessaire, les billes peuvent être fragmentés en utilisant en outre une pince. Comparé à d'autres stratégies décrites précédemment, cette technique permet de tester l'induction locale de facteurs purs, seuls ou en combinaison, dans une fenêtre de temps précise.

En utilisant une approche décrite précédemment de dissociation cellulaire et ré-association 34, il est possible d'étudier les capacités de la motilité cellulaire, les comportements de ségrégation cellulaire, et la formation des frontières du compartiment en sandwich et AC mixte explants 8. Le processus de dissociation cellulaire commence en moins de 15 min. Évitez shaking la plaque pendant l'étape de dissociation pour empêcher la perte de cellules. Les couches pigmentées AC ne se dissocient pas bien. Il est recommandé de les supprimer lors de l'étape de dissociation. Un couple de couches pigmentées AC sont laissés dans l'expiant de ré-agrégées. Il aide à la visualisation de la greffe. Il ne gêne pas l'analyse à des stades de développement ultérieurs.

Dans ce manuscrit un protocole de transplanter explants mixtes dans une plaque neurale est détaillée. Dans les embryons de xénope, la plaque neurale est ouvert entre la scène et le stade 13 15. Ces étapes sont donc approprié pour la transplantation dans le neuroépithélium. X. laevis tissus propriétés adhésives changent avec le temps. Il est important de greffer explants AC dans un hôte à un stade de développement similaire. Au premiers stades de développement, X. laevis embryons cultivés dans 3/4 NAM réparation extrêmement rapide. Si certains embryons ont été endommagés lors de l'enlèvement de la membrane vitelline, il peut être utile d'attendre 15 min,qui est le temps nécessaire pour le processus de guérison de se produire. L'insertion peut être favorisée en mettant un morceau de lamelle de verre sur le tissu de l'hôte greffé, mais il constitue pas une exigence. La force générée par le processus de guérison peut extruder les cellules greffées. La morphologie de l'embryon hôte est mieux conservée lorsque la greffe est forcé dans ce avec une pression externe, comme avec une lamelle couvre-objet. Pour évaluer le succès de la greffe, un traceur fluorescent peut être injecté dans les explants. La présence de cellules fluorescentes à l'intérieur de l'embryon greffé peut être visualisée jusqu'à ce que le tube neural se ferme. L'inconvénient majeur de la culture et de greffage AC expériences est la fréquence de bactéries ou de champignons de la contamination. Utiliser des solutions matérielles et stériles propres ou stériles aussi souvent que possible pour éviter la contamination de plat à chaque étape du protocole. Pendant longtemps, la culture terme d'embryons greffés toujours utiliser des antibiotiques et une température de 15 ° C. Éviter le contact à long terme des explants AC ou d'embryons avec agarose. Nous OBSERVed qu'elle peut diminuer la durée de vie de l'expiant. La technique de greffage est puissant mais beaucoup de temps. Il est déconseillé pour dépister les indices de la détermination du destin avec elle, mais d'acquérir suffisamment d'informations sur votre tissu de choix à l'avance.

Outre ses avantages traditionnels, les avancées génétiques récentes dans Xenopus ont ouvert la voie à cette système modèle pour explorer les réseaux de régulation des gènes en utilisant une analyse génomique à grande échelle par séquençage de l'ARN profonde et Chromatide Immunoprécipitation-séquençage (ChIP-seq) 5,35. Il existe d'excellents RNAseq et des ensembles de données de référence Chip-Seq couvrant le développement embryonnaire précoce. Un des inconvénients de l'analyse ChIP-seq est la nécessité de recueillir grande quantité de matériel. Programmation des explants AC permet la production d'une grande quantité d'un tissu neural spécifique, et au moins en partie, permet de surmonter cette limite technique.

Les programmes de développement sous-jacent organes du tube neuralogenesis sont largement conservées, en particulier chez les vertébrés. Les informations recueillies à l'aide d'amphibiens aide à la compréhension des processus cellulaires et moléculaires qui sous-tendent le développement des vertébrés 25,32,36-38. Les progrès récents dans le domaine des cellules souches pluripotentes induites (CISP) a ouvert des passerelles pour la recherche en médecine régénérative et la découverte de médicaments. CSPi sont programmés à partir de cellules somatiques en utilisant une combinaison de facteurs de transcription. La recherche de la programmation des repères pour les cellules souches est en cours. Les analyses décrivent ici de fournir un moyen de générer des types de cellules neurales dérivées in vitro qui pourraient être utilisés dans le dépistage de la drogue. Ils fournissent également un moyen pas cher et rapide pour tester les déterminants du devenir de neurones qui peuvent être utilisés pour une reprogrammation des CSPi 39,40.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde VWR  20909.290 Toxic
anion exchange resin beads Biorad 140- 1231
Bovine Serum Albumin  SIGMA A-7888 For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine  GIBCO 15751-045  antibiotic
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906  for bead preparation

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Developmental Biology Numéro 108 biologie du développement, Embryon de neurones la greffe la ségrégation compartiment Sonic Hedgehog cerveau antérieur tige iPSC
Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonnaires explants à étudier les caractéristiques du développement précoce Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em
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Durand, B. C. Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (108), e53474, doi:10.3791/53474 (2016).

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